生物分子高效分离与表征研究组
离子交换色谱技术——分离和纯化生物大分子的必备技术
离子交换色谱技术——分离和纯化生物大分子的必备技术随着人体基因组序列的解读以及各种细胞、组织和器官的高通量技术的发展，对于生命科学研究者而言，研究生物分子、生物大分子和蛋白质化合物的质量和纯度变得越来越重要，以达到提供更准确的实验数据和信息的目的。
因此，从海量混合物中纯化目标化合物的技术在生命科学和制药领域中变得越来越关键。
离子交换色谱技术出现了，它成为了生物大分子分离纯化的必备技术之一。
简介离子交换色谱技术是一种分离和纯化离子型物质的技术，适用于各种蛋白、核酸、多肽以及酶联免疫吸附试验等生物分子的分离与纯化。
其中，“离子交换”指离子交换树脂，是一种高分子化合物，在水中能够形成水合结构。
正负离子交换树脂有阴离子交换树脂和阳离子交换树脂两种。
在离子交换色谱过程中，该技术通过离子交换柱秉承离子两级的交换作用，从混合物中选择性地移除目标化合物以进行分离和纯化。
离子交换色谱技术的基本原理离子交换色谱技术的基本原理是根据生物大分子表面带有特定电荷的性质，使其与离子交换树脂上的反离子相互作用这种特定的性质相结合。
离子交换树脂本身可以引发这种特定性质，在某些情况下还可以与氢离子或氢氧根离子进行交换。
离子交换柱的结构和工作原理离子交换柱的工作原理是通过离子交换树脂选区性捕捉目标化合物，并通过某些方法从其中释放出来。
离子交换柱由含有离子交换树脂的柱子组成，内部环境包括真空等稳定环境。
离子交换柱根据生物分子在离子交换树脂表面的电荷状态选取不同的离子交换树脂和运行条件。
使用离子交换色谱和高效液相色谱使组分沿着离子交换柱进行分离。
组分的分离可以通过更改溶液中的化学物质来调节离子交换柱上的电位或链的溶解度。
离子交换色谱技术的应用离子交换色谱技术在分别提取多肽药物、血红蛋白和其他蛋白质、核酸序列、酶、低等生物细胞、孔雀石绿和甘草酸等天然产物中都有良好的应用效果。
其中，离子交换柱多用于从血红蛋白、细胞提取物和蛋白质混合物中分离纯化蛋白质，主要分为两个方面。
生物化学中的产物分离与分析技术
生物化学中的产物分离与分析技术生物化学是研究生物分子组成、结构、功能及其相互关系的科学。
在生物化学研究中，分离和分析生物分子产物是非常重要的一步，它涉及到生物分子结构与功能的解析、分子生物学的研究、药物的开发等诸多领域。
本文将介绍几种生物化学中常用的产物分离与分析技术。
1. 薄层色谱法薄层色谱法（Thin Layer Chromatography，TLC）是一种有效的分离和检测方法，可用于分离并检测各种不同类型的生物分子。
该技术使用涂有吸附剂的无机玻璃或塑料片作为站相，将需要分离的生物产物沿着板上的小坑过渡带动，然后通过化学计量法刻画产物中分离的成分。
薄层色谱法通常将分离的生物分子涂抹在薄层或高效率的站相上。
2. 凝胶层析法凝胶层析法（Gel Filtration Chromatography，GFC）是一种基于分子大小分离物质的技术。
在凝胶层析法中，生物产物被置于化学柱中的凝胶上，大分子会被凝胶过滤，而小分子则连同流动相移动，并进入到柱中。
随着时间的推移，被分离的小分子通过化学柱的末尾，而大分子则被凝胶滞留在柱中。
这种技术可以应用于分离蛋白质、DNA 合成物等生物产物。
3. 离子交换层析法离子交换层析法（Ion Exchange Chromatography，IEC）是一种通过电荷相互吸引分离不同电荷的产物的方法。
在离子交换层析法中，采用含有离子官能基的保持体，将待分离的生物产物通入柱中，并用离子洗涤液逐步冲洗，各种离子一次稀释并分离。
不同离子的相互吸引会让它们在柱中的保持体上停留不同的时间，进而达到分离的效果。
离子交换层析法通常用于制备、纯化带电生物分子。
4. 亲和层析法亲和层析法（Affinity Chromatography, AC）是一种分离纯化目标生物分子的高效和选择性技术。
该技术使用亲和柱（通常用聚合物、水凝胶或矽胶等作为固定支持的矩阵），将含有目标生物分子的样本通过亲和柱。
因为取决于目标分子的亲和性，仅目标分子会与支持矩阵表面上提前标记的区分分子结合。
抗体功能化磁珠-概述说明以及解释
抗体功能化磁珠-概述说明以及解释1.引言1.1 概述在概述部分，可以介绍抗体功能化磁珠的背景和重要性。
可以简要描述抗体功能化磁珠是一种结合了抗体和磁珠特性的新型生物材料，具有广泛的应用前景。
抗体功能化磁珠利用磁性材料的特性，使得其具有快速、高效的分离、富集和检测靶标分子的能力。
而通过功能化抗体于磁珠表面，可以使其具有高度的特异性和选择性，从而实现对特定分子的识别和捕获。
抗体功能化磁珠在生物医学领域有着广泛的应用。
它可以应用于生物分析、肿瘤标记、生物传感、药物富集和靶向治疗等多个方面。
在生物分析中，抗体功能化磁珠可用于快速检测和定量某些分子的含量，从而提高分析效率和准确度。
在肿瘤标记中，它可以通过捕获肿瘤标志物，实现早期诊断和治疗的目的。
在生物传感中，抗体功能化磁珠可用于构建高灵敏度和特异性的生物传感器，用于检测微量生物分子。
在药物富集和靶向治疗中，它可以高效地富集药物分子，并将其定位到特定靶标区域，减少药物对健康组织的损伤。
通过对抗体功能化磁珠的研究与应用，可以更好地理解其优势与局限性，并进一步探索其未来的发展方向。
因此，本文旨在系统总结抗体功能化磁珠的定义、原理、制备方法和应用领域，并讨论其优势、局限性以及未来的发展方向。
文章结构部分的内容可以如下所示：1.2 文章结构本文将按照以下结构来进行介绍抗体功能化磁珠的相关内容：第一部分：引言在引言部分，首先会对抗体功能化磁珠的概念进行简要的介绍，包括其定义和原理。
接着，会阐述本文的文章结构，以及本文的目的。
第二部分：正文正文部分将分为三个主要部分：2.1 抗体功能化磁珠的定义与原理在这一部分，将详细介绍抗体功能化磁珠的定义和原理，包括什么是抗体功能化磁珠，以及其原理是如何实现的。
重点将介绍抗体在磁珠表面的固定化过程以及抗体与目标分子的特异性结合。
2.2 抗体功能化磁珠的制备方法这一部分将介绍抗体功能化磁珠的制备方法。
包括选择合适的磁珠材料和尺寸、磁珠表面修饰的方法以及抗体的固定化方法。
生物活性物质的分离与纯化研究
生物活性物质的分离与纯化研究生物活性物质是指具有生命活性和特定功能的化合物，广泛存在于天然产物中。
在药物、食品、化妆品、环境保护等领域都有重要的应用。
