纤维素酶的滤纸酶活和CMC酶活的测定
纤维素酶酶活的测定方法
检测分析纤维素酶酶活的测定方法河南省科学院生物研究所 刘德海 杨玉华 安明理河南省饲料产品质量监督检验站 陈小鸽 饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用,对其质量检测显得日益重要。
纤维素酶是一种复合酶,按作用底物的能力划分为两部分,一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶,称为C1酶;另一部分是对羧甲基纤维素钠(Na-CMC)起水解作用的酶,称为C x酶。
据此,一般采用两种测定方法,一种是适用于C X酶的CMC法,另一种是适用于C1酶的滤纸法。
下面就此两种方法作一介绍。
1 C MC(羧甲基纤维素)法1.1 材料1.1.1 饲用纤维素酶 由河南省科学院生物研究所提供。
1.1.2 试剂 磷酸氢二钠、柠檬酸、羧甲基纤维素、3,5-二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。
1.1.3 仪器 721型分光光度计、恒温水浴锅、PHS-2酸度计、秒表。
1.1.4 试剂配制1.1.4.1 pH5.0柠檬酸缓冲液 制取0.2mol/L 磷酸氢二钠液(称取7.16g磷酸氢二钠溶解于蒸馏水中,定容至100mL)和0.1mol/L的柠檬酸液(称取2.1g柠檬酸溶解于蒸馏水中,定容至100 mL),取磷酸氢二钠液24.3mL、柠檬酸液25.7mL 混匀,用精密酸度计测至pH值为5.0。
1.1.4.2 羧甲基纤维素溶液 准确称取2.0g羧甲基纤维素钠盐溶于200mL水中,沸水浴中加热至溶化,过滤,取滤液100mL,加柠檬酸缓冲液20 mL、蒸馏水40mL,混匀,贮存于冰箱中备用。
1.1.4.3 3,5-二硝基水杨酸显色液 准确称取6.3g3,5-二硝基水杨酸置于2mol/L氢氧化钠262mL溶液中,然后加酒石酸钾钠的热溶液(182.0g酒石酸钾钠溶于500mL水中),再加5.0 g苯酚和5.0g亚硫酸钠,搅拌至溶解,冷却后定容至1000mL,贮于棕色瓶中置冰箱中备用。
1.1.4.4 0.1%标准葡萄糖溶液 准确称取经105℃烘至恒重的无水葡萄糖250.000mg,溶于蒸馏水中,定容至250mL。
纤维素酶活的测定(IUAPC推荐方法)
纤维素酶活力的测定1试剂1.1缓冲溶液乙酸-乙酸钠缓冲液（0.1mol/L，pH 4.8）柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1mol/L，pH 4.8）1.2DNS试剂DNS试剂：取7.5g 3,5-二硝基水杨酸，14.0g氢氧化钠，充分溶解于煮沸冷却后的去离子水中，加入酒石酸钾钠216.0g，苯酚5.5mL，偏重亚硫酸钠6.0g，完全溶解后，定容至1L，室温下储存于棕色瓶中。
1.3葡萄糖检测试剂R1试剂：苯酚，10.6mmol/L，pH 7.0。
R2试剂：磷酸盐缓冲液，70mmol/L；4-氨基安替比林，0.8mmol/L；葡萄糖氧化酶，＞10U/mL；氧化物酶，＞1U/mL。
R1试剂和R2试剂在使用前等量混合均匀即可使用，混合液室温下放置时间不宜超过12h，否则就会因变色而失效。
1.4考马斯亮蓝试剂考马斯亮蓝G-250（CBB-G250）试剂按照传统的Brandford法制备：准确称取0.100±0.0001CBB-G250溶于50mL乙醇（95%，v/v）中，然后加入100mL磷酸（85%，w/v），将溶液转移至1L容量瓶，用去离子水定容，最后将染料溶液用滤纸过滤后，4℃下储存于棕色瓶中。
2仪器和设备2.1分析天平：感量0.0001g2.2精密pH计：精确至0.012.3磁力加热搅拌器2.4紫外可见分光光度计，购自美国安捷伦公司，可在数秒内快速扫描波长200-1000nm范围的吸收值，配置1cm石英比色皿2.5电热恒温水浴锅：30-100℃2.6移液器：量程为1000μL-5000μL，200-1000μL，20-100μL，0-10μL各1支，均购自芬兰大龙（Dragon）公司3纤维素酶活力测定按照IUAPC推荐的方法（Ghose，1987）分析纤维素酶的滤纸酶活、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活。
