研究生分子生物学实验讲解
分子生物学实验讲义.
分 子 生 物 学 实 验 讲 义内蒙古科技大学数理与生物工程学院自治区基础生物实验示范中心基础生物教学部2009年10月目录实验一质粒DNA的小量提取实验二琼脂糖凝胶电泳实验三大肠杆菌感受态细胞的制备实验四大肠杆菌感受态细胞转化宿主细胞实验五聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片断实验六重组DNA分子的构建实验七质粒DNA的酶切和电泳鉴定实验八植物基因组DNA的提取实验九植物基因组总RNA的提取实验十与人类遗传病相关的核苷酸重复序列的克隆实验一 质粒DNA的小量提取一、目的要求1、掌握用碱变性法提取质粒DNA的技术2、掌握用分光光度计测定DNA浓度的方法二、基本原理在染色体外能自主复制且稳定遗产的遗传因子称为质粒，大小在1kb-200kb 之间，是双链闭合环状的DNA分子。
在细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中都发现有质粒存在，其中细菌质粒存在最为普遍，在基因工程中常用作基因载体。
碱变性法又称碱抽提法或碱裂解法，是一种用的最广泛的制备质粒DNA 的方法，此法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。
在pH高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会分离。
当以pH4.8的NaAc高盐缓冲液调节起pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。
通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
三、仪器、材料和试剂（一）仪器微量移液器、微量离心管（又称Eppendorf管）、常用玻璃器皿、台式高速离心机、分光光度计（二）材料含有质粒的大肠杆菌DH5a（三）试剂及溶液LB培养基、葡萄糖1、用于碱法提取质粒DNA的溶液溶液1（GET）缓冲液：50mmol/L葡萄糖，10mmol/L EDTA，25mmol/L Tris-HClpH8.0，用前加溶菌酶4mg/Ml。
分子生物学实验技术实验内容讲解
2006年《分子生物学实验技术》实验内容一、RT-PCR（一）总RNA的提取实验安排：每两人抽提一管。
为了使操作同步以节省时间，各组样品请一起离心。
操作步骤：1、将100μl液体样品加入1.5ml Ep管中，再加入900μl冰预冷的LS-Biotragents TM（苯酚和异硫氰酸胍的混合物）。
2、将样品剧烈混合后，在室温放置5min。
3、加入200μl氯仿，颠倒Ep管混和两次，并剧烈振荡混和10s。
4、在4℃条件下，以10000×g离心15min。
5、将上层水相转移到一个新的Ep管中，加入等体积的异丙醇（Isopropanol）并混匀，然后在4℃放置至少10min。
6、在4℃条件下，以10000×g离心15min后，小心并尽可能地去除全部上清夜。
7、用1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀和管壁。
8、将RNA沉淀进行干燥（不能完全干燥）处理后，用10μl无RNase污染的水（RNase-Free Water）将RNA溶解并于-20℃保存。
注意事项：1、所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。
2、所用的塑料材料，如吸头、离心管等需用0.1% DEPC水浸泡过夜。
3、配制的溶液应尽可能用0.1% DEPC，在37℃处理12hr以上。
然后用高压灭菌除去残留的DEPC。
不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。
4、操作人员需在超净工作台上操作，并戴一次性口罩、手套，实验过程中手套要勤换。
（二）反转录实验安排：每人做一管。
反应体系（20μl）：按下列顺序加样反应条件：42℃ 1h注意事项：1、加样时，一般从体积大的开始加，样品最后加。
如在一般的PCR反应体系中，应先加水、Buffer、dNTPs、引物，最后加酶和模板。
2、液体应直接加到管底，且每加一种试剂后应更换新的吸头。
3、加完所有试剂后，应用手指轻弹混匀，然后低速离心数秒以收集管壁上沾有的液体。
分子生物学实验讲义
实验一植物基因组DNA的分离一、相关知识分离植物DNA是分子生物学实验的一个基本要求。
不同的研究目的对DNA的纯度和量的要求不尽相同。
例如，在构建用于筛选植物基因或其他诸如RFLP这样的遗传标记基因组DNA文库时，需要使用高相对分子质量、高纯度的DNA；而在进行遗传分析时，对DNA的纯度要求就可以低一些。
一般而言，一个好的DNA分离程序应符合以下三个主要标准：（1）所得DNA的纯度应满足下游操作的要求，用于RFLP分析的DNA，其纯度的要求为可用限制性内切酶完全酶解并可成功地转移到膜上进行Southern杂交；用于PCR分析的DNA则不应含干扰PCR反应的污染物；（2）所得DNA应当完整，电泳检查时可给出精确性高、重复性好的迁移带型；（3）所得的DNA应有足够的量。
如果对植物进行大规模筛选，还应当满足操作程序应当快速、简便、价格低廉，并尽可能避免使用有毒试剂这样的要求。
二、实验原理植物DNA的提取程序应包括以下几项：首先，必须粉碎（或消化）细胞壁以释放出细胞内溶物。
分离总基因组DNA常用的破壁方法是将植物组织胀水，然后研磨成细粉；或者将新鲜植物组织在干冰或液氮中快速冷冻后，用研钵将其磨成粉沫。
其次，必须破坏细胞膜使DNA释放到提取缓冲液中，这一步骤通常靠诸如SDS或CTAB一类的去污剂来完成。
去污剂还可以保护DNA免受内源核酸酶的降解。
通常提取缓冲液中还包含EDTA，它可以螯合大多数核酸酶所需的辅助因子——镁离子。
最后，一旦DNA释放出来，其剪切破坏的程度必须要降到最低。
剧烈振荡或Tip头小孔快速抽吸都会打断溶液中高相对分子质量的DNA。
分离高相对分子质量的DNA还只是工作的一部分。
因为在粗提物中往往含有大量RNA、蛋白质、多糖等杂质，这些杂质有时很难从DNA中除去。
大多数蛋白可通过氯仿或苯酚处理后变性、沉淀除去，绝大部分RNA则可通过经处理过的RNase除去。