然而，在天然产物中，生物活性物质通常水平低、含量少、结构复杂，不利于直接应用，而且还有其它无关成分的干扰，因而需要对其进行分离和纯化。
近年来，随着高效、低成本、绿色、工艺化的分离和纯化技术的不断出现，已可以满足越来越高的生物活性物质的要求。
一、生物活性物质的分离1. 大分子生物活性物质的分离大分子生物活性物质如蛋白质、核酸、多糖等，由于其分子量较大，荷电量较大，极性较强，使用离子交换、凝胶过滤、透析等传统方法分离困难。
近年来，一些新的高效分离方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管等电泳、液相色谱等出现并得到广泛应用。
其中，聚丙烯酰胺凝胶电泳是应用最广泛的方法之一。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离技术可同时对多种大分子生物活性物质进行分离和检测，操作简便，分辨率高，结果信号稳定。
毛细管等电泳和液相色谱也具有高效、快速、灵敏的特点，有时可在非常短的时间内完成大分子生物活性物质的分离，满足实际需求。
2. 小分子生物活性物质的分离小分子生物活性物质如固醇、生物碱、酚酸等，由于其分子量较小、极性强、易挥发和易腐解，与大分子生物活性物质分离具有明显不同。
传统分离方法如萃取、蒸馏、结晶分离等常用于小分子生物活性物质的提取和制备，但存在溶剂残留、分离效率低等缺点。
近年来，超声波萃取、微萃取、超临界流体萃取、毛细管电泳、气相色谱、高效液相色谱等新技术得到广泛应用，分离效率高、分离条件温和、无毒性，是小分子生物活性物质分离的重要新手段。
二、生物活性物质的纯化1. 离子交换层析离子交换层析是一种广泛应用的生物活性分子纯化技术。
运用离子交换层析制备纯品是非常有效的，离子交换树脂通常是一种珂朵莉缘固定功能反应物，利用电荷相互作用促进生物活性物质的吸附和析出。
实际运用时，根据生物活性物质的酸碱性质，在对应pH值下溶于缓冲液，然后将溶液加入到交换树脂的床层，在保证速度的情况下冲洗固定离子。
生物制药中的新型分离和分析技术
生物制药中的新型分离和分析技术随着现代医学的发展，生物制药已被广泛应用于疾病的治疗和预防，从而改善了人类的健康。
然而，生物制药的生产和研究面临着一些挑战，如如何高效而稳定地分离和纯化目标复杂生物分子，如何精确定量和检测其活性和纯度等问题。
因此，新型分离和分析技术的开发对于生物制药的发展至关重要。
一、蛋白质分离技术蛋白质是生物制药中最常用的药物。
其有效分离和纯化是实现药物质量和稳定性的关键。
传统的蛋白质分离技术包括离子交换、凝胶层析、透析等。
然而，这些传统分离技术存在着操作复杂、易受杂质影响、纯度低等问题。
为解决这些问题，研究人员提出了许多新型分离技术，如亲和层析、反向相色谱、快速液相色谱等。
其中，亲和层析技术利用生物分子与其特异性结合的配体之间的相互作用，实现高效、易操作的蛋白质纯化。
反向相色谱是一种高效、易操作的分离技术，能够有效地分离和富集蛋白质。
快速液相色谱技术可快速地进行样品分离和纯化，缩短分离时间，并赋予样品更高的分离分辨率。
二、质谱分析技术质谱分析技术是生物制药研究和生产中必不可少的手段之一。
它具有高灵敏度、高分辨率、高精度等优点，并能够快速检测和鉴定复杂蛋白质分子。
质谱分析技术包括时间飞行质谱、质谱成像技术、表面增强拉曼光谱技术等。
时间飞行质谱是高速、高分辨率的质谱分析技术，适用于鉴定低剂量的分子和复杂混合物。
质谱成像技术是将质谱分析技术与成像技术相结合，能够实现样品离体或在体成像，可用于药物代谢分析、组织蛋白质分析等。
表面增强拉曼光谱技术是一种高灵敏度的表面增强光谱技术，适用于纯化药物和蛋白质的质量快速检测。
三、单细胞分析技术单细胞分析技术是生物制药研究和生产中的新兴技术。
它与传统的群体分析不同，可以对单个细胞的基因、蛋白质等进行检测，从而实现个性化药物的生产。
单细胞分析技术包括单细胞转录组学、单细胞蛋白质组学、单细胞代谢组学等。
单细胞转录组学是在单个细胞水平分析基因表达的手段，可用于细胞老化、癌症早期诊断等方面。
微生物蛋白质组学研究中的二维凝胶电泳技术
微生物蛋白质组学研究中的二维凝胶电泳技术二维凝胶电泳技术在微生物蛋白质组学研究中的应用引言：微生物蛋白质组学研究是一门重要的生物学研究领域，它通过对微生物中所有蛋白质的研究，揭示微生物生命活动的本质。
而二维凝胶电泳技术作为一种重要的蛋白质分离方法，广泛应用于微生物蛋白质组学研究中。
本文将详细介绍二维凝胶电泳技术的原理、步骤以及在微生物蛋白质组学研究中的应用。
二维凝胶电泳技术原理：二维凝胶电泳技术是将蛋白质样品先经过等电聚焦分离，然后再经过SDS-PAGE分离，最终形成二维电泳图谱。
等电聚焦分离是根据蛋白质的等电点进行分离，将蛋白质在等电点电极上的瞬时电流消失，使其停留在相应位置。
SDS-PAGE则是根据蛋白质的分子量进行分离，通过SDS使蛋白质带负电荷，然后在电场中按分子量大小进行迁移。
通过这两个步骤的结合，可以实现对蛋白质样品的高效分离和定量分析。
二维凝胶电泳技术步骤：二维凝胶电泳技术主要包括样品制备、等电聚焦分离、SDS-PAGE分离和图谱分析四个步骤。
样品制备是二维凝胶电泳技术的关键步骤之一。
样品制备需要将微生物中的蛋白质提取出来，并进行适当的纯化和浓缩。
常用的提取方法包括机械破碎、超声破碎和化学溶解等。
提取后的样品需要去除杂质，以获得纯净的蛋白质。
等电聚焦分离是二维凝胶电泳技术的第一步，通过在等电点电极上施加电势，使蛋白质在等电点处停留。
等电聚焦分离需要使用等电聚焦凝胶，通常是聚丙烯酰胺凝胶，其中含有酰胺基团，可以与蛋白质发生缓慢的酰胺键反应。
蛋白质在电场中迁移时，由于等电聚焦凝胶中的pH梯度，会在等电点附近停留，形成一条水平的蛋白质带。
然后，SDS-PAGE分离是二维凝胶电泳技术的第二步，通过在SDS-PAGE凝胶中施加电势，使蛋白质按分子量大小进行迁移。
SDS-PAGE凝胶是一种聚丙烯酰胺凝胶，其中含有SDS（十二烷基硫酸钠）。
SDS可以使蛋白质带负电荷，并使蛋白质的分子量与电泳迁移速率成正比。
生化分离工程电子版课本 1-59
1 绪论1．1 生物技术与生物分离生物技术(biotechnology)即有机体的操作和应用有机体生产有用物质、改善人类生存环境的技术。
1953年，Watson和Crick提出了脱氧核糖核酸(DNA)的双螺旋结构模型．阐明了DNA是生物遗传信息(基因)的携带者，开辟了现代分子生物学的新纪元，为生物技术及其产业的发展开辟了广阔的空间。
