分子生物学第9章解析
现代分子生物学-第九章
图9-8 细胞中原癌基因转变为癌基因的主要途径
1.点突变
研究发现，ras基因编码了一个分子量为 2.1×104癌蛋白（p21），从人类膀胱癌细胞 系T24 DNA中克隆的Ha-ras基因能够诱发 NlH/3T3细胞转化，而从正常细胞DNA中克 隆的该原癌基因没有这种功能。
人类肺癌细胞系Hs242的转化基因与Ha-ras高 度相似，在这个基因中导致转化活性的遗传损 伤是第二个外显子中引起p21蛋白第61位谷氨 酰胺被亮氨酸所替代的一个点突变，进而引起 蛋白质构象的改变，使细胞获得转化活性。
p53基因，Guardian of the genome
1990年，科学家首次发现p53是一个肿瘤抑 制 基 因 。 缺 失 该 基 因 时 ， 患 Li-Fraumeni Syndrome 。 此 外 ， 病 人 极 易 患 乳 腺 癌 ， 脑 癌和白血病。
p53基因在星形细胞癌、乳癌、肺癌、肠癌及 骨肉瘤中都有高频率缺失现象。从癌细胞中得 到的p53基因，其保守序列区有单一位点的突 变，推测可能由于这一突变导致p53基因产物 结构与功能的改变，失去抑癌活性。
使细胞受阻于Ｇ１阶段直到ＤＮＡ被修复或 启动细胞凋亡程序； c.如果细胞中p53基因的两个拷贝同时被破 坏，细胞可能死于有丝分裂过程中，也 可能带着损伤继续分裂，导致恶性肿瘤．
细胞在DNA修 复后继续分裂
DNA损伤
P53含量升高， G1停滞
(a)
(b)
或者发生
细胞凋亡
DNA损伤
带有DNA损伤的细 胞分裂，细胞的倍 性发生变化
因结构与表达模式的改变。
癌基因（oncogene）：促进细胞增生，这类 基因往往常发生功能 突变。
抑癌细胞（tumor suppressor gene, TSGs）: 抑制细胞生长。抑癌 基因的活性下降（功 能缺失突变）是引起 癌变的另一个原因。
分子生物学课件 第9章 原核生物基因调控
结合araI时，araI作为正控制的元件，促进araBAD 基 因的表达 。
34
9.7 翻译水平的调控
9.7.1反义RNA的调控
聂理
35
反义RNA
反义RNA有多种符号 = antisense RNA = -RNA = stRNA(small temporal RNA) = micRNA（ mRNA-interfering complementary RNA） 即 干扰和抑制mRNA翻译的互补RNA片段
为诱导物开启lac操纵子结构基因……。
17
9.4.2乳糖操纵子正控制机理
CRP：cyclic AMP receptor protein， =“cAMP受体蛋白”， =“降解物基因活化蛋白（CAP）” ①当环境中有葡糖时： 抑制cAMP 产生，纯CAP是失活态蛋白。 ②当环境中无葡糖时： 有利于 cAMP 产生和cAMP-CAP形成。
22
9.5.2 衰减子
衰减子也叫弱化子
attenuator
聂理
23
9.5.2.1衰减子组成
trp操纵子前导区L，转录出RNA前导序列161nt。
1~26nt翻译的 SD序列区
27~71nt含14个氨基酸 密码的前导肽区
115~159nt衰减子区
具有终止子 结构特征
24
9.5.2.2衰减子调控机制
41
9.7.3 核开关 riboswitch
核开关也叫核糖开关。 是mRNA所形成的调节基因表达的结构。 在mRNA的非翻译区（5’-UTR,3’-UTR）， 与小分子效应物可逆结合而改变其结构， 根据构象特征信号来影响mRNA的表达， （如影响转录、翻译等） 从而达到调控基因开关的目的。
医学分子生物学各章节名词解释复习重点
绪论基因（gene）：是合成有功能的蛋白质或RNA所必需的全部DNA，包括编码蛋白质或RNA 的核酸序列及为保证转录所必需的调控序列。
断裂基因（splite gene）真核生物结构基因，由若干个编码区和非编码区互相间隔开但又连续镶嵌而成，去除非编码区再连接后，可翻译出由连续氨基酸组成的完整蛋白质，这些基因称为断裂基因基因组（genome）：是指一个物种的单倍体的染色体所携带的全部遗传信息。
C值（C value）：一种生物体单倍体基因组的DNA含量总是恒定的，它通常称为该物种DNA 的C值。
C值矛盾：生物体的进化程度与基因组大小之间不完全成比例的现象（又称：C值悖论，C value paradox ）必需基因：指关系到生物体存活的基因，可通过基因突变的方法确定致死位点的数量，以得知基因组必需基因的数量重叠基因（overlapping gene）是指两个或两个以上的基因共有一段DNA序列，或是指一段DNA序列成为两个或两个以上基因的组成部分。
类核（nucleoid）：是指原核生物基因组通常由一条环状的双链DNA分子组成，在细胞中与蛋白质结合成染色体的形式，在细胞内形成一个致密的区域。
转座子：能在基因组中从一个位点移至另一位点的DNA序列称为转座因子（transposable element），又称为可转座元件插入序列(insertion sequence，IS) ：2 000bp以内，两端正向重复序列（direct repeats，DR）、反向重复序列（inverted repeats，IR），中间1kb左右的编码序列，仅编码和转座有关的转座酶。
复合型转座子( composite transposon) ：2 000～20 000bp之间，两端由一对IS元件组成，带有与转座作用有关的基因和其他基因。
质粒（plasmid）：是指一类染色体外具有自主复制能力的环状双链DNA分子，属染色体外基因组。
质粒的不相容性：两种不同的质粒因利用同一复制和维持机制，在复制和随后向子代细胞分配的过程中会发生竞争，从而不能在同一宿主细胞内稳定存在，其中一种质粒将被丢失的现象。
分子生物学复习7-9
第七章基因的表达与调控（上）——原核基因表达调控模式（一）基本概念1．基因表达：细胞在生命过程中，把蕴藏在DNA中的遗传信息经过转录和翻译，转变成为蛋白质或功能RNA分子的过程称为基因表达。
2．基因表达调控：围绕基因表达过程中发生的各种各样的调节方式都统称为基因表达调控。
rRNA或tRNA的基因经转录和转录后加工产生成熟的rRNA或tRNA,也是rRNA或tRNA 的基因表达，因为rRNA或tRNA就具有在蛋白质翻译方面的功能。
3．组成型表达：指不大受环境变动而变化的一类基因表达。