但多糖类杂质一般较难去除，这些杂质浓度高时，往往用一些DNA纯化试剂盒来进一步纯化DNA。
分子生物学实验讲义
实验质粒DNA的碱裂解法提取与纯化一、实验原理细菌质粒是一类双链、闭环的DNA, 大小范围从1kb至200kb以上不等。
各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份, 通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态, 但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上, 随着染色体的复制而复制, 并通过细胞分裂传递到后代。
质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子, 重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取, 本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。
碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法, 其基本原理为: 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时, 蛋白质与DNA发生变性, 当加入中和液后, 质粒DNA分子能够迅速复性, 呈溶解状态, 离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状, 离心时可沉淀下来。
纯化质粒DNA的方法通常是利用了质粒DNA相对较小及共价闭环两个性质。
例如, 氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法, 但这些方法相对昂贵或费时。
对于小量制备的质粒DNA, 经过苯酚、氯仿抽提, RNA酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和RNA, 所得纯化的质粒DNA已可满足细菌转化、DNA片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求, 故在分子生物学实验室中常用。
二、实验试剂1.溶液Ⅰ: 50mM葡萄糖, 25mM Tris-HCl(pH 8.0), 10mM EDTA(pH 8.0）。
1M Tris-HCl(pH 8.0）12.5ml, 0.5M EDTA（pH 8.0）10ml, 葡萄糖4.730g, 加ddH2O至500ml。
在10 lbf/in2高压灭菌15min , 贮存于4℃。
2.溶液Ⅱ: 0.2N NaOH, 1% SDS。
2N NaOH 1ml, 10%SDS 1ml, 加ddH2O至10ml。
分子生物学实验报告
分子生物学实验报告重组质粒的pcr验证（目的基因的pcr扩增）姓名:xxx学号：xxx专业：xxx界别：xxx同组者：xxxx一．实验目的（1）自学掌控pcr反应的基本原理和实验技术。
（2）了解引物设计的基本要求。
1.pcr基本原理聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)，简称pcr，是一种分子生物学技术，用于在体外快速扩增dna，类似dna的细胞内复制过程:由一对引物介导，通过温度的调节，使双链dna变性为单链dna、单链dna能与引物复性（退火）成为引物-dna单链复合物、以及在dntps存在下dna聚合酶能使引物沿单链模板延伸成为双链dna（引物的延伸）；这种热变性-复性-延伸的过程，就是一个pcr循环；一般通过20-30个循环之后，就可获得大量的要扩增的dna片段。
pcr技术的基本原理类似dna的天然激活过程，其特异性依赖与靶序列两端优势互补的寡核苷酸引物。
pcr由变性--淬火--延展三个基本反应步骤形成：①模板dna的变性：模板dna经加热至90~95℃左右一定时间后，使模板dna双链或经pcr扩增形成的双链dna解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板dna与引物的淬火(复性)：模板dna经冷却变性成单链后，温度降到55℃左右，引物与模板dna单链的优势互补序列接合融合；③引物的延伸：dna模板--引物结合物在taqdna聚合酶的作用下，以dntp为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板dna链互补的复制链。
经过“变性—淬火—延展”三个过程就可以赢得代莱dna分子，而且这种崭新dna分子又可以沦为下次循环的模板。
因此，变性、淬火和延展循环反复25~30次后，即可从少量的模板dna中扩充出来大量的目的产物。
pcr引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板dna序列，因此，引物的优劣直接关系到pcr的特异性与成功与否。
分子生物学实验指导(精品文档)_共44页
分子生物学实验指导分子生物学实验课程的内容是从亚克隆一个基因直到最终表达出该基因产物的一个完整的科研项目。
以表达纳豆激酶为例，从已经克隆在pMD-18-T载体上的纳豆激酶酶原基因上用PCR扩增出837bp的纳豆激酶成熟肽基因片段，与T载体连接后转入DH5 菌中筛选鉴定，然后用双酶切下纳豆激酶成熟肽基因片段，插入带有6个组氨酸标签的原核表达载体pET-Trx，在表达菌BL(21)DE3中诱导表达出纳豆激酶蛋白质并用SDS-PAGE鉴定。
整套实验围绕纳豆激酶基因的亚克隆、重组、转化、筛选直到表达这一研究顺序进行操作。
其间共涉及学习约11种基因操作的基本技术，我们按这些操作技术出现的先后顺序分别编为实验一至实验十一。
各个实验之间具有很强的逻辑性和连贯性，前一个实验的结果就是下一个实验的原料。
整套实验设计实际上是一个基因操作实验平台，随时能根据需要更改外源基因和表达载体或进一步扩充实验内容。
我们在每年的教学实践中会不断增加目的基因和表达载体的种类，以便于学生实验小组能够从事不同的项目，减少雷同，增加兴趣。
分子生物学实验的宗旨是让学生在独立实践操作中学习分子生物学的基本研究方法和体会分子生物学研究的严密逻辑和科研理念。
