生物化学逆转录培训课件
生物化学-DNA复制、转录、翻译
(3)识别起点：由DNA指导的引物酶完成；
(4)RNA引物合成：以DNA为模板，在引物酶催化下由 DNA转录生成5-10个核糖核苷酸链；
(5)DNA链延长：在引物3’-OH基上，按碱基互补原则 经DNA聚合酶（主要是酶Ⅲ）催化DNA链从5’→3’ 延伸。
端粒、端粒酶意义
与细胞衰老、凋亡有关； 端粒的平均长度随细胞分裂次数的增多及年龄的增长而逐渐 变短至消失，可导致染色体稳定性下降，导致细胞衰老凋亡。 正常：体细胞端粒酶活性丧失，端粒的长度不断缩短。 异常：肿瘤细胞端粒酶活性恢复，端粒复制，细胞恶性增殖
抑制端粒酶活性可防治肿瘤。
第二节 RNA的生物合成 — 转录
脱离
A、不需ρ因子（终止子）的终止
a 、发夹结构的形成：
DNA上的回文序列使RNA产物3’ 端自身碱基互 补，形成发夹结构，杂合链趋于解体。
b 、产物的寡聚U片段促进RNA 从DNA上脱落：
杂交链中A- U间氢键相对较弱，新生RNA易从模板上 脱落，不需ρ因子即可终止。
不
需
ρ
因
子
发夹结构
的
终
止
寡聚U片段
DNA聚合酶Ⅱ与Ⅲ
5’ 3’聚合酶 3’ 5’外切酶
DNA聚合酶Ⅲ DNA 复制的主要酶。 DNA聚合酶Ⅰ用于切除RNA引物， 损伤后修复。 DNA聚合酶Ⅱ只是在无pol I及pol Ⅲ的情况下才起作用 。
生物化学-DNA复制、转录、翻译
DNA聚合酶的校对作用
依赖于3个聚合酶的3’末端外切酶活性，进行校对 和纠错。
多种蛋白质参与，从而保证了复制的准确性。
2、真核细胞的DNA聚合酶 DNA－pol α，β，γ，δ，ε
DNA－po1δ：延长领头链和随从链； DNA—poIα：合成RNA引物； DNA－polε：校读、修复和填补缺口。 DNA—polβ：在没有其他DNA－pol时发挥催化功能。 DNA—po1γ：催化线粒体DNA的合成。
转录 5′···GCAGUACAUGUC ···3′
翻译
mRNA
N······Ala ·Val ·His ·Val ······C 蛋白质
结构基因
转录方向
5
编码链
3
模板链
模板链
3
编码链
5
转录方向 模板链并非永远在同一条单链上。
三、RNA聚合酶
不需引物,在单核苷酸的3’-OH上逐个加核苷酸。
均以DNA为模板； 都是生成3’，5’ —磷酸二酯键； 合成的方向都是5’ →3’； 遵从碱基配对规律。
复制和转录的区别
复制
转录
模板 两股链均复制 模板链转录（不对称转录）
原料 dNTP
NTP
酶
DNA聚合酶 RNA聚合酶（RNA-pol）
产物 子代双链DNA mRNA，tRNA，rRNA （半保留复制）
生物化学及分子生物学人卫第八版常用分子生物学技术的原理及应用公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件
5
5
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25～30 次循环后，模板DNA含量能 够扩大100万倍以上。
第15页目录
PCR体系基本构成成份
• 模板DNA • 特异性引物 • 耐热DNA聚合酶 • dNTPs • Mg2+
第16页目录
PCR基本反应环节
变性Байду номын сангаас95˚C
延伸 72˚C
退火 Tm-5˚C
第17页目录
二、PCR技术主要用途
第29页目录
DNA序列自动分析原理及结果图
蓝色
绿色 荧光
红色 荧光
荧光
ddG ddA
ddC
ddT
黄色 荧光
电泳
第30页目录
第四节
基因文库
Gene Library
第31页目录
基因文库(gene library) 是指一个包括了某一生物体所有DNA序列