如ＤＮＡ聚合酶，ＲＮＡ聚合酶等代谢过程中十分必需的酶或蛋白质的表达。
管家基因：某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因。
管家基因无论表达水平高低，较少受到环境因素的影响。
在基因表达研究中，常作为对照基因适应型表达：指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。
应环境条件变化基因表达水平增高或从无到有的现象称为诱导，这类基因被称为可诱导的基因；相反，随环境条件变化而基因表达水平降低或变为不表达的现象称为阻遏，相应的基因被称为可阻遏的基因。
4．结构基因：编码蛋白质或功能性RNA的任何基因。
所编码的蛋白质主要是组成细胞和组织基本成分的结构蛋白、具有催化活性的酶和调节蛋白等。
原核生物的结构基因一般成簇排列，真核生物独立存在。
结构基因簇由单一启动子共同调控。
调节基因：参与其他基因表达调控的RNA或蛋白质的编码基因。
①调节基因编码的调节物质通过与DNA上的特定位点结合控制转录是调控的关键。
②调节物与DNA特定位点的相互作用能以正调控的方式（启动或增强基因表达活性调节靶基因，也能以负调控的方式（关闭或降低基因表达活性）调节靶基因。
操纵子：由操纵基因以及相邻的若干结构基因所组成的功能单位，其中结构基因的转录受操纵基因的控制。
（二）原核基因调控的分类和主要特点一、原核生物的基因调控特点：（1）基因调控主要发生在转录水平上，形式主要是操纵子调控.（2）有时也从DNA水平对基因表达进行调控，实质是基因重排。
医学分子生物学第九章印迹杂交技术
cDNA。 将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交。 激光扫描芯片杂交结果，计算机处理。 分析杂交数据。
基因芯片
芯片杂交操作流程：
基因芯片
经大规模PCR扩增获得独立cDNA插入片段
人工制作芯片
商业化芯片
分别用cy3(绿色)和cy5红色两种荧光燃料标记两 种cDNA
23 ICK
4 IL-3
22 MIP-3 alpha
25 MMP-8
原始值
model
normal
30386
12625 14732 14606 11547.5 9262.5 20601 16912 16590.5 22787 28232.5
12482.5
7836.5 8059.5 8564.5 6742.5
辣根过氧化物酶源自底物产物， 并发出光辣根过氧化物酶：HRPO 底片曝光
③ Blotting过程
1）牛血清白蛋白封闭硝酸纤维素膜 2）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与
膜上的蛋白结合。 3）洗去未结合的一抗。 4）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。 5）清洗掉未结合的二抗。 6）显影，检测
④结果 单抗blotting 结果
在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测 胶上的蛋白质泳带。
（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS-PAGE）：
是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线 性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。
② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） （Polyacrylamide gel electrophoresis）
（一）核酸的变性与复性
复性
RNA
DNA
第9章 杂种优势利用
（1）在亲本杂交亲和的范围内，杂种优势与双亲的 亲缘关系、生态类型、性状差异程度等密切相关；
（2）杂种优势与亲本间性状的互补密切相关； （3）杂种优势与双亲基因型的纯合度密切相关；
(4）杂种优势与环境条件有密切关系；杂种优势 多数表现为数量性状，因此，受环境条件的影响很大。
因此，对于异花授粉作物和常异 花授粉作物，为了利用杂种优势，必 须首先选育优良的IBL或纯系品种，在 亲本繁殖和杂交制种时，必须采取严 格的隔离保纯防杂措施。
Stephens（1954）报道了高粱雄性 不育系的应用，到1950’s 后期，美国已普 及了高粱杂交种，开创了常异花授粉作物利 用杂种优势的范例。1949年与1958年分别 在小麦、水稻中发现了雄性不育系，突破了 自花授粉作物利用杂种优势的禁区。
我国对杂种优势利用的研究开始于20世纪30 年代，在杂交水稻方面的研究和利用处于世 界领先地位。1980’s年代育成了秦油2号油 菜杂交种，在生产上推广种植近千万公顷， 处于世界领先地位。
利用杂种优势可大幅度地增加农作 物的产量，改良农作物的品质，增加农 作物的抗逆性，具有巨大的社会经济效 益，可以说，杂种优势利用是20世纪作 物育种工作的最突出的成就之一。
随着现代分子生物学的快速发展及 研究的不断深入，杂种优势的遗传理论 与应用研究将会取得更大的进展。
第二节 杂种优势的表现特性
F1群体基因型的高度同质的杂合性以及由此 产生高度的整齐一致性是F1群体具有很强的杂种 优势的基本条件，F2群体由于基因型的分离，群 体的遗传型和表现型呈现多种多样，使整齐度下
降，因而F2杂种优势与F1相比明显下降，所以， 在生产上一般只利用F1而不利用F2。
第三节 杂种优势的遗传基础
一、杂种优势表现的遗传机理假说
《分子生物学》4 chapter9 共43页PPT资料
The causes of mutation
Error in replication
Ensuring the accuracy Replication errors cause
types Point mutation Insertions or deletions
Mutagens chemical
Mismatch repair
Increase the accuracy of DNA synthesis for 2-3 orders of magnitudes.