20世纪70年代，重组DNA(recombinant DNA，rDNA)技术[1]和蛔／蝗融合技术[：]相继建立，现代生物技术步入了崭新的发展时期。
1980年前后，世界主要发达国家先后实施生物技术发展计划，生物技术迎来了日新月异的高速发展阶段。
进入21世纪，人类基因组研究取得巨大成就，各染色体测序工作逐步完成[1]迎来了生物技术的后基因组时代，蛋白质组学L5]、药物基因组学、生物信息学和系统生物学研究蓬勃兴起．为生物技术的发展注人了巨大的生机和活力。
生物技术的主要目标是生物物质的高效生产，而分离纯化是生物产品工程(bioproduct engineering)的重要环节。
因此，生物分离(bloseparation)是生物技术的重要组成部分[61。
在生物技术领域，一般将生物产品的生产过程称为生物加工过程(bioprocess)，包括优良生物物种的选育、基因工程、细胞工程、生物反应过程(酶反应、微生物发酵、动植物细胞培养等)及目标产物的分离纯化过程，后者又称下游加工过程(downstream processing)。
生物分离过程包括目标产物的提取(isolation)、浓缩(concentration)、纯化(purification)及成品化(product polishing)等过程．生物分离过程特性主要体现在生物产物的特殊性、复杂性和对生物产品要求的严格性上，其结果导致分离过程成本往往占整个生产过程成本的大部分[71。
例如，大多数工业酶(enzyme)的分离过程成本约占生产过程的?o％，而对纯度要求更高的医用酶如天冬酰胺酶(asparaginase)，分离过程成本高达生产过程的85％；基因重组蛋白质药物的分离过程成本一般占85％一90％以上．与此相比，小分子生物产物的分离成本较低，如青霉素的分离过程成奉约占50％，而乙醇的分离过程成本仅占“％．因此，在生物大分子药物的生产过程中，分离过程的质量往往决定整个生物加工过程的成败。
生物大分子的纯化与鉴定技术
生物大分子的纯化与鉴定技术生物大分子是生命体内最基本的组成元素之一，包括蛋白质、核酸、多糖和脂质等。
它们的结构和功能对于生物体的发育、代谢、传递遗传信息等方方面面都有着非常重要的作用。
因此，对它们进行纯化和鉴定是生物学和生命科学研究中不可或缺的重要步骤。
一、蛋白质的纯化与鉴定技术1. 活性层析技术活性层析是从混合样品中纯化蛋白质的一种常用技术。
它基于蛋白质与特定配体之间的互相作用，利用这种相互作用把想要纯化的蛋白质从混合物中分离出来。
这种方法不仅可以分离出单一种类的蛋白质，还可以根据蛋白质与配体的亲和性进行分层次纯化。
同时，利用不同的配体也能够分离出不同功能的酶，从而进一步扩大了对蛋白质的纯化范围。
2. 离子交换层析技术离子交换层析是一种基于蛋白质电荷的分离方法。
它利用固定在树脂表面上的离子，通过与蛋白质表面的离子相互作用，将蛋白质从混合物中分离出来。
这种方法常常用于分离带有不同电荷的蛋白质，以及酸性和碱性细胞因子等物质。
3. 尺寸排除层析技术尺寸排除层析技术是一种基于蛋白质大小的分离方法。
它通过让大分子在固定相中的孔隙中滞留时间长，从而将大分子和小分子分离出来。
这种方法通常用于分离相对分子质量较大的蛋白质，如重组蛋白、抗体等。
4. 逆相高效液相色谱技术逆相高效液相色谱是一种基于蛋白质亲水性的分离方法。
它利用逆相柱的反相作用，将亲水性较小的蛋白质从混合物中分离出来。
这种方法常常被用于提纯高表达体系中的蛋白质。
5. SDS-PAGE和Western Blotting技术SDS-PAGE是一种基于蛋白质质量和电荷的分离技术，通过在凝胶中加入SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂，可以使不同电荷和大小的蛋白质变得相同，从而进行准确的大小分离。
Western Blotting是一种检测蛋白质表达的方法，它利用特异性抗体将蛋白质分子分离出来，并将其转移到膜上，然后通过特异性抗体进一步检测目标蛋白质的表达量。
二、核酸的纯化与鉴定技术1. 常规离心技术常规离心技术是一种对复杂混合物进行分离和预纯化的方法，通过调整离心速度和离心时间，将不同大小和形状的细胞组分分离出来。
生物分子分离纯化的原理与技术路线
生物分子分离纯化的原理与技术路线生物分子分离纯化是现代生物科学研究的重要内容之一，它在生命科学、医学、化学、农业等许多领域中发挥着重要应用。
生物分子分离纯化是指将某种复杂生物体系中的生物分子依据其特定的物理化学性质从该体系中分离出来，进而纯化的过程。
这一过程需要基于分子的特性，结合各种理化技术手段，构建出相应的技术路线，进而实现对生物分子的高效分离纯化。
本文将详细介绍生物分子分离纯化的原理与技术路线。
一、生物分子的特性生物分子是一类由生物体内合成而成的，拥有特定结构的分子，包括蛋白质、核酸、多糖、脂质等，在代谢过程中发挥着极其复杂的生物功能。
不同的生物分子具有不同的物理化学性质，因此对于不同类型的生物分子，选择不同的分离策略与纯化方法是很有必要的。
二、生物分子分离的原理常用的生物分子分离方法包括离子交换、凝胶过滤、亲和层析、逆流层析、氢氧化铝纤维素膜过滤、高效液相色谱等。
下面将对其中几种方法进行详细介绍。
1、离子交换法离子交换法是利用载有不同离子电荷的基质，将带有相反电荷的生物大分子吸附并固定。
离子交换基质的离子交换能力取决于其离子化程度、离子交换基团的种类、柱子pH值等。
因此，在进行离子交换分离时，应综合考虑这些因素，进而选择最合适的离子交换柱。
常用的离子交换柱包括阴离子交换柱、阳离子交换柱和混合离子交换柱。
离子交换法分离出来的生物分子具有较高的纯度，但往往需要进行多次重复柱层析才能达到理想纯度。
2、凝胶过滤法凝胶过滤是最常见也是最简单的生物分子分离方法，它是利用凝胶颗粒的孔隙在生物分子样品中分子量大分子分离的方法。
大分子将通过直接流过凝胶颗粒填充层析柱时逐渐逼近凝胶颗粒的空隙，并逐渐进行“筛分”，从而被分离并纯化。
但凝胶颗粒的孔隙大小、分子量很容易受温度、pH值、离子强度等因素的影响，因此凝胶过滤应被认为是一种初步纯化方法。
3、亲和层析法亲和层析法是将含有亲和剂的固定相与生物样品进行反应，从而将特定的生物分子与固定相柱壁产生结合。
分子分离技术