实验教学的组织方式是科研项目式管理，即在教师的总体指导下，在给定的实验材料和实验条件的基础上，让学生独立思考、自行规划实验流程、制定实验计划、准备实验材料、动手操作、整理和分析实验结果，最后完成实验项目，写出实验论文。
因此学生在实验前要认真预习实验内容，结合学过的分子生物学原理，弄懂每一步实验的目的和原理，了解实验的内容和总体实验方案，写出分子生物学大实验《开题报告》，交教师审阅和讨论修改后才能进入实验室操作。
在实验过程中，教师不干涉学生的实验安排和操作程序，仅以导师的身份对学生的实验操作进行现场巡回指导、回答学生的疑问、为学生示范一些高档实验仪器和软件的使用，提供公用的试剂（如酶）等，并对学生的每一步实验结果进行评价和把关。
细胞分子生物学硕士实验课优选演示
（优选）细胞分子生物学硕士 实验课
基本实验
主要内容包括
核酸分离提取和定性定量
质粒和RNA提取 电泳
基因扩增和分析
PCR技术
转染和报告系统
细胞转染 荧光素酶报告
核酸制备和分析
最基本的实验技术
一、核酸分离纯化
核酸：
DNA为双链线性分子，在细胞中都以与蛋白质 结合的状态存在
特征 变性与复性中的紫外吸收 DNA与RNA特点
荧光染料法
通常结合电泳方法
核酸电泳定性定量
紫外吸收法
嘌呤和嘧啶在260 nm有特异的吸收峰,这 个性质用于核酸的分 析
DNA分子的变性
DNA双螺旋的有序结构受各种理化因子，如热、酸碱、变性剂、有 机溶剂以及稀释的作用，转变为无规则的线团结构。
DNA解链曲线
3.4 复性
复性：变性DNA分开的两股链在适当条 件下重新生成双链结构的过程
退火（annealing）:热变性的DNA经缓慢 冷却复性的过程。
测定结果分析
在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相 当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; 在RNA溶液中，加RNASIN冻贮于-70℃,可保存数年。
三、核酸电泳
凝胶电泳是分子克隆的中心技术之一。 1. 琼脂糖凝胶用于分离大于200～1000bp的片段; 操作简单、快速，且分离范围广 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离5－500bp的片段; 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就能分开， 能容纳相对大量的DNA
变性的特征 增色效应, 黏度和比旋下降，沉 降系数增加，生物学活性丧失
硕士分子生物学实验步骤
硕士研究生分子生物学及生化实验技术路线：HindIIIBamHIFGF9FGF 的PCR 扩增、回收HindIII 连接、转化BL21（DE3）阳性克隆的PCR 鉴定＋BamHI 酶切、回收HindIII ＋BamHI 酶切、回收pET30a(+) 质粒提取阳性克隆的酶切鉴定阳性克隆的诱导培养 目标蛋白的纯化一、感受态细胞的制备1．实验材料及试剂受体菌：BL21（DE3）、质粒pET-30a＋转化液：50mM CaCl2培养基：LB培养基(pH7.0) 121℃，20min 高压灭菌NaCl 5g/L酵母提取物5g/L胰蛋白胨10g/L2.．实验步骤1. 感受态细胞的制备1）活化的BL21（DE3）平板上挑取一单菌落，接种于100mL LB液体培养基中37℃振荡培养过夜。
2）取培养过夜的菌液100μL接种于100ml新鲜的LB培养基中，37℃振荡培养约5h。
3）每组取2支10ml离心管，各转入8ml菌液，4000r/min离心3min，收集菌体。
4）弃去上清液，在涡旋器上将细胞悬浮于冰冷的2mL 50mmol/L CaCl2溶液中，将2管合并为1管，并在冰上放置15-30min。
4000r/min离心3min。
5）弃去上清液，加入1ml冰冷的50mmol/L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，置冰上，即制成了感受态细胞悬液，可直接用于转化实验，也可加入占总体积20%左右高压灭菌过的甘油，混合后分装于Eppendorf管中，置于-70℃条件下，可保存6-12个月。
二、FGF的PCR扩增与回收（一）试剂电泳缓冲液（50×TAE）Tris 242g冰醋酸 57.1mlEDTA(0.5mol/L pH8.0) 100ml使用时用蒸馏水稀释50倍。
DNA快速纯化/回收试剂盒（二）方法1.PCR反应条件目的基因模板来源于质粒pcDNA3.1-FGF，将质粒稀释100倍，PCR反应采用50μl反应体系。
分子生物学实验教学教案
分子生物学实验教学教案一、实验原理1. 介绍分子生物学的定义和基本概念，理解分子生物学实验的目的和意义。
2. 掌握DNA提取、PCR扩增、DNA测序、基因克隆、蛋白质表达和纯化等基本实验技术。
3. 了解各种实验试剂的使用方法、实验仪器的操作和维护。
二、实验内容1. DNA提取与纯化2. PCR扩增目的基因3. DNA测序4. 基因克隆与载体构建5. 蛋白质表达与纯化三、实验材料与试剂1. 实验材料：细胞样本、DNA提取试剂、PCR反应体系、DNA测序试剂、基因克隆试剂、表达载体、细菌和酵母等。
2. 试剂：蛋白酶K、NaCl、EDTA、DNase、PCR酶、DNA连接酶、限制性内切酶、琼脂糖、DNA胶回收试剂、SDS等。
四、实验步骤与操作要点1. DNA提取与纯化：(1) 细胞裂解：向细胞样本中加入蛋白酶K和NaCl，充分混合后置于55-60℃水浴中保温1-2小时。
(2) 蛋白质去除：向上述混合物中加入SDS和DNase，充分混合后置于65℃水浴中保温1小时。
(3) DNA沉淀：向上述混合物中加入体积分数为70%的冷酒精，充分混合后置于-20℃冰箱中沉淀1小时。
(4) DNA纯化：将沉淀的DNA用70%的冷酒精洗涤两次，用无水酒精洗涤一次，空气中晾干。
2. PCR扩增目的基因：(1) 配制PCR反应体系：含DNA模板、引物、dNTPs、PCR酶等。
(2) PCR扩增：将反应体系置于PCR仪中，进行高温变性、低温复性和中温延伸等步骤。
(3) 琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