Prokaryote Eukaryote
Mismatch repair removes errors that escape proofreading
to MutS (MSH) and MutL (MLH). The underlying mechanisms are
not the same and not well understood.
DNA damage and their repair
•damage spontaneousl
Causes
MutS scans the DNA, recognizing the mismatch from the distortion they cause in the DNA backbone
MutS embraces the mismatch-containing DNA, inducing a pronounced kink in the DNA and a conformational change in MutS itself
MutS is a dimer. One monomer interacts with the mismatch specifically, and the other nonspecifically.
第9章.植物的成花生理
SDP SDP LDP LDP
北种南引 南种北引 北种南引 南种北引
提早成熟 延迟开花 延迟开花 提早成熟
选择晚熟品种 选择早熟品种 选择早熟品种 选择晚熟品种
3.控制开花
菊花一般在秋季开放，而通过人工调控 光周期，可以使菊花在任何季节开放。
4.调节营养生长和生殖生长
南麻北种，可推迟开花，使麻秆生长 较长，提高纤维的产量和品质。
经春化的小麦，可提早成熟，避开干热风。 许多一年生植物，对低温的要求是质的（或绝对的）； 低温→LD→开花（图）
4. 解除春化作用（去春化作用）
在春化过程结束之前，把植物放到较高温度下 , 低温的效果被消除。这种作用即解除春化作用。 解除春化作用的温度： 25-40℃； 缺O2 也可解除春化作用. 再春化作用：解除春化后，再进行的春化作用 称为再春化作用。
二 、春化作用的特性
1. 需要春化的植物
有冬性一年生植物，冬小麦、冬黑麦等；
北方小麦品种要求春化的温度比南方低， 小麦分为冬小麦、半冬性小麦、春性小麦* 大多数二年生植物：甜菜、芹菜等； *
有些多年生植物：牧草、菊花只需春化一次， 几年可以连续开花。
春化作用是温带植物发育过程表现出来的特征。
A.成花诱导
C.花发育
B.成花启动
各种植物表现不同。★
第二节 春化作用(vernalization)
一 、发现及定义
1918 年 , Gassner 将小麦和黑麦分为：秋播“冬性”、春播“春 性”。 “冬性小麦”改在春季播种，只生长不开花结实，只有1-20℃ 处理的冬黑麦可以在春播时，开花结实。 1928年，李森科采用春播前将吸涨萌动的种子用低温处理的 方法，在苏联寒冬地区，播种冬小麦成功（当年抽穗开花） 并把这一措施叫做“春化”。 我国古代春化处理方法如： 闷麦法：把萌动的冬小麦闷在罐中，放在0-5℃低温处40-50天. 七九小麦：即从冬至那天起将种子浸在进水中，次晨取出阴干， 春化作用：植物需要经过低温阶段才能成花的现象称为春化现象。 每九天处理一次，共七次。 这种低温对植物成花的促进作用称为春化作用。
山东大学分子生物学章节习题及参考答案09癌基因、抑癌基因与生长因子
第九章癌基因、抑癌基因与生长因子一、选择题【A型题】1．关于癌基因的叙述，错误的是A．是细胞增殖的正调节基因B．可诱导细胞凋亡C．能在体外引起细胞转化D．能在体内诱发肿瘤E．包括病毒癌基因和细胞癌基因2．关于病毒癌基因的叙述，正确的是A．主要存在于DNA病毒基因组中B．最初在劳氏（Rous）肉瘤病毒中发现C．不能使培养细胞癌变D．又称原癌基因E．由病毒自身基因突变而来3．关于逆转录病毒的叙述，错误的是A．即RNA病毒B．可产生逆转录酶C．在宿主细胞中以前病毒形式代代传递D．所有逆转录病毒都有癌基因E．可用作基因治疗的载体4．癌基因的表达产物不包括A．生长因子类似物B．跨膜生长因子受体C．结合GTP的蛋白质D．反式作用因子E．顺式作用元件5．不属于癌基因激活结果的是A．过量的正常表达产物B．原来不表达的基因开始表达C．基因缺失D．蛋白产物氨基酸组成改变E．出现异常/截短的表达产物6．关于P53基因的叙述，错误的是A．突变后具有癌基因作用B．是一种抑癌基因C．基因定位于17P13D．编码胞浆磷酸化蛋白E．编码产物有转录因子作用7．关于抑癌基因的叙述，正确的是A．具有抑制细胞增殖的作用B．与癌基因的表达无关C．缺失与细胞的增殖和分化无关D．不存在于人类正常细胞中E．在所有肿瘤细胞正常表达8．关于癌基因的叙述，错误的是A．原癌基因存在于正常细胞基因组中B．癌基因对维持细胞正常功能有重要作用C．原癌基因一般处于静止或低表达状态D．病毒癌基因可引起肿瘤E．细胞癌基因来自原癌基因激活9．关于细胞凋亡的叙述，错误的是A．某种信号触发的过程B．细胞按一定程序缓慢死亡C．可诱导肿瘤发生D．某些癌基因具有抑制凋亡的作用E．生理病理条件下均可发生10．关于Rb蛋白的叙述，正确的是A．细胞进入S期，Rb蛋白磷酸化水平降低B．分裂增殖的细胞只含磷酸化型Rb蛋白C．G0、G1期，Rb蛋白磷酸化水平升高D．高磷酸化Rb蛋白可与E2F结合E．Rb基因失活只见于视网膜母细胞瘤11．关于原癌基因的叙述，错误的是A．只存在于脊椎动物细胞中B．