3.1滤纸酶活测定纤维素酶滤纸酶活的方法如下：（1）将Whatman No 1或国产相同等级的滤纸（新华1号滤纸）裁剪为1.0×6.0cm2（约50mg）的滤纸条，折成扇形，置于一个25mL的具塞比色管中；（2）加入1.0mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（0.05mol/L，pH 4.8）预热至50℃；（3）然后加入0.5mL适当稀释的酶液，要求至少有两个稀释梯度最终释放的葡萄糖的量分别略高于和略低于2.0mg，并在50℃保温1h；（4）分别以不加滤纸和不加酶的试样作为空白，在相同条件下保温；（5）反应结束后加入3.0mLDNS试剂，煮沸5min后，在冷水浴中快速冷却，用去离子水定容至25mL，摇匀；（6）置于紫外可见分光光度计上测波长540nm处的吸收值，并根据葡萄糖-DNS工作曲线计算1h释放的葡萄糖的量，按下式计算纤维素酶的滤纸酶活：滤纸酶活（PFU·mL-1）=0.37×释放2.0mg葡萄糖所需酶的稀释度（3-1）3.2羧甲基纤维素（CMC）酶活测定羧甲基纤维素CMC酶活的方法如下：（1）使用柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液（0.05mol/L，pH 4.8）配制质量浓度为2%的羧甲基纤维素（简写成CMC，取代度接近0.7）溶液；（2）在25mL的具塞比色管中加入0.5mL适当稀释的酶液，要求至少两个稀释梯度最终释放葡萄糖的量分别略高于和略低于0.5mg，然后在50℃下保温5-10min；（3）加入0.5mL羧甲基纤维素CMC溶液，混合均匀后在50℃下保温30min；（4）加入3.0mLDNS试剂以结束反应，煮沸5min后，在冷水浴中快速冷却，用去离子水定容至25mL，摇匀；（5）置于紫外可见分光光度计上测波长540nm处的吸收值，并根据葡萄糖-DNS工作曲线计算释放的葡萄糖的量，按下式计算纤维素酶的CMC酶活：CMC酶活（IU ·mL-1）=0.185×释放0.5mg葡萄糖所需酶的稀释度（3-2）3.3纤维二糖酶活（β-葡萄糖苷酶活力）测定纤维二糖酶活力的方法如下：（1）用乙酸-乙酸钠缓冲溶液（0.05mol/L，pH 4.8）配制浓度为15mmol/L的纤维二糖标准溶液，仅在测试前配制新鲜溶液；（2）将酸用乙酸-乙酸钠缓冲溶液稀释至一系列浓度，保证有两个稀释梯度在反应结束后分别释放略高于和略低于1.0mg的葡萄糖；（3）在试管中加入1.0mL稀释的酶液，加热至50℃后，再加入1.0mL纤维二糖标准溶液，并在50℃保温30min；（4）反应结束后在沸水浴中煮沸5min，冷却，用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法测定葡萄糖的量；（5）分别以不加底物和不加酶的试样作为空白，计算释放1mg葡萄糖所需的酶的稀释度，并按下式计算酶的活力：β-葡萄糖苷酶活力（IU ·mL-1）=0.0926×释放1.0mg葡萄糖所需酶的稀释度（3-3）4葡萄糖含量的快速测定（1）准备测试液，即将R1试剂和R2试剂在使用前等量混合均匀；（2）将待测试样适当稀释，使最终紫外分光光度及记录的信号值在0.1-0.8之间，测试结果葡萄糖浓度应低于28mmol/L；（3）在5mL塑料离心管中先后加入2mL测试液和10μL待测液，37℃水浴中保温15min；（4）待显红色后，置于紫外分光光度计中测量505nm处的吸收值，室温下显色的试样可稳定2h；（5）以去离子水代替待测液，与测试液混合后，作为空白样；（6）使用标准的葡萄糖试剂建立校正曲线。
纤维素酶活力测定方法
纤维素酶活力测定方法纤维素酶活力测定方法很多，主要原因是纤维素酶种类繁多、来源很广，不同来源的纤维素酶其结构和功能相差很大，其次纤维素酶作用的底物比较复杂，反应产物不同，致使纤维素酶活力的测定方法复杂而不统一。
近年来随着多种交叉学科的快速发展，生物化学、分子生物学以及基因工程等相关领域的研究，促进了更多更新的纤维素酶活测定以及动力学研究方法的出现。
纤维素酶酶活测定方法——传统检测方法曾报道过传统纤维素酶测定方法很多，如微晶纤维素酶活测定方法、滤纸酶活(FPA)测定方法、水杨什酶活测定方法、、染色纤维素法、滤纸崩溃法、棉线切断法、梭甲基纤维素钠盐(CMC-Na)酶活性测定方法、棉花糖法、CMC粘度降低法、荧光定糖法平板法。
纤维素酶系总的糖化能力的测定常见有三种一是通过测定荧光物质的荧光强度的大小，来计算其还原糖含量的荧光法，其主要是根据还原糖与反应液生成荧光物质。
二是滤纸酶活(FPA)测定法，纤维素酶系总的糖化能力，通过以滤纸为底物经纤维素酶水解后生成的还原糖的量表征，因为滤纸是聚合度和结晶度都居“中等”的纤维性材料。