3. DNA测序：(1) 制备DNA测序模板：将PCR产物经过纯化后，作为测序模板。
(2) 进行DNA测序：使用DNA测序试剂和测序仪进行测序。
(3) 分析测序结果。
4. 基因克隆与载体构建：(1) 将目的基因插入到表达载体中。
(2) 将重组载体转化到细菌或酵母等宿主细胞中。
(3) 筛选和鉴定重组子。
5. 蛋白质表达与纯化：(1) 将重组质粒转化到表达菌株中，进行蛋白质表达。
分子生物学实验报告全解（有图有真相）讲解
分⼦⽣物学实验报告全解（有图有真相）讲解分⼦⽣物学实验报告慕蓝有志班梦想学院⽬录实验⼀细菌的培养 (2)实验⼆质粒DNA的提取 (4)实验三琼脂糖凝胶电泳法检测DNA (7)实验四质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 (9)实验五聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA (11)实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 (14)实验七RNA分离与纯化 (17)实验⼋RT-PCR扩增⽬的基因cDNA (19)实验九质粒载体和外源DNA的连接反应 (21)实验⼗感受态细胞的制备及转化 (23)实验⼗⼀克隆的筛选和快速鉴定 (25)实验⼗⼆地⾼⾟标记的Southern杂交 (27)实验⼗三阿拉伯糖诱导绿⾊荧光蛋⽩的表达 (31)思考题 (32)分⼦实验⼼得总结 (33)实验⼀细菌的培养⼀、⽬的学习细菌的培养⽅法及培养基的配置。
⼆、原理在基因⼯程实验和分⼦⽣物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因⽂库的建⽴等都离不开细菌。
特别是常⽤的⼤肠杆菌。
⼤肠杆菌是含有长约3000kb的环状染⾊体的棒状细胞。
它能在仅含碳⽔化合物和提供氮、磷和微量元素的⽆机盐的培养基上快速⽣长。
当⼤肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进⼊⼀个滞后期。
然后进⼊对数⽣长期，以20~30min复制⼀代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速⽣长的浓度时，菌体密度就达到⼀个⽐较恒定的值，这⼀时期叫做细菌⽣长的饱和期。
此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。
培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。
实验室中最常⽤的是LB培养基。
三、实验材料、试剂与主要仪器（⼀）实验材料⼤肠杆菌（⼆）试剂1. 胰蛋⽩胨2. 酵母提取物3. 氯化钠4. 1mol/L NaOH5. 琼脂粉6. 抗⽣素（氨苄青霉素、卡那霉素等）（三）仪器1. 培养⽫2. 带帽试管3. 涂布器4. 灭菌锅5. ⽆菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌⽛签等）6. 恒温摇床四、操作步骤（⼀）LB培养基的配制配制每升培养基，应在950m1去离⼦⽔中加⼊：细菌培养⽤胰蛋⽩胨10g细菌培养⽤酵母提取物5gNaCl 10g摇动容器直⾄溶质完全溶解，⽤1mol/L NaOH调节pH位⾄7.0。
分子生物学实验教学讲义
实验一人血液基因组DNA的提取1．吸取500μl 红细胞裂解液到一个1.5ml 离心管。
2．将抗凝全血（使用前回复到室温）颠倒混匀后，吸取100μl 加到上述装有红细胞裂解液离心管中，颠倒6-8 次，并倒置轻弹管壁，确保充分混匀。
3．室温放置10 分钟（期间应该颠倒轻弹混匀数次帮助裂解红细胞）。
4．12,000 rpm 离心20 秒，倒弃红色上清，并小心的尽可能多的吸弃上清（注意不要吸到管底的细胞团），留下完整的管底白细胞团和大约10μl 的残留上清。
离心后在管底应该见到白色的白细胞团，也可能有一些红细胞残片和白细胞团在一起，但是如果看到的是大部分的红色细胞团，说明红细胞裂解很不充分，应该再加入900μl 红细胞裂解液重悬细胞团后重复步骤3，4。
5. 涡旋振荡15 秒重悬白细胞团，充分分散白细胞团。
白细胞的重悬分散对下一步裂解非常重要，白细胞未打散就加入裂解液，会导致白细胞不能充分裂解，形成肉眼可见团块。
6．加入300μl 细胞核裂解液到重悬的白细胞，迅速有力吹打几次混匀以裂解白细胞，由于基因组DNA 立刻释放出来，这个时候混合物会马上变得十分粘稠，立刻停止吹打（以免剪切断基因组DNA），颠倒旋转离心管10 次保证裂解液和所有的白细胞接触并裂解。
这一步对是否获得满意的裂解效果和基因组完整性很关键。
吹打力量如果太小，不足以迅速将细胞团打散并和裂解液混匀，形成肉眼可见团块无法裂解完全（裂解液如果是和细胞团块而不是分散的细胞接触，立刻会和细胞团块表面作用后形成粘稠的屏障，不容易再渗透入团块内部）。
裂解液和细胞接触后基因组DNA立刻释放出来，这个时候吹打力量过大，又易造成基因组断裂。
正确做法，就是迅速有力的吹打几次，几秒钟后基因组释放出来（变粘稠）立刻停止吹打，或者改用大口径枪头（剪去枪头尖）轻柔吹打或者颠倒混匀。
如果还有肉眼可见团块，可在65℃温育30-60 分钟（不要超过一小时）至裂解完全。
7．可选步骤：在裂解物中加入RNase A（10mg/ml）至终浓度100μg/ml，颠倒25 次混匀，37℃温育15 分钟去除残留RNA.然后冷却回室温。
硕士研究生分子生物学实验步骤
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取质量
质粒DNA的限制性内切酶酶切
• 反应体系如下： 灭菌双蒸水 10×限制酶buffer 质粒DNA BamHІ HindШ 6μl 2μl 10μl 1μl 1μl
总体积20μl，混匀，37℃水浴1-3 h，，用1%琼脂糖凝胶 电泳鉴定结果。
RT-PCR扩增目的基因
第一步：RT（总体积25μl）
Taq酶
2.5μl
二、质粒转化、平板筛选 • 制备含含100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB琼脂平板 上 （50 ℃ 时加入Amp ）