目录摘要 (1)关键词 (1)1前言 (1)2传统分离方法 (2)3现代分离方法 (3)3.1 色谱方法 (3)3.2 电泳技术及其它 (6)4展望 (8)参考文献 (9)生物大分子分离技术的发展现状姓名：陈绍勇学号：20124016016 专业：动物学摘要：生物大分子包括多肽、酶、蛋白质、核酸（DNA和RNA）以及多糖等。
生物大分子分离技术是生命科学研究中的关键技术之一。
当前, 各学科之间的交叉渗透为生物大分子分离技术的发展提供了更多的契机。
对以沉淀、透析、超滤和溶剂萃取为代表的传统分离技术, 以及色谱, 电泳等现代分离技术的发展概况、原理、特点及应用进行了综述。
并结合生命科学的发展现状, 展望了生物大分子分离技术的发展前景。
关键词：生物大分子, 传统分离方法,现代分离方法1前言生物大分子包括多肽、酶、蛋白质、核酸（DNA和RNA）以及多糖等。
生命科学的发展给生物大分子分离技术提出了新的要求。
各种生化、分子研究都要求得到纯的, 以及结构和活性完整的生物大分子样品, 这就使得其分离技术在各项研究中起着举足轻重的作用。
对生物大分子分离技术的研究和开发也就应运而生。
而且随着各学科之间的交叉渗透, 材料化学、自动化技术等学科的发展也为生物大分子分离技术的发展提供了更多的契机。
生物大分子的制备具有如下主要特点：生物材料的组成极其复杂; 许多生物大分子在生物材料中的含量极微, 分离纯化的步骤繁多, 流程长; 许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境就极易失活（因此分离过程中如何防止其失活, 就是生物大分子提取制备最困难之处） ; 生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的, 温度、pH 值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响, 很难准确估计和判断[1] 这些都要求生物大分子的分离技术以此为依据, 突破这些难点, 优化分离程序, 以获得符合要求的生物大分子样品。
2传统分离方法常用的传统生物大分子分离方法有沉淀、透析、超滤和溶剂萃取等。
生物大分子分离纯化技术之层析(色谱)技术(56页)
生物大分子分离纯化技术
当流动相中所含的混合物经过固定相就会与固定 相发生作用。由于混合物中各组分在结构和性质上存 在差异，它们与固定相发生作用的大小、强弱就有差 异。因此，在同一条件下，不同组分在固定相中滞留 时间不同，从而按先后不同次序从固定相中流出。这 种借在两相间分配的原理而使混合物中各组分离的技 术，称为色谱分离技术或色谱法，又称色层法、层析 法。
生物大分子分离纯化技术
塔板理论是基于热力学近似的理论，在真实 的色谱柱中并不存在一片片相互隔离的塔板，也 不能完全满足塔板理论的前提假设。如塔板理论 认为物质组分能够迅速在流动相和固定相之间建 立平衡，还认为物质组分在沿色谱柱前进时没有 径向扩散，这些都是不符合色谱柱实际情况的， 因此塔板理论虽然能很好地解释色谱峰的峰型、 峰高，客观地评价色谱柱地柱效，却不能很好地 解释与动力学过程相关的一些现象，如色谱峰峰 型的变形、理论塔板数与流动相流速的关系等。
液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃柱在室温及 常压下进行起来，又补充了气相色谱法的内 容。根据液相色谱的特点，可称做高效、高压、高速和现 代液相色谱法。液相色谱法不论在仪器还是柱填料方面均 发展很快。
生物大分子分离纯化技术
层析（色谱）法分类
样品中的离子与离子交换树脂上的离子的交换反应过程可用下式表示：
阳离子交换
树脂-SO3-H++M+ 阴离子交换
树脂-SO3-M++H+
树脂-NR3+Cl-+X- 树脂-NR3+X-+C1-
生物大分子分离纯化技术
(四)空间排阻色谱法 (五)亲和色谱法
生物大分子分离纯化技术
塔板理论
塔板理论是色谱学的基础理论， 塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待 分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每 一个塔板内组分分子在固定相和流动相 之间形成平衡，随着流动相的流动，组 分分子不断从一个塔板移动到下一个塔 板，并不断形成新的平衡。一个色谱柱 的塔板数越多，则其分离效果就越好。
海洋微生物的分离与鉴定研究
海洋微生物的分离与鉴定研究第一章：引言海洋微生物是海洋生态系统中最丰富多样的生命形态之一。
它们在海洋生态系统中扮演着重要的角色，例如维持海洋生态平衡和参与有机物分解循环等。
近年来，随着现代分子生物学和生物技术的发展，对海洋微生物的分离和鉴定研究也取得了显著进展。
本文将对海洋微生物的分离和鉴定研究进行介绍和讨论。
第二章：海洋微生物的分离方法海洋微生物的分离方法主要包括传统分离和现代分离两种方式。
传统分离方法是基于微生物生理学和生态学的研究原理，利用不同菌株的生长条件、生长速率和生理代谢差异等特征进行筛选和分离。
常见的传统分离方法包括表层沉淀、筛选培养基和微生物计数等。
现代分离方法则利用现代分子生物学技术和高通量筛选平台，对微生物进行高通量分离、筛选和鉴定。
常见的现代分离方法包括共培养方法、PCR扩增和转录组技术等。
第三章：海洋微生物的鉴定方法海洋微生物的鉴定主要基于其形态、生理代谢和分子生物学特征。
传统鉴定方法主要基于微生物生理学和生物化学的研究原理，包括形态学鉴定、生化鉴定和药敏试验等。
现代鉴定方法则利用分子生物学技术对微生物进行鉴定，包括16S rRNA序列分析、rpoB基因序列分析和比较基因组学分析等。
第四章：海洋微生物的应用研究海洋微生物的应用研究包括医药、食品、能源、环境等多个领域。
以医药领域为例，海洋微生物是重要的天然药物来源，如海洋真菌产生的头孢菌素和海洋细菌生产的抗生素等。
在食品领域，海洋微生物也具有重要的应用前景，例如海洋藻类可以提取富含蛋白质和营养物质的食品材料。
此外，海洋微生物还可以被用作生产能源、处理废水等环境保护领域。
第五章：海洋微生物的前景与展望随着现代分子生物学和生物技术的不断发展，海洋微生物的分离和鉴定技术也将得到不断提高和完善。
未来，海洋微生物在多个领域的应用前景将继续扩大，为人类的生活健康和环境保护等方面作出更大的贡献。
同时，我们也需要更深入地了解海洋微生物在海洋生态系统中的作用和意义，保护海洋生态系统，维护自然生态平衡。