进化中基因序列高度保守C．是正常细胞生长增殖所必需D．通过其蛋白表达产物起作用E．被某些因素激活可转变为癌性/癌基因12．P53蛋白的DNA结合区域是A．核心区B．N-端C．酸性区D．碱性区E．C-端13．P53蛋白半衰期短是由于A．细胞中P53蛋白含量很低B．核心区含有特异氨基酸序列C．酸性区易被蛋白酶水解D．酸性区含有特殊的磷酸化位点E．碱性区可被多种蛋白激酶识别14．关于Rb蛋白的叙述，错误的是A．定位于细胞核内B．是一种跨膜蛋白C．非磷酸化形式为活性型D．G0期淋巴细胞仅含非磷酸化Rb蛋白E．其磷酸化程度与细胞周期密切相关15．关于原癌基因ras的叙述，错误的是A．ras蛋白性质类似于G蛋白的α亚基B．ras蛋白即P21C．H-ras、K-ras、N-ras核苷酸序列相差很大D．ras蛋白为多种生长因子信息传递过程所共有E．ras蛋白参与NO水平的调节【X型题】16．原癌基因的特点包括A．广泛存在于生物界B．基因序列呈高度保守性C．通过其表达产物发挥作用D．激活后具细胞转化能力E．只存在于肿瘤细胞中17．原癌基因的激活机制有A．获得启动子B．基因易位C．基因扩增D．点突变E．增强子插入18．原癌基因激活的结果是出现A．新的表达产物B．过量的正常表达产物C．异常、截短的表达产物D．大量凋亡蛋白E．异常、延长的表达产物19．野生型P53基因A．是生长因子基因B．是抑癌基因C．与人类肿瘤相关性最高D．产物是一种核内磷酸化蛋白E．抑制细胞凋亡20．P53蛋白的作用是A．活化P21基因转录B．抑制解链酶活性C．参与DNA的复制与修复D．若修复失败，诱导细胞凋亡E．使细胞进入S期21．能抑制细胞凋亡的是A．野生型P53基因B．突变型P53基因C．P16基因D．NGFE．Rb蛋白二、名词解释1．Oncogene2．抑癌基因3．Apoptosis三、简答题1．简述原癌基因的特点。
第9章：生物的起源与进化
可遗传的变异。
（2）繁殖过剩
各种生物都有极强大的生殖力。但是自然界中 各种生物的数量在一定时期内都会保持相对稳定。
（3）生存斗争
生物存在着繁殖过剩现象，出现了生存斗争。
种内斗争 种间斗争 生物与非生物之间的斗争
（4）适者生存
生物体普遍存在着遗传和变异，其中 有利变异得到保存，对生存不利的变异遭 受淘汰，出现适者生存。
青霉素对细菌抗性的选择 DDT对家蝇抗性的选择
6.分子进化的中性学说（非达尔文主义）
1968年，日本的木村资生(M.kimura) 提出了分子进化的中性学说。
（1）中型学说产生的学术背景 同功酶的发现和研究
例如：乳酸脱氢酶LDH是由4个亚基聚合而成的四
聚体，可形成5种LDH同工酶：H4、M4、H3M1、H2M2和
6.真核细胞的起源
1970年，Lynn Margulis出版了<<真核细胞
的起源>>一书，提出了真核细胞起源的内
共生学说。
内共生学说
原始厌氧原核细胞 吞食需氧菌 原核复合生物 （共生关系） 被吞食的原核生物 演变为细胞器 细菌 蓝藻 细胞膜多重内褶 内褶形成内质网、核膜等
线粒体 真核细胞 叶绿体
真核植物 真核动物 真菌 某些原生生物
二、生物的进化
1.进化：生物从共同祖先由低级到高级，由简单到
复杂逐步分化演变的过程叫进化（evolution)。
进化含有连续变化的意思，而这种变化又带有定向
的成分，进化即朝一定方向变化的趋势。
（一）生物进化的证据
1.古生物进化的证据
化石
化石是古代埋藏在地层中的动、植物遗迹。 如：石化的躯体、躯体印痕、足迹、 排遗物粪便等。 琥珀和深冻猛犸与化石一样，也是研 究生物进化的好材料。
分子生物学第9章
5. 通用性：所有的低等和高等生物，基本上共用一 套遗传密码子。 变异性：线粒体DNA（Mt DNA)的编码方式与通 用密码有所不同，某些细胞基因组密码也有一定 的变异。
6. 突变的效应及遗传密码的防错系统
•遗传密码的进化方式以突变影响的最小化为目的。 •同义密码子在密码表中的分布具有其规则，而且密 码子的碱基顺序与其相应的氨基酸物理化学性质之 间存在一定关系。氨基酸的极性通常由密码子第二 位碱基决定，简并性由第三位碱基决定。
密码子简并性
密码子与反密码子的相互作用
4. 变偶性（摇摆性）：遗传密码的专一性主要取决 于前两位碱基，第三个碱基具有一定的变动范围。 （反密码子的第一位如果是 U ，可以和密码子第 三位 A 和 G 配对；反密码子第一位如果是 G 可 以和密码子第三位 U 和 C 配对。反密码子第一位 如果是 I ，可以和 U 、 C 、 A 配对。）
跳跃（translation jumping），其发生位置具有
mRNA的特殊序列结构。
9.3.4蛋白质合成的抑制
•嘌呤霉素可在肽酰转移酶的作用下与氨基酸结合，形成 酰胺键，此复合物易从核糖体上脱落，从而使蛋白质合 成过程中断。 除了嘌呤霉素之外，许多抗生素及毒素可以抑制蛋白 质的合成。 原：氯霉素、四环素、链霉素、新霉素、卡那霉素； 真：亚胺环己酮、白喉毒素。
真 核 生 物 翻 译 起 始 复 合 物 组 装
•真核细胞蛋白质生物合成的起始步骤可概括为： （1）形成43S核糖体复合物：由40S小亚基与elF3 和elF4c组成。 （2）形成43S前起始复合物：即在43S核糖体复合 物上，连接elF2-GTP-Met-tRNAMet复合物。 （3）形成48S前起始复合物：由mRNA及帽子结合 蛋白1（CBP1）、elF4A、elF4B和elF4F共同构成 一个mRNA复合物。mRNA复合物与43S前起始复 合物作用，形成48S前起始复合物。 （4）形成80S起始复合物：在elF5的作用下，48S 前起始复合物中的所有elF释放出，并与60S大亚基 结合，最终形成80S起始复合物，即40S亚基mRNA-Met-tRNAMet-60S亚基。 •P235图9.13