• 取感受态细菌100μl置于无菌EP管中；
• 加入重组质粒DNA10 μl，轻轻旋转混匀，冰上放置 30min，42 ℃热休克90sec（勿超时！），冰浴速冷12min。 • 加入无抗生素的LB培养基400μl，于37 ℃摇床（100150rpm）温和振摇45min，使细菌复苏并表达质粒的抗 性基因。 • 取100μl菌液均匀涂铺于含Amp的LB琼脂平板上 ， 37 ℃ 20min后，倒置平板继续培养10-16h(小于20h) • 挑取单菌落置5mlLB培养基中（含Amp） 37 ℃摇床培 养8-12h后，提取质粒，限制酶切鉴定。
RNA模板 2μl Oligo(dT)15
1.5μl
65 ℃,5min; 4 ℃,1min; DEPC处理水 14μl 5xRT buffer 5μl dNTP 1.5μl RT酶 1μl
2000rpm离心20sec后,42 ℃,60min逆转录；85 ℃，5min终 止反应；4 ℃，3m• 离心力要注意不要超过2500g,建议1500-2000g 5min。 • 涂板要注意，不要觉得不匀而多次反复，轻轻在平板上 带一下感觉板上大部分地方走过即可，特别在冰箱中保 存过或在温箱中温浴2小时以上的板。涂完后建议空气 晾干（20-30分钟）这样会减少卫星菌落出现。 • 预冷是必要的。
分子生物学实验操作方法与技巧
完全得不到有价值的结果，那才是最大的时间浪费。
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三• ．实验记录
实验记录是研究工作的一项极其重要的内容，是工作的基础。 而多数青年人对此常常不够重视。我曾经有一个学生，有吸烟 的习惯，一次在去仪器室做实验时，发现忘记带记录本，就把 身上的烟盒拆了，把实验结果记录记在烟合的背面，随后就把 这张纸弄丢了，恰恰这一实验用了一个宝贵实验材料，因此重 复这一实验十分费力。当然，现在的仪器都与计算机连接，结 果都存储在计算机内，但随手抓一个纸片记录实验结果是绝对 不能允许的坏习惯。
可以是致命的错误，向你传授经验的人是不会代你负责的。与此有关的一条经验是， 论文中的引用文献必需自己核对过，转引自其他文献同样可能发生 错误。
和 精确度。对不同实验结果的精确度有不同的要求，要求过高是一种浪费，给人以杀鸡焉用
牛刀之讥，过低则不能满足需要。给出数据，也有类似问题。每一项测定都有一定的精确度， 如果一项测定的精确度为三位有效数字，则给出三位以上数字不仅是完全没有意义的，并且只 能说明作者完全缺乏有效数字的概念，这不仅适用于直接获得的初始数据，对从初始数据得出 的次级数据也同样适用。例如，对一组精确度为三位有效数字的测定结果予以平均，给出四位 以上的平均数计算结果，也只能表明作者的无知。
实验计划、实验结果与小结
• 一．计划
-引自邹承鲁的《我的科学之路》
• 二．实验工作 • 三．实验记录 • 四．实验结果 • 五．实验小结
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一．计划 • 在开始工作前，制定一个现实可行的研究计划是必要的。除课题计划外，
分子生物学实验讲义(2020版-)
《分子生物学》实验讲义实验一分子生物学实验基础知识及常用仪器介绍实验二质粒DNA分离纯化实验三琼脂糖凝胶电泳实验四聚合酶链反应(PCR)检测质粒DNA实验五限制酶切鉴定质粒DNA实验一分子生物学实验基础知识及常用仪器介绍一、实验目的了解分子生物学实验特点，了解分子生物学实验室常用设备及基本实验操作。
二、实验内容1.分子生物学实验知识⑴严格操作规程分子生物学实验一般比较复杂，如所用试剂多、操作步骤多、实验时间长等，因此为保证实验效果，在实验室中一定要有整体观念，严格按照操作规程进行。
⑵耐心细致操作实验中不能急于求成，特别是对于初入门者，应反复操作，积累经验。
⑶习惯微量操作在分子生物学实验中，试剂的用量往往很少，常常细到1ul液体、ug或ng固体，这是平常肉眼很难看到的，所以刚刚接触实验的人往往感到不习惯，总是担心要取的东西能否看到、准不准确，操作的样品会不会丢失，总是想加大反应体积，以为越多越好。
这些观念都是错误的。
只有定时定量加入液体，才能保证实验成功，所以平时应加以练习，逐渐建立微量操作的观念才能解决好问题。
⑷防止实验污染分子生物学实验的对象主要是核酸，不同生物材料的DNA和DNA之间，不同的样品之间，核酸酶等蛋白酶与核酸之间，产物与反应物之间都有可能造成污染，最终导致实验的失败。
故要从所用试剂、仪器设备、耗材及操作人员等方面进行防止污染的操作。
⑸正确处理试剂分子生物学实验中对试剂的要求十分严格，包括试剂的等级、配制、除菌储备等各方面均有严格要求。
⑹注意实验安全分子生物学实验中，操作者常会接触一些对人体有害的试剂，必须实验安全要求进行实验操作，否则会给实验室甚至整个人类带来巨大的危害。
2.分子生物学实验常用仪器介绍⑴微量取液器⑵水纯化装置（离子交换器、超纯水装置）⑶离心机（低速、高速、超速）⑷电泳装置（电泳仪、电泳槽）⑸灭菌设备（高压蒸汽灭菌锅、过滤除菌器）⑹超净工作台⑺PCR仪⑻凝胶成像系统（紫外分析仪、核酸凝胶电泳图谱的记录）⑼温度控制设备（冷冻设备、培养箱、水浴箱、烤箱）⑽其它设备（紫外可见分光光度计、微波炉、凝胶干燥器、真空干燥仪）3.分子生物学基本实验操作⑴基因组DNA的分离与纯化（核酸浓度和纯度测定）⑵真核细胞mRNA的分离与纯化⑶质粒DNA的提取⑷PCR基因扩增实验⑸限制性内切酶酶切实验⑹DNA重组技术⑺DNA转移技术⑻DNA测序：化学法、双脱氧链终止法⑼核酸探针的制备技术：末端标记、PCR法制探针、非放射性探针⑽分子杂交技术：Southern印迹、Northern印迹和Western印迹4.微量移液器的使用可调节微量移液器标准操作程序（适用的液体：水、缓冲液、稀释的盐溶液和酸碱溶液）：⑴调节数字至所需体积；⑵装上吸嘴（不同规格的移液器用不同的吸头），注意气密性）；⑶按到第一档，垂直进入液面几毫米；⑷缓慢松开控制按钮（否则液体进入吸头过速会导致液体倒吸入移液器内部吸入体积减少）；⑸停顿1s后将吸嘴提离开液面；⑹平稳按压打出液体。
分子生物学实验理论与操作教程