化学反应中的生物大分子的分离纯化技术及应用研究
化学反应中的生物大分子的分离纯化技术及应用研究随着人类对生命科学的研究与深入，生物大分子在生命科学领域中发挥着越来越重要的作用。
然而，想要从复杂的生物体系中获取纯净的生物大分子是一项相当艰巨的任务。
在化学反应中，为了获取纯净的产物，我们可以通过一系列的化学反应、溶剂萃取、蒸馏、结晶等步骤来进行分离纯化。
类似地，生物大分子也需要专业的分离纯化技术来获得单一、纯净的样品。
本文将重点介绍当前常用的生物大分子分离纯化技术及其应用研究。
一、凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法（Gel Filtration Chromatography）也称为分子筛层析法，是其中的一种分离技术，是利用分子筛过滤作用，通过大小分离生物大分子的方法。
也就是说，当一个混合物在溶液中进行层析时，它们将按大小顺序逐渐与凝胶内的微孔隔离出来。
而较大的生物大分子将无法通过凝胶微孔，而较小的物质则可随着溶液进一步深入凝胶内部，最终通过洗脱。
凝胶过滤层析法的主要优点是操作简单，具有较好的纯化效果。
它特别适用于大分子的纯化，例如酶、蛋白质、多肽、高分子以及其它具有不同分子量的物质混合物的分离。
凝胶过滤层析法被广泛应用于生物学、有机化学、生物制药等领域。
二、离子交换层析法离子交换层析法（Ion-exchange chromatography），是指利用固定正、负离子的功能基团，与可带电荷的分子间的相互作用力，实现对样品分离纯化的技术。
离子交换层析法的选择与离子交换柱的理化性质、样品离子性质和操作条件有关。
离子交换层析法的主要优点是它是一种高效、简便、快速并且基本上不损害生物大分子的分离纯化方法。
在生物大分子的纯化过程中，如果杂质物质与目标物质都带有电荷，离子交换层析是非常好的选择。
离子交换层析可以用于酸性、碱性、中等等多种环境下的分离纯化。
三、膜过滤分离技术膜过滤技术（Membrane Filtration）是指利用膜的结构及其物理化学理性，在分离过程中分离溶液体系。
生物大分子的分离和纯化技术
生物大分子的分离和纯化技术生物大分子是指具有较大分子量的生物分子，如蛋白质、核酸、多糖等。
要研究这些生物大分子的结构和功能，需要对它们进行分离和纯化。
生物大分子的分离和纯化技术是生物学和生物工程学中的重要内容，它们的发展和应用使得我们能够更深入地了解生命的奥秘，同时也推动了医药、农业、工业等领域的发展。
生物大分子的分离和纯化需要经过多个步骤，这些步骤通常包括细胞破碎、分子分离、分子鉴定等。
其中，分子分离是最基本、最关键的步骤之一，它可以使得目标分子从复杂混合物中被分离出来，并得到相对纯度较高的产物。
目前，生物大分子的分离和纯化技术包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、尺寸排除层析、逆向相色谱层析和高效液相色谱层析等方法。
凝胶过滤层析是一种基于分子尺寸差异的分离方法。
在这种方法中，样品被加入到一列凝胶柱中，较大的分子无法穿过凝胶孔隙，而较小的分子则可以顺着凝胶孔隙通过。
因此，随着溶液通过凝胶柱，不同大小的分子会被分离出来。
这种方法适用于大小分子差异较大的生物大分子的分离。
离子交换层析是基于分子电荷的分离方法。
在这种方法中，一种带有正电荷或负电荷的树脂被用来吸附目标分子，通过控制溶液的pH和离子强度等参数，可以使得目标分子从树脂上逐渐被洗下来。
这种方法适用于分子之间的电荷差异较大的生物大分子的分离，如蛋白质。
亲和层析是一种基于分子亲和性的分离方法。
在这种方法中，一种特殊的树脂被用来吸附具有特定结构或性质的目标分子。
例如，可以将某种亲合剂固定在树脂上，然后用于吸附与该亲合剂有特异结合关系的目标分子。
这种方法适用于具有高度特异性活性的生物大分子的纯化。
尺寸排除层析是一种基于分子形状的分离方法。
在这种方法中，一种具有多孔性的材料被用来吸附目标分子，具有大分子尺寸和形状的目标分子沿着孔隙穿过，而具有小分子尺寸的分子则通过孔隙空隙。
这种方法常用于分离蛋白质和糖类等生物大分子。
逆向相色谱层析是一种基于亲水性的分离方法。
生物活性物质的分离纯化与结构分析
生物活性物质的分离纯化与结构分析生物活性物质是指具有一定的生物学活性和功能的化学物质，包括生物分子、天然产物和药物等。
对于这些物质的提取、分离和纯化以及结构研究，一直是生物化学、药学、医学等研究领域中的热点问题。
本文将从从分离纯化的方法、技术，以及结构分析入手，探讨生物活性物质研究的相关知识。
一、生物活性物质的分离纯化方法生物活性物质一般是复杂的混合物，包括多种成分。
如何从中分离出目标成分并纯化至足够的程度成为分离纯化技术的关键所在。
以下将介绍几种常用的分离纯化方法：1. 薄层层析法薄层层析法是利用结果分子在不同介质（多以硅胶、氧化铝、硅胶钙等为基质）上的吸附和分配特性进行分离纯化的一种方法。
该方法可用于富集生物样品中的目标分子，快速、简便、经济，适用于小分子的分离纯化。
2. 柱层析法柱层析法是用柱状填料作为固相基质，通过溶液在固相基质上的分配和吸附特性，对细胞结构或混合液中的大分子进行分离纯化的方法。
柱层析法操作方便，可以简单分离大分子的蛋白质和核酸等，利用分子量筛选不同分子量大小的蛋白质和富集其活性成分，也可用于中小分子自然化合物的纯化。
3. 电泳法电泳法是将样品分子经电荷分离在电场中移动，根据分子大小、形状、电荷等特性在电场中进行分离的一种方法。
电泳法广泛应用于核酸、蛋白质等大分子分离纯化和分子结构研究中。
二、分子结构分析方法在生物活性物质的分离纯化的基础上，为了了解目标分子的结构和性质，就需要进行分子结构分析。
下面将简略介绍几种常用的分子结构分析方法：1. 光谱学光谱学依据分子吸收、发射、散射、旋转、振动等各种不同的现象，研究分子的结构和特性的一些学科。
常用的光谱学技术有紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱、荧光光谱等，可以大大提高对于目标分子的了解和认识。
2. 质谱学质谱学是把目标分子进行过质子化处理，然后通过对离子进行光、电极、磁场等多个波长的激发，来得到离子的质荷比的法师。
该方法广泛用于蛋白质、药物等大分子物质的结构鉴定和质量分析。
cba磁珠法 -回复
