各种染色技术总结

一、原理：

1、革兰氏染色原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。

2、芽孢染色法的原理:

芽孢又叫内生孢子(endosopre)，是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢囊是否膨大等特征是鉴定细菌的依据之一。

芽孢染色法是利用细菌的芽孢和菌体对染料的亲和力不同的原理，用不同染料进行着色，使芽孢和菌体呈不同的颜色而便于区别。芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，因此，当先用弱碱性染料，如孔雀绿（malachite green）或碱性品红（basic fuchsin）在加热条件下进行染色时，此染料不仅可进入菌体，而且也可进入芽孢，进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，若再用复染液（如番红液）或衬托溶液（如黑色素溶液）处理，则菌体和芽孢易于区分。

用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于区分。

3、荚膜染色法的原理:荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要成分是多糖类，不易染色，故常用衬托染色法，即将菌体和背景着色，而把不着色且透明的荚膜衬托出来。荚膜很薄，易变形，因此，制片时一般不用热固定。由于荚膜与染料的亲和力弱、不易着色；而且可溶于水，易在用水冲洗时被除去。所以通常用衬托染色法（负染）染色，使菌体和背景着色，而荚膜不着色，

在菌体周围形成一透明圈。由于荚膜含水量高，制片时通常不用热固定，以免变形影响观察。

4、用单一染料进行细菌染色，操作简便，适于菌体一般形状和细菌排列的观察。常用碱性染料进行简单染色，这是因为：在中性、碱性或弱碱性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在电离时，其分子的染色部分带正电荷（酸性染料电离时，其分子的染色部分带正电荷），因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色，经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下易于识别。常用作简单染色的染料有：美蓝、结晶紫、碱性复红等。

二、染色剂的配制

1革兰氏染色剂

1.1结晶紫染色液（Hucker氏配方）

甲液：结晶紫（Crystal violet） 2.0 g

乙醇(95%) 20.0 mL

乙液：草酸铵[(NH4)2C2O4•H2O] 0.8g

蒸馏水 80.0 mL

甲、乙两液相混，过滤，棕色瓶保存。

1.2卢哥(Lugol)氏碘液

碘(I2)片 1.0 g

碘化钾(KI) 2.0 g

蒸馏水300 mL

先溶碘化钾于少量蒸馏水中，再将碘溶于碘化钾溶液中，可稍加热，最后加足蒸馏水，棕色瓶保存。

1.3脱色液95%的乙醇液。

1.4复染液0.5%的番红水溶液（Safranin O)

2.5%的番红酒精溶液 20 mL

蒸馏水 80 mL

2芽胞染色液

2.1孔雀绿染色液（Malachite green）

孔雀绿 5.0 g

蒸馏水 100 mL

2.20.5%番红染色液

3石碳酸复红染色液

甲液：碱性复红(Basic fuchsin) 0.3 g

95%酒精10.0 mL

乙液：石碳酸(Phenoecrystals C.P) 5.0 g

蒸馏水95 mL

将甲、乙两液混合后即得石碳酸复红染色液原液。染色时，将原液稀释5~10倍使用。

三、染色方法与步骤

（一）细菌的单染色

1．涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴无菌水，用无菌操作方法从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀，涂成薄膜，涂布面积约1～1.5cm2。

2．干燥将涂片于室温中自然干燥。

3．固定手扶载片一端，使涂菌的一面向上，将载片通过微火2～3次。在火上固定时，用手摸涂片反面，以不烫手为宜。不能将载片在火上烤，否则细菌形态毁坏。

4．染色将涂片置于水平位置，滴加染色液覆盖于涂菌处，染色约2min。

5．水洗倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下，不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止。

6．干燥自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干，注意不要擦掉菌体

7．待标本完全干燥后，先用低倍镜和高倍镜观察，将典型部位移至视野中央，再用油镜观察。

（二）细菌的革兰氏染色

1．涂菌用无菌操作方法从试管中沾取菌液一环，用接种环在洁净无脂的载玻片上做一薄而均匀、直径约lcm的菌膜。涂菌后将接种环火焰灭菌。

2．干燥于空气中自然干燥。亦可把玻片置于火焰上部略加温加速干燥(温度不宜过高)。

3．固定目的是杀死细菌并使细菌粘附在玻片上，便于染料着色，常用加热法，即将细菌涂片膜向上，通过火焰3次，以热而不烫为宜，防止菌体烧焦、变形。此制片可用于染色。

4．初染于制片上滴加结晶紫染液，染lmin后，用水洗去剩余染料。

5．媒染滴加卢戈氏碘液，lmin后水洗。

6．脱色滴加95%乙醇脱色，摇动玻片至紫色不再为乙醇脱退为止 (根据涂片之厚薄需时30s至lmin)，水洗。

7．复染滴加石炭酸复红液复染lmin，水洗。

8．滤纸吸干，油镜镜检。革兰氏阳性菌染成蓝紫色，革兰氏阴性菌染成淡红色。

革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌自行溶解了，都常呈阴性反应。

（三）细菌的芽孢染色

1．方法1

(1)取37℃培养18～24h的枯草芽孢杆菌作涂片，并干燥，固定(参见“细胞单染色法”)。

(2)于涂片上滴人3～5滴5%孔雀绿水溶液。

(3)用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4～5min。加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。

(4)倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。

(5)用0.5%沙黄水溶液(或0.05%碱性复红)复染lmin，水洗。

(6)制片干燥后用油镜观察。芽孢呈绿色，菌体红色。

2．方法2