分子生物学实验理论与操作教程分子生物学实验理论与操作教程中国农科院研究生院中国生化及分子生物学学会植物病虫害生物学国家重点实验室二零零四年七月目录前言-----------------------------------------------------------I 第一部分核酸提取----------------------------------------------1 实验一：基因组DNA提取--------------------------------------------1 实验二：总RNA提取------------------------------------------------3 第二部分亚克隆技术---------------------------------------------8 实验三：质粒DNA提取----------------------------------------------8 实验四：DNA片段的酶切--------------------------------------------9 实验五：DNA片段的酶修饰-脱磷-------------------------------------12 实验六：DNA片段的连接--------------------------------------------13 实验七： DNA片段的回收-------------------------------------------15 第三部分 PCR技术-----------------------------------------------18 实验八：PCR产物的克隆技术----------------------------------------18 八．1：T-载体构建 ---------------------------------------------19 八．2：PCR产物的T-载体克隆------------------------------------20 八．3：PCR产物的平端克隆技术----------------------------------21实验九：RT-PCR技术-----------------------------------------------21 实验十：定量PCR -------------------------------------------------25 第四部分文库构建技术------------------------------------------29 实验十一：mRNA的提取及纯化 --------------------------------------29 实验十二：cDNA文库构建技术- cDNA 链的反转合成--------------------32实验十三：1,cDNA文库构建技术- cDNA 链的连接、包装及转染----------34 实验十三：2,RACE技术---------------------------------------------36 第五部分核酸杂交技术-------------------------------------------40 实验十四：DNA探针的标记------------------------------------------40 实验十五：Southern杂交技术---------------------------------------44 第六部分：基因及基因产物检测技术----------------------------------48 实验十六：DNA的测序技术------------------------------------------48 实验十七：基因表达 1，基因的体外快速翻译-------------------------53 2，基因的诱导表达-----------------------------54 实验十八：报告基因的应用------------------------------------------57 实验十九：Western杂交技术----------------------------------------58 第七部分基因表达轮廓技术---------------------------------------67 实验二十：DD-PCR技术---------------------------------------------73 实验二一：SSH技术------------------------------------------------74 第八部分：遗传转化技术-------------------------------------------75 实验二二：感受态细胞制备-----------------------------------------75 实验二三：重组基因的转化及筛选------------------------------------77 实验二四：原生质体分离--------------------------------------------78 实验二五：农杆菌转化技术------------------------------------------79 第九部分：分子标记技术--------------------------------------------80 实验二六：RFLP技术-----------------------------------------------86 实验二七：RAPD技术-----------------------------------------------86 实验二八：AFLP技术-----------------------------------------------87 实验二九：SSR技术------------------------------------------------89 第十部分：细胞技术-----------------------------------------------89 实验三十：细胞凋亡------------------------------------------------89 十一：附录一----------------------------------------------------92 二-----------------------------------------------------96１第一部分核酸提取目的基因主要可以通过以下途径加以分离获取。