cba磁珠法-回复磁性珠(cba磁珠法)是一种先进的生物分离和检测技术，广泛应用于生物医学领域。
本文将详细介绍cba磁珠法的原理、应用和未来发展方向。
一、cba磁珠法的原理cba磁珠法是一种基于磁性珠的生物分离和检测技术。
其原理是通过抗体与磁性珠的结合，实现对目标生物分子的特异性识别和分离。
磁性珠是一种具有磁性的微粒，可在外加磁场的作用下快速分离和固定。
通过将特异性抗体与磁性珠进行结合，可以选择性地捕获目标生物分子。
二、cba磁珠法的应用cba磁珠法在生物医学领域具有广阔的应用前景。
以下是一些常见的应用领域：1. 生物分离与富集：cba磁珠法可以用于细胞、DNA、RNA、蛋白质等生物分子的分离与富集。
通过将特异性抗体与磁性珠结合，可以高效地分离出感兴趣的生物分子，从而为后续的研究提供了优质样品。
2. 分子诊断：cba磁珠法可以用于疾病诊断和检测。
通过结合适当的抗体和磁性珠，可以选择性地捕获特定的疾病标志物，从而实现疾病的早期诊断和准确监测。
3. 药物研发：cba磁珠法在药物研发中起着重要作用。
通过特异性抗体和磁性珠的组合，可以高效地筛选出具有治疗潜力的药物靶点，加快药物研发过程。
4. 生物传感器：cba磁珠技术也可以应用于生物传感器的构建。
将特异性抗体和磁性珠结合后，可以构建出高灵敏度和高选择性的生物传感器，用于检测微量的生物分子。
三、cba磁珠法的未来发展方向cba磁珠法作为一种先进的生物分离和检测技术，仍有许多发展空间和潜力。
以下是一些未来发展方向的展望：1. 提高分离和富集效率：近年来，磁珠材料和抗体修饰技术取得了重大进展。
未来的研究应致力于进一步提高分离和富集效率，使得cba磁珠法在生物分离领域具有更广泛的应用。
2. 开发多功能磁珠：目前，cba磁珠通常针对单一细胞或分子进行分离。
未来的研究应致力于开发具有多功能的磁珠，以实现同时分离和富集多种目标生物分子的需求。
3. 探索新的应用领域：虽然cba磁珠法已经有了广泛的应用，但仍有许多新的应用领域等待开发。
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•用于单细胞或干细胞集落的转移及单细胞PCR技术的准备 •内径为30μm，50μm，80μm，150μm或220μm
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•利用一次性塑料枪头 •用于转移在半固体培养基中的细胞集落如甲基纤维素中的杂交瘤 •内部直径500微米或1100μm
生物分子的异构体分离和鉴定
生物分子的异构体分离和鉴定生物分子是生命活动的基本单位，如蛋白质、核酸、多糖等，其中又存在着众多的异构体。
异构体指的是结构相似但物理性质却不同的分子，通常是由于它们的立体构型发生了改变。
而这些异构体的分离和鉴定对于生命科学的研究有着重要意义。
一、异构体分离技术1.1 蛋白质异构体的分离蛋白质存在不同结构、不同功能的异构体，如同工异构酶、同源异构体等。
这些异构体的分离可采用各种技术，如凝胶电泳、高效液相色谱、离子交换层析等。
其中，凝胶电泳是最常见的方法之一，该方法可以根据蛋白质的分子量来分离不同异构体。
但是，对于分子量相似的异构体，这种方法不是很有效。
高效液相色谱和离子交换层析则是针对分子量相似而结构差异较大的异构体的有效手段。
1.2 核酸异构体的分离核酸也存在不同结构、不同功能的异构体，如3’单磷酸末端、5’双磷酸末端、磷酸二酯键羟基等。
核酸异构体的分离可以使用电泳和色谱技术，其中，高效液相色谱是较为有效的方法之一。
同时，离子交换层析和亲和层析也被广泛应用于核酸异构体的分离中。
1.3 其他生物分子异构体的分离多糖、脂质、代谢物等生物分子都存在不同结构、不同功能的异构体。
这些异构体的分离可以通过各种方法实现，如凝胶过滤、离子交换层析、疏水相互作用层析等。
二、异构体鉴定技术2.1 质谱技术质谱技术是一种重要的分析方法，可以通过对分子的离子化和质荷比的分析来确定其分子量和结构信息。
这种方法被广泛应用于蛋白质、核酸、甘露醇等生物分子异构体的鉴定中。
2.2 核磁共振技术核磁共振技术是另一种重要的分析方法，可以分析分子的结构和动态信息。
这种方法被广泛应用于蛋白质、核酸等生物分子异构体的鉴定中。
2.3 微波光谱技术微波光谱技术是一种新兴的分析方法，可以分析生物分子的结构和功能信息。
这种方法具有非破坏性、高灵敏度和高选择性等特点，被视为生物分子异构体分析的重要手段。
三、总结与展望生物分子的异构体分离和鉴定对于生命科学的研究和应用具有重要意义。
新一代中国色谱学科的领路人——中国科学院大连化学物理研究所张玉奎院士介绍
新一代中国色谱学科的领路人——中国科学院大连化学物理研究所张玉奎院士介绍张玉奎院士作为《色谱》杂志的现任主编，在色谱学术领域取得的突出成就，被公认为是继卢佩章院士后，中国色谱学科的新一代领路人。
张院士自1965年南开大学毕业后，一直从事色谱基础理论及新技术开发应用研究工作，包括气相色谱、液相色谱、毛细管电泳及电色谱、径向膜色谱、生物色谱等方面，其中“高效液相色谱柱”、“柱色谱多元分离理论”、“智能色谱仪”、“径向色谱柱”等七项成果分别获中科院、辽宁省科技进步奖和自然科学奖。
近年来，张院士将研究重点转向对国家科学研究发展具有战略意义的蛋白质组学研究方向。
作为“973”项目“蛋白质组新技术和新方法研究”首席科学家，发展了多维色谱、微酶在线反应器等多种创新性技术，为蛋白质组研究的高效分离与高灵敏表征提供了系列新的研究手段。
张玉奎先生于2003年当选为中国科学院院士，现任中国科学院大连化学物理研究所研究员、博士生导师，兼任中国化学会色谱专业委员会主任、中国分析测试协会副理事长、中国色谱学会理事长、色谱杂志主编、分析化学、J. Chromatography A等杂志编委。
曾任大连化学物理研究所副所长、国家色谱研究分析中心主任。
中国色谱网近五十年的色谱研究生涯张玉奎院士生于1942年，河北省保定市人。
高中放暑假到河北农业大学勤工俭学时，该校一位前辈在谈到理想时讲到：“如果想搞研究，往大了讲就去研究天文，研究宇宙；往小了讲就去研究分子，研究物理和化学。
”受这句话的熏染，张院士于1960年考入南开大学化学系。