克隆群体。 • 基因组DNA文库 (genomic DNA library) • cDNA文库(cDNA library)
有类似表型突变酵母，能够恢复(rescue) 正常表型片段中所含有基因即可能为致病基 因。这种试验称为功效互补试验 (functional complementation assay)。
Nucleic Acid Sequence Analysis
生物化学》ppt课件14.第十四章-基因表达调控
1.启动子 真核基因启动子是RNA聚合酶结合位 点周围的一组转录控制组件，至少包括一个转录 起始点以及一个以上的功能组件。
RNA起始点
CAAT盒
GC盒
TATA盒
高等真核生物
RNA起始点
上游激活序列(UAS)
TATA盒
酵母
2. 增强子(enhancer) 指远离转录起始点、决定 基因的时间、空间特异性、增强启动子转录活性 的DNA序列。
白 因 子 ， 决 定 三 种 RNA(mRNA 、 tRNA 及 rRNA)转录的类别。
2.特异转录因子(special transcription factors) 为个别基因转录所必需，决定该基因的时
间、空间特异性表达。
转录激活因子
分为
转录抑制因子
(三)反式作用因子的结构
TF
DNA结合域 酸性激活域
操纵子(operon)是原核生物中几个功能相关的 结构基因成簇串联排列组成的一个基因表达的协 同单位。操纵子的本质是DNA序列。
1.操纵子的结构与功能
一个操纵子=调节序列+启动序列+操纵序列+编码序列
⑴调节序列(inhibitor,I):编码一种阻遏蛋白(repressor) 。 ⑵启动序列(promoter,P):结合RNA聚合酶，启动转录。 ⑶操纵序列(operator,O):阻遏蛋白的结合位点。 ⑷编码序列(coding sequence):编码功能性蛋白，2~6个。
14考研生物化学DNA的复制与转录
RNA聚合酶
多亚基酶：、、’、 无需引物存在 可转录mRNA、tRNA、rRNA 启动子：RNA聚合酶识别，结合，并开始转录的一段DNA序 列
转录起始
-35序列：TTGACA, 识别、结合部位 -10序列：TATAAT, DNA局部解链部位 转录起点 转录促进因子 阻遏蛋白
rho因子：帮助RNA聚合酶与DNA分离，帮助RNA释放 NUS因子： NusA
终止因子
抗终止作用
真核生物的转录作用
RNA聚合酶：三种
RNA聚合酶I：转录45S rRNA(5.8S, 18S, 28S) RNA聚合酶II：转录hnRNA ，SnRNA RNA聚合酶III：转录tRNA、5s rRNA Hogness框（TATA框）：-25~-30，一般7bp，几乎全部由 T/A构成 CAAT框：-75位，9bp，GGTCAATCT GC框：更上游，GGGCGG，转录因子结合部位 以非组蛋白的形式与染色质结合 形成不同的功能相应元件 核质因子、核功能蛋白
引发体先在前导链上合成一段引物，后转移到滞后链 复制叉移动一段距离后，在滞后链模板上的引物酶合成出引物，DNA 聚合酶结合，开始延伸DNA，由于方向与复制叉移动方向相反，延伸 一段距离后， DNA聚合酶与DNA分离。 由于复制叉不断移动，滞后链不断合成引物，上述过程不断重复，形成 冈崎片断 原核冈崎片断一般1000~2000bp、真核冈崎片断一般100-200bp
分子生物学 第7章 RNA复制与逆转录ppt课件
精选ppt课件2021
6
RNA病毒按基因合成方式又可分为： RNA复制型病毒
RNA逆转录型病毒
+RNA病毒与mRNA相似，可直接作为翻译的模板用于 合成蛋白质。
–RNA 病毒则 需 要借助 RNA 复制 酶 的作用 ， 以自身 – RNA为模板合成与原病毒互补的+RNA链，再以此+RNA链 为模板翻译生成蛋白质。
..