分子生物学第九章 分子生物学研究方法电子教案
第九章分子生物学研究方法1．课程教学内容(1)核酸技术1—基本操作(2)核酸技术2—克隆技术(3)核酸技术3—测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术2．课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3．课程教学要求掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。
本章内容•核酸的凝胶电泳•DNA分子的酶切割•核酸的分子杂交•基因扩增•基因的克隆和表达•细菌的转化•DNA核苷酸序列分析•蛋白质的分离与纯化•研究DNA与蛋白质相互作用的方法一、核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。
电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。
由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。
在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。
从这个意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。
分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。
Gel matrix (胶支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose (琼脂糖):(1) a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭)Polyacrylamide (聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differfrom each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range (1 to a fewhundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis (脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are orientedorthogonally (直角地) to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as wellas to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up toseveral Mb in length.二、DNA分子的酶切割Restriction endonucleases (限制性内切酶) cleave DNA molecules at particular sitesRestriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize (识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. e.g. EcoRIThe random occurrence of the hexameric (六核苷酸的) sequence: 1/4096 (4-6=1/46)(1) Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2) Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端).(4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
分子生物学(张海红)9 章.ppt
端粒如何复制？端粒与衰老的关系如何？
Chapter 9
The Mutability and Repair of DNA
Chapter 9
Three important sources for
mutation (unavoidable)
1. Inaccuracy in DNA replication ➢(10-7 is not accurate enough)
Chapter 9
2. The Nature of Mutations
The simplest mutations: （1）Transitions(转换): a kind of the simplest mutations which are pyrimidineto-pyrimidine and purine-to-purine substitutions. （2）Transversions(颠换): the other kind of mutation which are pyrimidine-topurine and purine-to-pyrimidine substitutions.