/article/61906-1.shtml1965年，张玉奎从南开大学毕业后，被分配到大连化学物理研究所（以下简称为“大化所”）工作，在这里遇到了在他色谱研究生涯中最重要的一个人：卢佩章院士，由于大学里所学的是化学物理专业，张玉奎被卢佩章院士安排从事色谱研究工作，因为工作认真负责、能力突出、团结同事，张玉奎被卢院士作为重点对象进行培养，先后担任卢院士的助手和学术秘书，后来又和卢院士一起共同培养研究生。
色谱分离技术的研究现状和应用前景
色谱分离技术的研究现状和应用前景随着生物技术的飞速发展，人们对生物分子的研究和应用越来越广泛。
在这个过程中，高效和准确的色谱分离技术起到了至关重要的作用。
色谱分离技术是一种重要的生物分析方法，其主要作用是分离和纯化混合物中的各种化合物。
在分析复杂混合物和制备高纯度物质时，色谱分离技术被广泛应用。
本文将探讨色谱分离技术的研究现状和应用前景。
一、色谱分离技术的研究现状色谱分离技术是指将需要分离的化合物在一定条件下通过某种分离材料，如液相或固相材料等，按照其物理化学性质进行分离和纯化的技术。
在色谱分离技术的基础上，发展出了很多不同的色谱分离方法，如高效液相色谱（HPLC）、毛细管电泳（CE）和气相色谱（GC）等。
HPLC是常用的生物分析技术之一。
在HPLC中，需要分离的混合物通过高压下顺次通过色谱柱中的填料进行分离。
HPLC的分离效率高，分离过程控制简单，且可在线检测，成为生物分析的重要工具。
与之相比，毛细管电泳（CE）是一种以电动力为驱动力的微型色谱分离技术。
其分离原理是利用电场将需要分离的离子或分子在毛细管内进行拖曳，不同化合物或传感器可以在很短的时间内被快速分离，具有分离效率高、耗材少等优点。
气相色谱（GC）是一种利用气相为流动相、高温下将样品的挥发性组分分离、定量的方法。
GC具有分离效率高、灵敏度高、重复性好等优点，广泛应用于药物分析和食品检测等领域。
二、色谱分离技术的应用前景随着生物技术的飞速发展，新兴生物分析技术正在不断涌现。
在这个过程中，色谱分离技术作为基石型的技术之一，得到了不断的升级和改进，越来越多地应用于实践中。
色谱分离技术在医学、食品安全以及农村健康等领域有广泛应用。
医学领域，例如利用HPLC技术分离血液中的活性蛋白质，有助于了解机体的代谢、分泌、抵御感染等方面的情况，为医学诊断和治疗提供了基础。
在食品安全方面，色谱分离技术被广泛用于检测食品中的有毒、有害物质，如农残、重金属和其他有害化学物质。
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国家重点基础研究发展计划（重大科学研究计划）课题年度报告项目编号：2012CB910600项目名称：蛋白质定量新方法及相关技术研究课题编号：2012CB910602课题名称：基于色谱-质谱的蛋白质组相对定量新方法和新技术2012年12月1日一、年度计划执行情况1．年度计划完成情况按照项目年度计划要求，本年度重点开展了18O标记结合二甲基化标记的二级质谱定量的新方法；开展了iTRAQ 结合18O标记相对定量技术；发展了针对非标记定量技术的归一化新算法；和编写了定量软件pQuant。
按项目任务书的规定，完成了研究内容和预期目标。
在二级质谱定量方面：发展了18O标记结合二甲基化标记的二级质谱定量新方法。
该方法针对目前所发展的基于二级质谱by离子定量方法的局限性，开发一种适用于所有蛋白样品分析、基于常规的胰蛋白酶酶解、价格低廉的等重标记的b, y离子对二级质谱定量方法，对定量蛋白质组学研究具有重要的现实意义。
在目标糖蛋白质定量方面：发展了iTRAQ 结合18O标记相对定量技术。
该方法用18O酶促标记，在糖基化位点处引入质量标签，可实现糖肽的定量；在肽段层面上引入iTRAQ质量标签，可实现多组样品的同时定量；并且由于在糖肽、非糖肽中均引入了质量标签，可以实现糖基化程度和蛋白水平的同时定量。
在二级质谱定量的算法方面：发展了通过提取串级质谱中b，y 碎片离子对的峰强度信息来得到肽段和蛋白的定量信息的ITMSQ算法。
为了避免串级质谱图中b，y碎片离子对共碎裂谱图对肽段正确定性的影响，在ITMSQ定量软件中加入了一个“谱图拆分”优化模块后，显著减少了b，y 碎片离子对共碎裂谱图对正确定性和定量的影响。
在非标记定量的算法方面：发展了一种归一化新算法：以两种二级谱碎片离子强度SI (Spectral Index) 和SMT (Summed MS/MS TIC) 作为蛋白质丰度表征值，以蛋白长度作为校正因子的归一化算法NSI (Normalized SI/L) 和NSMT (Normalized SMT/L)，显著降低了定量的RSD值。
在定量软件开发方面：编写了pQuant软件，设计了可以识别干扰色谱峰的打分算法Interference Score，将该算法整合入定量软件pQuant后，使得pQuant的定量准确性较常见定量软件Census有很大提高。
发表SCI 论文21 篇；申请国家发明专利1个，授权发明专利1个。
2. 研究工作的主要进展2.1 建立了18O标记结合二甲基化标记的二级质谱定量的新方法为解决之前所发展的二级质谱定量IV ATAL方法只适合于细胞培养样品的问题，使之可以适用于更广泛的样品来源，包括组织等，以及不能使用常用的胰蛋白酶、定量率低的问题，发展了18O标记结合二甲基化标记的二级质谱定量的新方法。
将两组对照样品的胰蛋白酶酶解肽段分别在H216O或H218O水中进行胰蛋白酶催化的标记反应，所有以赖氨酸（Lys，K）和精氨酸（Arg，R）结尾的酶解肽段的C-末端会被标记上两个16O或18O原子，产生4 Da的差异。
标记肽段经胍基化修饰后，分别进行二甲基化标记，其中16O标记的样品与氘代甲醛（CD2O）反应，18O标记的样品与甲醛（CH2O）反应。
这样两组样品中的相同肽段实现了等重标记，在一级质谱（MS1）中重叠成单峰，但是在二级质谱（MS2）中产生成对的b, y离子对。
用标准蛋白对该方法的考察结果显示：该方法有很好的准确性和重现性，在10倍以内有很好的线性关系（R2＞0.99）。
对肝癌患者癌症组织样品和癌旁正常组织样品的蛋白质组进行相对定量分析，总共定量到124个显著变化的蛋白质，其中上调45个，下调79个。
很多蛋白质的变化与之前文献报道的变化一致，说明此方法可以应用于大规模实际样品的分析，得到的结果准确、可靠。
2.2 发展了“iTRAQ plus 18O标记相对定量技术该工作旨在建立适用于多样本，稳定快速的高通量糖基化位点占有率分析的方法，为目标糖蛋白宏观不均一性的研究提供技术手段。