转录 ④
② 逆转录
③ 整合
..
前病毒
图7-9 致癌病毒RNA的繁殖过程
24
7.3.5 乙肝病毒DNA的侵染过程
乙型肝炎病毒（HBV）是一种DNA病毒，同时也是一种逆转录 病毒，由外壳和核心颗粒两部分组成，外壳上的蛋白也就是乙肝表 面抗原（HbsAg）。基因组DNA位于核心颗粒内，为双链环状但局 部区域是单链或有缺口的DNA，DNA聚合酶依附其上。外环是长链 为–DNA，长度恒定，“内环”是圆弧的短链+DNA，长度可变，约 为长链的50~80%。
14
7.2.4 双链RNA病毒的复制和侵染
±RNA
翻译
RNA 复制酶
+RNA –RNA
复制
+RNA
复制
翻译
外壳蛋白
±RNA
包装 子代病毒颗粒
图7-6 双链精R选ppNt课A件20病21 毒的复制
生物化学第一节 原核生物转录的模板和酶
第一节原核生物转录的模板和酶
2015-07-14 71113 0
第十六章RNA的生物合成
1961年S．B．Weiss和J．Hurwitz等各自在大肠杆菌裂解液中发现了DNA 依赖的RNA聚合酶( DNA-dependent RNA polymerase，RNA pol)。在此之前，S．Ochoa已经提出了RNA的转录机制，并因此获得1959年度诺贝尔生理／医学奖。
生物体以DNA为模板合成RNA的过程称为转录(transcription)，意指将DNA的碱基序列转抄为RNA。DNA分子上的遗传信息是决定蛋白质氨基酸序列的原始模板，mRNA是蛋白质合成的直接模板。通过RNA的生物合成，遗传信息从染色体的贮存状态转送至胞质，从功能上衔接DNA和蛋白质这两种生物大分子。1958年，F．Crick将上述遗传信息的传递方式归纳为中心法则( central dogma)。1970年H. Temin发现了逆转录现象，对中心法则进行了补充。
在生物界，RNA合成有两种方式。一是DNA指导的RNA合成，也称转录，为生物体内的主要合成方式。转录产物除mRNA、rRNA和tRNA外，在真核细胞内还有snRNA、miRNA 等非编码RNA。对RNA转录过程的调节可以导致蛋白质合成速率的改变，并由此而引发一系列细胞功能变化。因此，理解转录机制对于认识许多生物学现象和医学问题具有重要意义。mRNA转录过程及其加工和剪切错误可引起疾病。RNA的转录合成是本章的主要内容。
另一种是RNA依赖的RNA合成(RNA-dependent RNA synthesis)，也称RNA 复制(RNA rep- lication)，由RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase）催化，常见于病毒，是逆转录病毒以外的RNA病毒在宿主细胞以病毒的单链RNA为模板合成RNA的方式，限于篇幅本章未予叙述。
逆转录与中心法则
逆转录与中心法则
全文共四篇示例，供读者参考
第一篇示例：
逆转录（Reverse Transcription）是一种生物化学过程，通过该过程，RNA（核糖核酸）转录为DNA（脱氧核糖核酸），这与正常的转录过程相反。逆转录是一些病毒（如HIV病毒）和真核生物中的转座子（转座元件）以及某些线粒体和叶绿体遗传物质的特征。逆转录将RNA 模板的信息转录到DNA中，这是一个重要的生物过程，这样的转录方式为研究者们提供了从RNA到DNA的重要工具。
中心法则（Central Dogma）是以诺贝尔生理学或医学奖获得者弗朗西斯·克里克（Francis Crick）的名言而命名的，它描述了生物体内信息的流动方式。中心法则包括了三个步骤：DNA复制（DNA Replication）、转录（Transcription）和翻译（Translation）。DNA 复制是指DNA的双链解开，生成两条完全一样的DNA分子。转录是DNA中的基因信息转录成RNA的过程。而翻译是指通过核糖体将RNA编码的信息转化成蛋白质的过程。
逆转录与中心法则的关系在于逆转录是对中心法则的一种特例。在正常的生物体内过程中，DNA是通过转录生成RNA，然后通过翻译为蛋白质。而在逆转录过程中，RNA被逆转录为DNA，这便是中心法则的倒转。逆转录是一种与中心法则相反的生物学过程，因为这个过