三是滤纸崩溃法，以滤纸完全崩溃为粉末状所需的时间来表征纤维素酶的活力，在容器内加入缓冲液和适当稀释的酶液，放入一定尺寸的滤纸条，一定温度条件下反复振荡。
外切葡萄糖什酶活力的测定有棉花糖化法方法和微晶纤维素酶活测定方法两种。
两者均采用DNS显色法，通过计算还原糖的量来表征外切葡萄糖什酶活力，主要是利用纤维素酶降解微晶纤维素、棉。
纤维素酶中内切葡萄糖什酶对CMC-Na有降解能力，因此内切葡萄糖什酶活力的表征主要为CMC-Na酶活性测定方法。
用标准葡萄糖溶液作标准曲线，通过DNS 法显色，针对内切葡萄糖什酶与CMC-Na降解生成的葡萄糖等还原糖，以每分钟生成相当于1 I} mol的葡萄糖所需酶量定义为一个酶活性单位，使用分光光度计测其吸光度。
B一葡萄糖什酶活性的测定常用方法有三种:一是将它们衍生为无荧光的底物，因为伞形酮(7一羚基香豆素)与4一甲基伞形酮具有强烈荧光的特点，使用荧光法进行测定;二是Banish和Swiain法，它以水杨什作底物，使释放出来的水杨醇显色(或DNS显色)，酶解产物用4一氨基安替比林作显色剂，再用分光光度法比色测定;三是以对一硝基苯一I}一葡萄糖什为底物进行酶解，底物水解后释放出的配基对硝基苯酚可直接在100}120nm波长范围内测定。
实验室滤纸酶活的测定
纤维素酶一般至少由三种以上的酶组成，因此其综合酶活力测定一般用滤纸酶活来表示。
滤纸酶活测定主要依据纤维素酶水解滤纸产生还原糖的数量，因此，首先要进行绘制葡萄糖标准曲线。
（1）测定葡萄糖含量的标准曲线绘制 制作葡萄糖标准曲线方法见表1：表1 葡萄糖标准曲线以上6只试管加3 mL DNS 煮沸5 min 立即冷却，加4.5 mL 超纯水，以0号试管对作为空白调零，测定其他试管中葡萄糖溶液的OD 540值。
根据葡萄糖浓度和测得的OD 值做葡萄糖浓度—吸光度曲线。
标准曲线：B Ax Y -=Y ——吸光度值。
x ——葡萄糖浓度（g/L ）。
（2）纤维素酶酶活的测定按表2，先对待测酶液进行100倍稀释（将酶进行稀释是为了使测得OD 值处于0.1~1.0之间，提高结果的准确性，不同酶样品此处稀释倍数不同），然后根据不同处理加入底物和酶液等组分：表2 TX3发酵液中纤维素酶活的测定处理方式纤维滤纸质量（mg ）酶液（ml ） 缓冲液（ml ） DNS(ml)底物空白 0 0.5 1 3 酶空白 50 0 1.5 3 实验组(3个平行)500.513 葡萄糖（ml ）去离子水（ml ） DNS(ml) 反应体系中葡萄糖浓度（mg/ml ）0 1.5 3 0 0.1 1.4 3 0.067 0.2 1.3 3 0.133 0.3 1.2 3 0.200 0.4 1.1 3 0.267 0.51.030.333水对照0 0 1.5 3 所有试管在50℃反应60min后，加入3 mL DNS煮沸5 min，立即冷却，最后加入4.5 mL超纯水，以水对照作为空白，测实验组、底物空白和酶空白的OD值。
λ540实验组的OD值在依据标准曲线换算成葡萄糖浓度前，要减去底物空白和酶空白的OD值。
（3）酶活的计算先将实验组所测定OD值，依据标准曲线换算成葡萄糖含量，再依据酶活定义折算成相应酶活。
纤维素酶活力定义：pH 7.0，50℃条件下，每小时分解滤纸产生1 mg还原糖所需酶量定义为一个酶活力单位（U）。
两种常用纤维素酶活力测定方法滤纸酶活-CMC酶活
检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(F PA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。
是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。
代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1mi n催化纤维素生成lu g葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(F PA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液l ml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6c m)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴l Omin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmi n后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlO OO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。