分子生物学实验课解析
实验记录：详细记录实验数 据，包括时间、温度、浓度
等
实验结束后：整理实验器材， 清洗实验仪器，保持实验室
整洁
实验注意事项
实验操作：严格按照实验步 骤进行，避免操作失误
实验前准备：确保实验器材 齐全，实验环境安全
实验记录：详细记录实验过 程和数据，便于后续分析和
总结
实验安全：注意实验安全， 遵守实验室规章制度，避免
发生安全事故
实验安全问题
实验前：熟悉实 验流程，了解实 验材料和设备的 安全操作规程
实验中：遵守实 验室安全规定， 正确使用防护设 备，如手套、口 罩、护目镜等
实验后：妥善处 理实验废弃物， 避免污染环境
紧急情况：熟悉 实验室紧急处理 措施，如发生火 灾、化学品泄漏 等，及时采取措 施并报告
05
培养创新思维： 通过实验，培养 创新思维和解决 问题的能力
提高科研能力： 通过实验，提高 科研能力和科研 素养
03
实验课的内容和流程
实验课的主要内容
实验目的：了解分子生物学的基本原理和实验技术 实验材料：DNA、RNA、蛋白质等生物大分子 实验步骤：提取、纯化、分析、鉴定等 实验结果：观察、记录、分析实验数据，得出结论
实验课的拓展学习：学生可以通过参加实验课，提高自己的团队合作能力和沟通能力，为未来的 科研和职业生涯做好准备。
实验课与实际工作的联系
实验课是理论与实践相结合的重要环节，可以帮助学生更好地理解和掌握 分子生物学知识。
实验课可以培养学生的动手能力和实验技能，为未来的科研工作打下坚实 的基础。
实验课可以培养学生的团队合作精神和沟通能力，为未来的团队合作提供 帮助。
实验课的流程
实验准备： 包括实验材 料、仪器、
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⑦取组织样品时要快速
RNA完整性的鉴定
RNA样品电泳后，可见28S、 18S及5S小分子RNA条带，则 说明完整性好。若有降解可能 是操作不当或污染了RNase。 28S和18S RNA比值约为2：1, 表明RNA无降解。如比值逆转， 则表明RNA降解。
(2) 如何保证RNA的纯度？
2、加250ul裂解液，颠倒4次混匀；加10ul碱性蛋 白酶溶液，颠倒4次混匀；室温放5分钟。 3、加350ul平衡液，颠倒4次混匀；10000rpm离 心10分钟。 4、上层清液转移到离心柱上。10000rpm离心1分 钟，弃去收集管中溶液。
5、加入750ul清洗液（已加乙醇），10000rpm 离心1分钟，弃去收集管中溶液。
RT：Reverse transcription
PCR的基本过程 三个基本步骤
①变性(denaturation):双链DNA模板解开成单链 94–96℃，速度快，1min
②退火(annealing)：两个寡核苷酸引物结合到单链模板 退火温度依赖Tm(Tm-5) Tm = 4(G+C) + 2(A+T) ℃
1. The electric charge effect（电荷效应） PH（8.3） > PI（4.0－4.5）, DNA -
2. The sieving effect （分子筛效应） a The molecular weight of DNA b The structure of DNA
共价闭环 DNA ＞ 直线 DNA ＞ 开环的双连 DNA
3. The concentration of agarose gel （琼脂糖凝胶的浓度）
EB（溴化乙锭）
是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯 酰胺凝胶中的DNA。溴化乙锭用标准302nm 紫外光透射仪 激发并放射出橙红色信号易于观察。
含有一个可以嵌入DNA堆积碱基之间的一个三环平面基团， 大约每2.5个碱基插入一个溴化乙锭分子。当染料分子插 入后，其平面基团与螺旋的轴线垂直并通过范德华力与上 下碱基相互作用，这个基团的固定位置及其与碱基的密切 接近，导致与DNA结合的染料呈现荧光，
操作: 参见书P11
4 铺平板与涂平板
今日主要内容（周二）
1. 挑取单克隆菌落加至15 μl LB 培养基中混匀，取1 μl进行 PCR鉴定
2. 前一天PCR产物的电泳鉴定
3. 今天PCR产物的电泳鉴定
4. 结果较好的，将剩余的菌液 14 μl转至6ml LB培养基中， 过夜培养。
琼脂糖凝胶电泳
80
1.96
15
85
1.97
10
90
1.98
5
95
1.99
0
100
2
DNA: OD260/OD280 =1.8
RNA: OD260/OD280 =2.0
核酸的特征紫外吸收峰在260nm，蛋 白质的特征吸收峰在280nm
单链的RNA的碱基中的共轭双键暴露 的更多，在260nm处吸收的更多。
260nm下，1 OD值的光密度相当于双 链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA或RNA 为40μg/ml；寡核苷酸为20μg/ml。可以 此来计算核酸样品的浓度。
④新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺 等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。 更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时 使用更多裂解液。
⑤冷冻样品：液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存。样品 决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。冷冻样品， 即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加 入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在 与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须 预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液 氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中， 立即混匀匀浆。