程是将RNA转录为DNA，而不是将DNA转录为RNA。逆转录是一种重要的生物过程，为科学家们提供了很多研究RNA和DNA之间相互作用的机会。
逆转录主要存在于一些病毒中，如HIV病毒。HIV病毒是一种逆
生物化学第12章-分子生物学常用技术
第十二章分子生物学常用技术及应用
【授课时间】3学时
【目的要求】
1．掌握基因工程与重组DNA技术相关概念，核酸分子杂交、探针、PCR、DNA 芯片技术、基因诊断和基因治疗的概念。
2．熟悉重组DNA技术、PCR的基本原理及基本反应步骤。
3．了解基因工程在医学中的应用，PCR 的主要用途。
4．了解DNA芯片技术的原理与方法，基因诊断与基因治疗的应用。
【教学内容】
1．一般介绍：基因工程
2．一般介绍：核酸分子杂交技术
3．一般介绍：聚合酶链反应
4．一般介绍：DNA芯片技术
5．一般介绍：基因诊断与基因治疗
【授课学时】3学时
第十二章分子生物学常用技术及应用第一节基因工程
第二节核酸分子杂交技术
第三节聚合酶链反应
第四节 DNA芯片技术
第五节基因诊断与基因治疗
第一节基因工程
噬菌体
(bacteriophage，phage)是感染细菌的一类病毒，因其寄生在细菌中并能溶解细菌细胞，所以称为噬菌体。用于感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。
（一）目的基因的制备
目的基因是指所要研究或应用的基因，也就是需要克隆或
．基因组DNA文库
cDNA文库
．聚合酶链式反应（polymerase chain reaction
．化学合成
（二）目的基因与载体的连接
将目的基因或序列插入载体，主要通过DNA
（二）Northern 印迹杂交
Northern 印迹杂交是指将待测RNA 样品经电泳分离后转移到固相支持物上，然后与标记的核酸探针进行杂交，检测的方法。其基本原理和基本过程与印迹杂交主要用于检测各种基因转录产物的大小、转录的量及其变化。
生物化学课件-逆转录
逆转录
reverse transcription
一、逆转录病毒的基因组RNA以逆 转录机制复制
逆转录(reverse transcription)
逆转录酶(reverse transcriptase)
RNA 逆转录酶 DNA
逆转录病毒细胞内的逆转录现象:
RNA 模板
逆转录酶
DNA-RNA
本章知识点框架图：
DNA复制
原核生物复制
真核生物复制
起始：DNA的解链；引物合成和引发体形 成 延长：复制的延长指在DNA-pol催化下， dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长 中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不 断生成 终止：双向复制的复制片段在终止点处汇合
起始：与原核生物基本相似 延长：DNA聚合酶转换；核小体组蛋 白的分离和重新组装 终止：需要端粒酶延伸端粒DNA
碱水解
TTTT
DNA聚合酶Ⅰ
SI核酸酶Hale Waihona Puke Baidu
二、逆转录的发现发展了中心法则
逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现
逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传 信息传代与表达功能
对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒 致癌理论
•1、DNA复制的基本特点 •2、原核生物的复制过程包括起始、延长和终止 •（1）起始是将DNA双链解开形成复制叉 •（2）复制的延长由引物或延长中的子链提供3′-OH，供dNTP掺入生成磷酸二酯键，延
生物化学-DNA复制、转录、翻译
DNA聚合酶Ⅱ与Ⅲ
5’ 3’聚合酶 3’ 5’外切酶
DNA聚合酶Ⅲ DNA 复制的主要酶。 DNA聚合酶Ⅰ用于切除RNA引物， 损伤后修复。 DNA聚合酶Ⅱ只是在无pol I及pol Ⅲ的情况下才起作用 。