回顾第8章的内容
相关的概念：半保留复制、半不连续复制、前导链、 后随链、冈崎片段、复制子、复制叉、 解旋酶、引 物酶、拓扑异构酶、 DNA聚合酶、端粒酶、端粒。
DNA复制的过程 (原核、真核) DNA复制过程中涉及的酶或蛋白质有哪些？各自有
何功能？ 原核生物与真核生物DNA聚合酶结构及功能的异同？
misincorporation of a base in the first round of replication. In the second round of replication, the mutation becomes permanently incorporated in the DNA sequence.
分子生物学
第一章绪论名词解释1.分子生物学广义：研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规侓性和互相关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
狭义：研究范畴偏重于核酸（或基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调节控制等过程。
2.信号传导：外部信号通过细胞膜上的受体蛋白传到细胞内部，并激发诸如离子通透性、细胞形状或其他细胞功能的应答过程。
3.转录因子：一群能与基因5’端上特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。
4.RNA剪辑：当基因转录成pre—mRMA后，除了在5’端加帽及3’端加多聚A（ployA）之外，还要切去隔开各个相邻编码区的内含子，使外显子（编码区）相连后成为成熟MRNA。
简答题1.简述分子生物学的含义及研究内容（1）广义：研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规侓性和互相关系的科学，是人类从分子水平上真正揭开生物世界的奥秘，由被动地适应自然界转向主动地改造和重组自然界的基础学科。
狭义：研究范畴偏重于核酸（或基因）的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调节控制等过（1）分子生物学的三条基本原理：构成生物体各类有机大分子的单体在不同的生物体中都是相同的。
生物体内一切有机大分子的建成都遵循共同的规则。
某一特定生物体所拥有的核酸及蛋白质分子决定了它的属性。
（2）研究内容DNA重组技术基因表达调控研究生物大分子的结构、功能研究2.简述DNA重组技术的应用前景用于大量生产某种在正常细胞代谢中产量很低的多肽：如激素、抗生素、酶类、抗体等，提高产量，降低成本，使许多有用多肽得到广泛的应用。
用于定向改造某些生物基因组结构,使其具备的特殊经济价值或功能提高、扩大用于基础研究3.简述真核生物基因表达调控的三个水平。
调控：三个水平上信号传导：外部信号通过细胞膜上的受体蛋白传到细胞内部，并激发诸如离子通透性、细胞形状或其他细胞功能的应答过程。
分子生物学终极版
2015分子生物学思考题第一章核酸的结构与功能2. DNA双螺旋结构模型有哪些基本要点？其稳定因素有哪些？比较A-DNA、B-DNA 、Z-DNA的主要特点。
一、基本要点1 主链：DNA分子由两条反向平行链组成，按右手螺旋方向缠绕成双螺旋结构；双螺旋表面有两条凹沟，一条较深，一条较浅，分别称大沟和小沟。
这个模型要求两条链是反向平行（Antiparallel)。
在双螺旋中，一条是5¢-3¢走向，另一条是3¢-5¢走向。
2、碱基配对一条链上的嘌呤碱基与另一条链上的嘧啶碱基以氢键相连，匹配成对，原则是A=T二者之间两个氢键，G≡C之间三个氢键。
3、螺旋参数碱基平面与纵轴垂直，相邻碱基对距离0.34nm，沿轴旋转一周需10个核苷酸残基；糖环平面与纵轴平行。
双螺旋直径为2nm二、维持DNA双螺旋结构的力（稳定因素）1、氢键：互补碱基之间稳定性∝（G+C）含量2、碱基堆积力（最主要原因）：内部强大疏水区，与介质水分子分开3、其它：离子键（PO3-和介质阳离子），范德华力：加强碱基疏水相互作用3. 什么是拓扑异构酶？它有什么作用？可分为几类，分别有什么特点？概念：催化DNA拓扑异构体相互转化的酶。
作用：催化DNA骨架中磷酸二酯键的断裂和重新连接。
分类：Ⅰ型特点：切断双链DNA中的一条，催化瞬时单链断裂和再连接反应。
不需能量。
L改变1。
eg ：大肠杆菌DNA拓扑异构酶Ⅰ，真核生物DNA拓扑异构酶ⅠⅡ型特点：同时断裂、连接DNA双链。
需要能量（ATP)。
L改变2。
eg ：DNA旋转酶（大肠杆菌拓扑异构酶Ⅱ）4. 哪些因素会引起DNA变性？结果如何？影响Tm的因素有哪些？哪些因素会影响DNA 复性？概念：DNA双螺旋区的氢键断裂，两条链分开形成单链，链分离的过程叫变性或熔解。
原因：造成维持力破坏的因素是变性引起DNA变性因素：加热、PH值、有机溶剂结果：增色效应（DNA变性后溶液的紫外吸收值升高）、粘度降低、沉降速度加大、浮力密度上升。
第九单元知识点总结
第九单元知识点总结第九单元主要介绍了生物学中的遗传和进化知识。
遗传和进化是生物学的基础，对于生物的发展和演化具有重要的意义。
下面将对第九单元的知识点进行总结。
1. DNA的结构和功能DNA是脱氧核糖核酸的简称，是生物体内储存遗传信息的分子。
DNA的结构是由磷酸、五碳糖和四种碱基组成的双螺旋结构。