2. Gel bed can be made by sealing a proper sized plastic with the masking tape and inserted the comb （胶带封闭胶床，插梳子）
3. Cool agarose gel to 60℃, add 5µl EB, mix, pour the agarose slowly (avoid bubbles) onto the gel bed （冷却，加EB混匀，倒入 胶床）
5. Fill the tank with proper amount of TBE buffer, usually the buffer is about 1 mm above the gel （加入TBE buffer，让液面略高于胶面）
6. Add 2µl loading buffer and 7µl sample onto a piece of parafilm, mixed, add DNA sample slowly with the pipette tip just beneath the opening of the well (avoid bubbles in tip)（上样）
蛋白质／％ 核酸／％ OD260:OD280
100
0
0.57
95
5
1.06
90
10
1.32
85
15
1.48
80
20
1.59
75
25
1.67
70
30
1.73
65
35
1.78
60
40
1ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ81
55
45
1.84
50
50
1.87
45
55
1.89
40
60
1.91
35
65
1.93
30
70
1.94
25
75
1.95
20
4. Let gel polymerize for about 30min, discard the masking tape, place the gel bed onto the electrophoresis tank, remove the comb （30min后，撕去胶带，放入电泳槽，拔出梳子)
引物的设计及其原则
引物的特异性决定PCR反应特异性。
引物设计原则的把握：
a、引物长度:一般为15～30bp ，常用的是18-27 bp， 引物太短会影响PCR的特异性
b、引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端 相似性较高的序列，否则容易导致错配。 c、引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利 于引发反应。
6、加入250ul清洗液（已加乙醇），10000rpm 离心1分钟，弃去收集管中溶液。
7、10000rpm离心2分钟，弃去收集管中溶液。 8、将离心柱转移到干净1.5ml EP管中，加入
30-50ul去核酸酶水到离心柱上，10000rpm 离心1分钟，收集EP管中样品。
（5）向离心柱上加500ul RPE溶液，10000rpm离 心1分钟，弃去收集管中液体。
重复步骤5一次。
（6）10000rpm离心2分钟，弃去收集管中液体。 将离心柱转移到新的无RNA酶的1.5ml 离心管中， 向离心柱上加30-50ul去RNA酶水，50℃保温2分钟， 10000rpm离心1分钟，收集物即总RNA。
溴化乙锭可以嵌入碱基分子中，导致错配。溴化乙锭是强 诱变剂，具有高致癌性！
Operation
1. Weigh proper 0.3g agarose, dissolve in 30ml TBE buffer by heating in a microwave oven
（称取琼脂糖0.3克溶于30ml 1×TBE buffer，微波炉加热熔化）
操作步骤：
（1）晶状体迅速放入匀浆器中，加RLT450 μl，匀浆。 （2）向晶状体匀浆液中加入225μl乙醇，枪头吹打，充 分混匀。 （3）离心柱（EZ-10）放入2 ml 收集管中，将上一步 混合液加入离心柱上，8000 rpm离心1分钟，弃去收集 管中液体。（留柱子） （4）向离心柱上加500 μ l RW溶液，10000 rpm离心1 分钟，弃去收集管中液体。
质量好的RNAD260/D280在1.8-2.0之 间，如果该值大于2.2，则认为RNA已 经降解，最好不要再用了
OD260/OD280比值偏低
①蛋白质污染：用氯仿重新抽提一次，再沉淀，溶解。
确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量，确保 裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀，并且离 心分层的离心力和时间要足够。
②苯酚残留：确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先 要充分混匀，并且离心分层的离心力和时间要足够。
③多糖或多酚的残留：一些特殊的组织和植物中，需要 注意多糖、多酚杂质的去除。
④设备限制：测定OD260及OD280数值时，要使OD260读 数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品：测 OD值时，对照及样品稀释液请使用10mM Tris，pH7.5。 用水作为稀释液将导致比值偏低。
扩增、诱导表达 筛选阳性重组体
质粒提取 酶切电泳
PCR 电泳
SDS-PAGE (蛋白产物电泳鉴定)
实验一 RT-PCR
今日主要任务(周一)
总RNA提取 RT-PCR 转化 铺平板
目的要求： 掌握RT-PCR的原理和方法
原理 RT-PCR包括三个主要步骤： （1）总RNA的抽提 （2）反转录cDNA的合成 （3）PCR扩增
目的基因和载体的酶切 限制性内切酶（双酶切）
目的基因和载体的连接 DNA连接酶
3 转化
实验目的 (1) 学习转化的基本原理及方法。 (2) 验证DNA是遗传物质，加深对中心法则的理解。