DNA聚合酶Ⅰ
N
5’ 3’3’ 5’ 5’ 3’
C
外切酶外切酶 聚合酶
小片段
大片段（ klenow片段）
产物 子代双链DNA mRNA，tRNA，rRNA （半保留复制）
配对 A-T，G-C
A-U，T-A，G-C
二、转录的模板：
转录是以结构基因作为单位的。 模板链 ：
DNA双链中只一条链可 做转录模板，又称为 “Watson链”。 编码链： 无转录功能的DNA链， 又称为“Crick链” 。 二者可在同一条链上。
拓扑异构酶Ⅱ 旋转酶
切断DNA双链，使另一 双链经过此缺口，再封闭。
5、引发体
RNA引物的合成和复制的起始必需。
蛋白质 DnaA蛋白
结合到DNA双链复制起始部位
DnaB蛋白 引物酶
解链酶的作用 合成RNA引物
6、DNA连接酶
催化二段DNA链之间3’,5’ 磷酸二酯键的
形成
5’
遗传信息的传递
—DNA、RNA、蛋白质的生物合成
中心法则
复制
转录
翻译
复制 DNA
高中生物课件-转录和翻译
如何在短时间内由一条mRNA合成出多个相 同的蛋白质分子？
①结合上图判断翻译的方向，并说明判断的依据。 ③翻译过程中核糖体沿mRNA移动还是mRNA沿 核糖体移动？ ④翻译合成的多肽链是否能承担相应的生命活动？
时间 场所
复制 细胞分裂的间期
转录
翻译
个体生长发育的整个过程
主要在细胞核
主要在细胞核 细胞质的核糖体
转运氨基酸， 识别遗传密 码
核糖体RNA (rRNA)
核糖体的 组成物质
结
单链结构
呈三叶草型
单链结构
构
（单链）
分析：RNA适合于作为信使的条件
1.RNA与DNA结构相似，碱基（核糖核苷酸） 可以携带遗传信息
2.RNA一般是单链，且比DNA短，能通过核 孔从细胞核转移至细胞质
三叶草形 有臂 有环 一端结合氨基酸 另一端有三个碱基
思考：1、tRNA只有三个碱基吗？ 2、tRNA有多少种？反密码子有多少个？
1、不止三个碱基 2、tRNA共61种，反密码子61种
氨基酸的结合部位
反密码子（识别密码子）
肽键
GCG
UAA
起始密码
UAC
UAU
核糖体
G AU GAUACGCAU UU GA
mRNA
UAA
GCG
终止密码
UAC U A U G AU GAUACGCAU UU GA
逆转录酶名词解释
逆转录酶名词解释
逆转录酶（Reverse Transcriptase）是一种酶类，具有将RNA
模板反向转录为DNA的能力。这种酶最早发现于1965年，
由美国生物化学家霍华德·泰曼和广岛立博士等人发现，是研
究逆转录病毒的重要工具。逆转录酶是逆转录病毒（如HIV 等）和一些植物和细菌的核糖体元件中的重要成分，它在病毒的复制逆过程中发挥着关键作用。
逆转录酶主要有两个重要的功能：
1. RNA依赖DNA聚合酶（RNA-dependent DNA polymerase）: 逆转录酶可以使用RNA作为模板，在硫酸核糖酸核苷下合成DNA链。它能够使RNA的核酸序列转录为相应的DNA链，
该过程称为反转录。逆转录酶具有较高的酶活性，可以将
RNA链转录为DNA链，该能力使得科学家们可以通过逆转录酶来研究RNA的结构、功能以及RNA参与的生物学过程，
如基因表达、蛋白质合成等。
2. RNA酶H（Ribonuclease H）活性: 逆转录酶还具有RNA酶
H活性，可以水解RNA- DNA杂合体。在反转录的过程中，
逆转录酶合成的DNA链和RNA链形成杂合物，杂合物的
RNA部分可以通过RNA酶H活性被逆转录酶水解，从而释
放出单链的DNA。RNA酶H的活性可以在病毒的逆转录复制过程中发挥重要作用，尤其是在合成和修复DNA链的过程中。
逆转录酶在科学研究中的应用广泛。科学家们可以利用逆转录酶将RNA转录为DNA，并进一步进行PCR扩增、测序、克
隆等实验操作。逆转录酶也被广泛应用于分子诊断、基因表达调控、病毒学研究等领域。此外，在药物研发上，逆转录酶被用作目标酶的抑制剂，从而阻止逆转录病毒的复制和传播。
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双链DNA