采用iTRAQ和18O 两种标记方法，即采用iTRAQ标记非糖肽和糖肽，18O标记糖基化位点，放大串联四极杆飞行时间质谱仪的母离子检测窗口。
将此项技术运用于正常人(N)及肝病(肝癌HCC、肝硬化LC，肝炎HBV)患者血清中结合珠蛋白血清β亚基四个糖基化位点占有率的研究，发现结其Asn241糖基化位点占有率在肝癌血清中显著升高，有着重要的潜在诊断价值。
该技术一方面实现了目标糖蛋白质在糖基化修饰水平和蛋白水平的同时定量，另一方由于18O在糖基化位点处引入标记，提高了糖基化位点鉴定的准确性。
2.3 发展了二级质谱定量的算法为了使Isobaric MS2定量方法得到广泛应用，基于IVTAL方法和SEQUEST 搜索引擎，以及Perl语言和Matlab软件，独立开发了一个新的定量分析软件，Isobaric Tandem MS Quantitation (ITMSQ)，该软件主要是通过提取串级质谱中b，y 碎片离子对的峰强度信息来得到肽段和蛋白的定量信息，ITMSQ不仅可以用于IVTAL方法的定量，而且可以用于所有的Isobaric MS2 定量方法，包括IPTL 和iMSTIQ。
另外，为了避免串级质谱图中b，y碎片离子对共碎裂谱图对肽段正确定性的影响，在ITMSQ定量软件中加入了一个“谱图拆分，spectrumsplitting”优化模块，利用b，y碎片离子对存在固定质量差异的特征，将b，y 碎片离子对共碎裂谱图进行拆分，得到单独的两组标记细胞的碎裂谱图，然后经过数据库搜索重新进行肽段和蛋白定性和定量分析，从而减少b，y 碎片离子对共碎裂谱图对正确定性和定量的影响。
利用IVTAL 方法标记的HeLa 细胞产生的质谱数据，IVTAL 方法的上下调变化蛋白的界限得到了确定。
另外SEQUEST 数据库搜索时b，y 离子对的质量偏差和ITMSQ 软件提取b，y离子对时离子强度对IVTAL方法定量准确度的影响，也进行了考察。
ITMSQ定量软件中加入了一个“谱图拆分”优化模块后，显著减少了b，y 碎片离子对共碎裂谱图对正确定性和定量的影响。
2.4 发展了针对非标记定量技术的归一化新算法针对非标记定量基于二级质谱的算法准确度不高、低丰度蛋白质难以定量的问题，发展了以两种二级谱碎片离子强度SI (Spectral Index) 和SMT (Summed MS/MS TIC) 作为蛋白质丰度表征值，以蛋白长度作为校正因子的归一化算法NSI (Normalized SI/L) 和NSMT (Normalized SMT/L)。
以酵母提取蛋白，并依次含有3倍差异的UPS1标准蛋白混合物（UPS1由48个等摩尔的标准蛋白混合而成）对所建立的方法进行评价，表明NSMT在计算蛋白变化倍数方面最优；NSI在全FDR范围均最优，说明NSI更适合用于检测差异蛋白。
而采用18个标准蛋白混合物重复十次进样的公共测试数据集检验归一化的效果，发现归一化前后18个蛋白十次定量结果的平均RSD可以从约47%下降到约30%，表明了对二级谱碎片离子强度SI及SMT进行归一化操作的必要性。
2.5 开发了定量软件pQuant该软件主要能够分析基于一级谱的标记定量方法产生的数据，如SILAC标记方法等。
重点解决影响一级谱标记定量结果准确性的最主要因素是肽段近质量共洗脱干扰问题。
针对该问题，我们设计了可以识别干扰色谱峰的打分算法Interference Score。
该算法对各同位素峰色谱峰之间的相似程度进行计算，相似度高的认为来自正确的肽段信号，相似度低的认为是干扰信号。
在排除干扰信号后，再计算定量结果。
将该算法整合入定量软件pQuant后，我们选择一批轻重1:1混合的SILAC标记HeLa细胞样品，并将pQuant和与国际主流软件Census进行了对比。
结果显示，pQuant的定量比值（取log2变换后）方差为0.4，Census 的定量比值（取log2变换后）方差为0.8，说明pQuant的定量准确性较Census有很大提高。
二、重要阶段性成果或突破（每项300-500字，另附图片）2.1 18O标记结合二甲基化标记的二级质谱定量的新方法发展了一种适用于更广泛的样品来源，包括组织等的二级质谱b y离子定量新方法。
该方法解决了之前所发展的二级质谱定量IV ATAL方法只适合于细胞培养样品的问题，使之可以适用于更广泛的样品来源，包括组织等，以及不能使用常用的胰蛋白酶、定量率低的问题，发展了18O标记结合二甲基化标记的二级质谱定量的新方法。
(J Proteomics，2012, 75:5797)。
具体流程如图1。
两组待分析的蛋白样品经胰蛋白酶酶解后，分别在H216O 或H218O中进行胰蛋白酶催化的16O或18O标记，所有酶解肽段的C-末端都标记上两个16O或18O，产生4 Da的质量差异。
随后的胍基化修饰将所有肽段中的Lys转化为高精氨酸以封闭其氨基的反应活性，产生42 Da的质量增加。
接着，两组样品分别进行肽段N-末端二甲基标记，其中16O标记的样品与CD2O反应，肽段N-末端加上32 Da，18O标记的样品与CH2O反应，肽段N-末端加上28 Da。
于是两组不同样品中的相同肽段经标记后，最终质量相等，在MS1谱图中重叠成单峰，而在MS2谱图中产生成对的b，y离子对。
其中b离子对中高质量的碎片离子来源于CD2O标记的样品A，低质量的碎片离子来源于CH2O标记的样品B；y离子对中高质量的碎片离子来源于18O标记的样品B，低质量的碎片离子来源于16O标记的样品A。
多对b, y离子对用于计算肽段的比值，即一条肽段多个定量信息，有效降低了定量的随机误差，从而大大提高了肽段和蛋白的定量准确性。
图1 18O标记结合二甲基化标记的二级质谱定量的新方法示意图。
为了考察IMS2Q[18O+DM]方法定量的动态范围，将两份等量的标准蛋白BSA、myoglobin 和cytochrome c 进行酶解、IMS2Q[18O+DM]方法标记，然后按照18O/16O（即CH2O/CD2O）的比例1:10、1:8、1:4、1:2、1:1、2:1、4:1、8:1、10:1 混合，进行质谱分析（图2），发现IMS2Q[18O+DM]方法对于3个标准蛋白在1:10～10:1 动态范围内均有很好的定量线性（R2﹥0.99）和重现性(图3)，说明IMS2Q[18O+DM]方法可以在较宽的动态范围内实现高准确性、高重现性的蛋白定量，为其应用于复杂的实际蛋白样品定量分析提供保证。
对标记后的样品进行了反相色谱效应考察，发现标记后样品的肽段在反相色谱中流出时间一致，无同位素效应。