DNA的功能主要是编码，可以通过不同的碱基序列编码出不同的基因信息，控制生物体的生长、发育和代谢等生命活动。
2. 遗传物质的复制DNA的复制是生物体增殖和遗传的基础。
DNA的复制是在细胞分裂前进行的，通过复制，一个细胞可以产生两个完全相同的DNA分子，确保了细胞的遗传信息不被丢失。
3. 基因的表达和调控基因是生物体内具有特定功能的DNA片段。
基因的表达是指基因在细胞内被转录成mRNA，然后翻译成蛋白质的过程。
基因的表达受到多种调控因素的影响，包括环境、激素、转录因子等。
4. 遗传的性状生物的性状是由基因决定的，遗传是通过基因传递给后代的。
性状的表现受到基因型和环境的影响，不同基因型和环境条件下的生物体表现出不同的性状。
5. 自然选择与进化自然选择是指适应性强的个体更容易在生存竞争中生存下来并繁殖，使得适应性强的性状在种群中逐渐增加的过程。
自然选择是达尔文进化论的核心概念，是生物进化的驱动力。
6. 生物的进化生物的进化是指生物种群在长时间内适应环境变化，产生了适应性变异，从而产生出新的物种和生物形态的过程。
进化是生物多样性的重要来源，也是生物世界不断发展演化的动力。
以上是第九单元的知识点总结，通过对这些知识的学习，我们可以更好地理解生物的遗传和进化规律，为生物学研究和生命科学的发展提供了重要的理论基础。
希望同学们能够深入学习，掌握这些知识，为将来的学习和科研奠定坚实的基础。
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第九章聚合酶链反应第一节PCR基本原理适温延伸•高温变性：94°C左右，目的基因解链为单链，以作为扩增的模板；•低温复性：55~60°C,—对特异性引物分另U与模板3'端互补结合;•适温延伸: 72°C,延伸反应;•每一循环使DNA分子扩增一倍，n次循环后, 理论上DNA分子可扩增为2"。
聚合酶链反应的原理高轟性低論火适蟲申彳曰(°C)95-72 -50DNA变性形成2条程链\ /字链延伸\ ______ / DNA加倍DNA单链与引物复性_________ ＞重复1 3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋1 2 3 4 5时间(min)惑吞葩傩氏血wanted gener =4 copies些===========Exponential amplification► J5tlicycle36 .. .2 billinn copies第二节PCR特点■特异性强■灵敏度高皮克(pg=io-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU,细菌为3个细菌•简便.快速一次性加好反应液，1~4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析•对标本的纯度要求低血液.体腔液.洗嗽液.毛发.细胞.活组织等组织的粗提DNA第三节PCR体系组成和反应条件优化一、体系组成・DNA聚合酶•引物（Primer）・dNTP （原料）•目的DNA模板•缓冲液（Buffer ）（一）DNA聚合酶表9-1 PCR常用DNA聚合酶DNA聚合酶来源校对活性加接3'dAMP Taq DNA聚合酶Thermus aquaticus■+Tth DNA聚合酶Thermus thermophilus-+KOD DNA聚合酶■Thermococcus kodakaraensis+—Tli/Vent DNA 聚合酶Thermococcus litoralis+-Pfu DNA聚合酶Pyrococcus furiosus+—Pwo DNA聚合酶Pyrococcus woesii+—AmpliTaq DNA 聚合酶Taq DNA聚合酶修饰-+ KlenTaq DNA 聚合酶Taq DNA聚合酶修饰—+（二）引物引物设计原则:1•引物长度15-30nt2 •引物组成G/C含量以40%-60%为宜3•引物结构•碱基随机分布.二级结构.引物二聚体，于端不应有三个连续的G/C，5,端可以修饰4•引物特异性与其他序列的同源性一般＜70%5•引物浓度非特异性扩增，引物二聚体6•引物质量纯化启动子序列 定点突变 探针标记引物设计3y55限制性内切酶的识别序列!1!引物设计常用软件主要有: •Primer Premier 5.0•Oligo 6•primer 3•The Primer Generator •Net Primer（三）dNTP• 1 •应当根据目的DNA的长度和组成确定dNTP的浓度2-四种dNTP要等摩尔浓度配• 3-dNTP的履量也与扩增效率有密切关系㈣模板• DNA或RNA （先逆转录合成cDNA）•来源:根据科学研究或临床检验的需要,可以是临床标本（血液.尿液.羊水、分泌物等）.药物标本（动植物细胞.组织等八法医标本（犯罪现场的血渍.精斑.毛发等八病原体标本（病毒.细菌.真菌.支原体.衣原体.立克次体等八考古标本（骨骸.毛发等）•无论何种来源的标本，都应该进行预鱼理（五）缓冲溶液•维持DNA 聚合酶的活性和稳定性 苍D H=7・250mmol/L 型可以促进引物退火，但浓度过高会抑制酶• 25mmol/L _0也［虑2，SO4对金属离子有一定的结合力。