生物化学逆转录
2
RNA病毒在细胞内复制成双链DNA的前病毒(provirus)。前 病毒保留了RNA病毒全部遗传信息，并可在细胞内独立繁殖 。在某些情况下，前病毒基因组通过基因重组 (recombination)，参加到细胞基因组内，并随宿主基因一 起复制和表达。这种重组方式称为整合(integration)。前病 毒独立繁殖或整合，都可成为致病的原因
3/9/2021
生物化学逆转录
3
3/9/2021
逆转录酶催化的cDNA合成
生物化学逆转录
4
试管内合成cDNA:
cDNA complementary DNA
以mRNA为模板，经逆转 录合成的与mRNA碱基序列互 补的DNA链
分子生物学研究可应用逆 转录酶，作为获取基因工程目 的基因的重要方法之一，此法 称为cDNA法
3/9/2021
生物化学逆转录
AAAA
逆转录酶
A AA A TTTT
碱水解
TTTT
DNA聚合酶Ⅰ
SI核酸酶
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二、逆转录的发现发展了中心法则
➢逆转录酶和逆转录现象，是分子生物学研究中的重大发现 ➢逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样兼有遗传 信息传代与表达功能 ➢对逆转录病毒的研究，拓宽了20世纪初已注意到的病毒 致癌理论
3/9/2021
生物化学逆转录
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•3、真核生物复制发生于细胞周期的S期，其过程与原核生物相似，但更为复杂和精致。复 制的延长和核小体组蛋白的分离和重新组装有关。复制的终止需要端粒酶延伸端粒DNA
•4、非染色体基因组采用特殊的方式进行复制
3/9/2021
生物化学逆转录
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• 本章知识点框架图 ：
DNΒιβλιοθήκη Baidu复制
一、逆转录病毒的基因组RNA以逆 转录机制复制
➢逆转录(reverse transcription) ➢逆转录酶(reverse transcriptase)
逆转录酶
RNA
DNA
3/9/2021
生物化学逆转录
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逆转录病毒细胞内的逆转录现象:
3/9/2021
逆转录酶 RNA酶 逆转录酶
RNA 模板
DNA-RNA 杂化双链 单链DNA
原核生物复制
真核生物复制
起始：DNA的解链；引物合成和引发体形 成 延长：复制的延长指在DNA-pol催化下， dNTP以dNMP的方式逐个加入引物或延长 中的子链上，其化学本质是磷酸二酯键的不 断生成 终止：双向复制的复制片段在终止点处汇合
起始：与原核生物基本相似 延长：DNA聚合酶转换；核小体组蛋 白的分离和重新组装 终止：需要端粒酶延伸端粒DNA
3/9/2021
生物化学逆转录
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•1、DNA复制的基本特点 •2、原核生物的复制过程包括起始、延长和终止 •（1）起始是将DNA双链解开形成复制叉 •（2）复制的延长由引物或延长中的子链提供3′-OH，供dNTP掺入生成磷酸二酯键，延 长中的子链有前导链和后随链之分，复制产生的不连续片段称为冈崎片段 •（3）复制的终止需要去除RNA引物、填补留下的空隙并连接片段之间的缺口使成为连续 的子链
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生物化学逆转录
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生物化学逆转录
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