纤维素酶的CMC酶活测定条件的研究
网络出版时间：2012-11-06 14:59网络出版地址：/kcms/detail/11.1759.TS.20121106.1459.006.html纤维素酶的CMC酶活测定条件的研究孙盈田永强赵丽坤(兰州交通大学化学与生物工程学院，甘肃兰州730070)摘要：本实验研究和分析了CMC酶活性测定法的实验条件。
通过单因素实验对酶促反应时间、酶促反应温度、pH、测定波长、底物浓度、粗酶液和底物添加量六个影响因素进行了研究。
最后结合正交实验、方差分析和多重比较,确定了纤维素酶活力测定的最佳条件组合。
结果表明，在pH6.2、粗酶液和底物添加量各为2mL的情况下，影响纤维素酶活力测定的主次因素依次为酶促反应时间、酶促反应温度、测定波长和底物浓度。
纤维素酶活力测定的最佳条件为：在酶促反应温度为40℃，pH6.2，底物浓度为10g/L，粗酶液和底物添加量各为2mL，酶促反应时间30min，测定波长为520nm。
关键词：纤维素酶，酶活力测定，条件Study on The Optimum Conditions of Determination of Cellulase ActivitySun Ying Tian Yongqiang Zhao Likun(School of Chemical and Biological Engineering, Lanzhou Jiaotong University，Lanzhou 730070,China)Abstract: The experimental conditions of CMC enzyme activity assay were researched. Six influencing factors:enzymatic reaction time, reaction-temperature, pH, detective wavelength, substrate concentration, crude enzymeand substrate addition were studied by a single factor test. Finally, orthogonal experiment, variance analysis andmultiple comparisons were married together, and the optimum conditions of determination of CMC enzymeactivity were determined. The results showed that, when the volume of crude enzyme and substrate were 2mL andpH6.2, the primary and secondary factors which affected cellulase activity were enzymatic reaction time, reactiontemperature, enzymatic determination of wavelength and substrate concentration. Experiments showed that: theenzymatic reaction temperature 40℃, pH6.2, substrate concentration 10g/L, the volume of crude enzyme andsubstrate were 2mL, enzymatic reaction time 30min, and the detective wavelength at 520nm were the optimumconditions for the determination.Key words: Cellulase; the determination of enzyme activity; condition中国分类号：TS207.3 文献标识码：A纤维素是地球上最古老、最丰富的天然高分子，也是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，是取之不尽用之不竭、人类最宝贵的天然可再生资源，占植物界碳含量的50%以上[1]。