3.小牛血清白蛋白或明胶可以维持酶活性,能保证PCR 的稳定性 4＞甲酰胺或二甲基亚枫有利于松解发夹结构等二级结构,促进引物退火吐L 影响酶活性及变性解链.引物退火.扩增效率.扩增特异性等I 、 5、:、条件优化（一）反应温度和反应时间• 2•迟火温度和时间 退火温度应当低于引物Tm 值3-5 °C ，通常为50- 65 °C , 20-40秒钟 TaqDNA 聚合酶的最适温度为75-80 °C , 72 °C,lmin（二）循环次数•循环次数决定PCR 扩增效率 • 一般控制在30-40次•酶活性下降.dNTP 浓度下降等，会使反应进入平台期• 1 •变性温度和时间95°C30秒或97 °C15秒■ 3 •延伸温度和时间:、产物分析（一）电泳分析（二）酶切分析•既能对PCR产物进行鉴定，又能对靶基因进行分型（三）杂交分析•检测PCR产物特异性，是否存在变异（四）序列分析•检测PCR产物特异性最可靠的方法第四节常用PCR技术・、逆转录PCR (RT-PCR)・二±法:逆转录和PCR在同一个反应体系中进行两步法:逆转录和PCR在两个反应体系中分开进行・引物很关键。
①oligo(dT)引物②特异性引③随机引物•逆转录PCR可以与DNA印迹法联合，分析扩增产物，从而分析样品中的RNA含量，研究基因表达•逆转录PCR灵敏度较低，属于半定量分析二、实时定量PCR (Q-PCR)•对荧光信号的实时检测来跟踪PCR进程，标准曲线定量分析起始模板水平1•实时定量PCR探针•特异性荧光探针:荧光报告/淬灭基团• EB或SG作为荧光探针2•实时定量PCR应用・与逆转录联合可以定量分析mRNA以研究基因表达・基础研究与临床诊断3•实时定量PCR特点• PCR高效性.核酸分子杂交特异性.荧来技术高灵敏度和可计量性.TaqDNA聚合酶的外切酶活性•封闭条件，没有污染，自动化程度高，多重反应5min inn iiii mu mi i ii in UH i ii in ii iiiiiiiiiTn- 33,端的荧光Q分子吸收亍端荧光R分子的荧光信号5 nil HI i in II II iii i II IIII ii ii i in IIII mull ion i! in mi 3探针亍端连接的荧光R分子被TaqW切割下来■・llll II5’3”荧光R分子发岀荧光，切割的荧光分子数与PCR数量成比例图5J1 T aqMan技术原理示意图不掺入双链中的S YBR染料分子不会发出任何荧光信号SYBR荧光染料特异性地掺入DN A双链,发岀荧光信号图5-10 SYBR-Green I荧光染料原理示意图定量原理确定初始模板的浓度•初始DNA量越多，荧光达到某一值（域值）时所需要的循环数越少（Ct值）・Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算岀样品中所含白如*莫板量controlContro e-susu-auuapsa」noizCycle NumberLog Concentration图9 -3引物2 5f --------- 3f 3f ------------------------------------------ ②I延仲35*了5f51了51JI*35f5f5f5’31图9 -3实时定量PCR荧光定量实时PCR与普通PCR的比较•灵敏度高灵敏的荧光检测较电泳检测灵敏度高•特异性高使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性•定量准确全程监控，准确的算法进行定量•无需跑胶，自动化程度高荧光定量PCR仪荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应的分析软件。
_____二修饰引物PCR・对特定DNA序列进行定向克隆、定点诱变、体外转录等研究时，需要其末端带有限制位点、突变序列、启动子等DNA元件，为业可以在PCR引物的5,端加接这些元件进行扩增，这就是修饰引物PCR・例如:在引物5,端加接限制位点，就可以用限制酶切割扩增产物，形成黏端，从而与有互补黏端的载体DNA重组,这就是克隆PCR・克隆PCR克隆效率较高，并且如果给两个引物加接不同的限制位点，可以进行定向克隆5f GGGGAA FTC：9 一4克隆PCR四、等位基因特异性PCR•等位基因特异性PCR (AS-PCR)用于检测点突变•原理：同时设计一个正常引物对和一个突变引物对■下游引物完全一样，上游引物歹末端的碱基不同•两个PCR体系,各加入一个引物对•等位基因特异性PCR用于鉴定单核昔酸多态性(SNP)C 3・A 3’------------------- T --------------------------------- ---------------------------------- T ---------------------------------图9 -5 等位基因特异性PCR厭变基因AS-PCR黠分析正常引物对突变引物对①严格祀对扩W ②銷配不扩増五、PCR-RFLP■聚合酶错反应-限制性片段长度多态性分析技术（PCR- 睡）是PCR技术与RF分析的联合，即先用PCR将包含待测多态性位点的DNA片段扩增出来，然后用识别该位点的限制酶切割，电泳分析其RFLP,判断是否存在突变・PCR-RFLP可以极大地提高RFLP分析的灵敏度和特异性,是检测突变的较为简便的方法六、PCR-单链构象多态性(SSCP) 七、随机扩增多态性DNA ( RAPD)八、扩增片段长度多态性(AFLP)九、长距离PCR (LD-PCR)思考题•1、PCR基本原理•2、PCR反应体系及反应条件的优化。