纤维素酶高产细菌的筛选、鉴定及酶学特性分析
纤维素酶高产细菌的筛选、鉴定及酶学特性分析作者：李碧婵陈金燕苏雅娜张敏来源：《湖北农业科学》2016年第17期摘要：从武夷山森林腐烂枯叶及附近土壤中筛选分离得到1株产纤维素酶活力较高的菌株CS-7。
通过形态特征观察和16S rDNA序列分析，将其鉴定为蜡状芽胞杆菌（Bacillus cereus）。
对菌株CS-7所产纤维素酶的相关酶学特性进行研究，结果表明，该菌株所产纤维素酶CMC酶活为7.91 U/mL，FPA酶活为2.40 U/mL；酶的最适反应温度和最适反应pH分别为60 ℃和6；在40～50 ℃温度范围内热稳定性较好；在pH 5.0～7.0范围内pH稳定性较好。
研究结果表明，CS-7菌株是能产生耐高温中性纤维素酶的菌株，具有进一步研究开发利用的潜力。
关键词：纤维素酶；筛选；CMC酶活；滤纸酶活；酶学特性中图分类号：Q936 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）17-4572-05DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.17.053Abstract： A cellulase producing strain CS-7 was isolated from soil samples collected from forest decayed leaf and soil around Wuyishan. Based on morphological and physiological characterization， CS-7 was characterized as Bacillus cereus. The enzymatic properties of cellulase from CS-7 were studied. The results showed that the CMCase activity of enzyme produced by CS-7 was 7.91 U/mL. The FPase activity was 2.40 U/mL. The optimal conditions for the enzymatic reaction were 60 ℃ and 6.0. The enzyme preparations of CS-7 strain were stable at 40～50 ℃ and pH 5.0～7.0. These results indicated that microbial strain CS-7 could produce heat-resistant neutral cellulase which has great potential for further exploration and utilization.Key words： cellulase； screening； CMCase； FPase； enzymatic property纤维素是葡萄糖通过β-1，4糖苷键连接而成的线性多糖，由绿色植物光合作用产生，是自然界中分布最广、储量最多的碳水化合物，是植物细胞壁的主要成分[1]。
实验报告
产纤维素酶菌株的分离、筛选和酶条件的选择史庚林(河西学院张掖 734000)摘要：采用摇床液体发酵试验, 对18 个菌株产纤维素酶进行滤纸酶活性、CMC 酶活性、B2葡萄糖苷酶活性测定, 筛选出1株产纤维素酶活性较高的菌株(C真3) , 并通过正交试验, 确定该菌株的最优产酶条件。
结果表明, 最佳组合条件是液体发酵时间7 d, 摇床培养温度30 ℃, 起始粗酶发酵培养基pH 值5. 5。
关键词：纤维素酶分离筛选引言：纤维素是地球上最丰富的有机物质, 是植物细胞壁的主要组分, 广泛存在于自然界中。
1906 年Seillieve 在蜗牛的消化液中发现了分解纤维素的纤维素酶之后[1] , 人们开始对纤维素酶进行大量的研究和探讨, 其中以纤维素转化成糖作为主要目标。
20 世纪70 年代, 美国、日本、西德等发达国家已工业化生产纤维素酶制剂, 它可将丰富的纤维资源转化为再生资源, 解决能源、饲料和食品供应的不足。
我国20 世纪70 年代也开始这方面的研究, 并在酒精、白酒、酱油等行业进行实质性的应用.自然界中能够降解和利用纤维素的微生物种类繁多, 包括真菌、放线菌、部分酵母菌等[2]。
本文通过摇瓶产酶培养的方法, 从18个土壤或香菇栽培而污染的菌筒中分离获得的菌株中筛选出1株酶活性较高的菌株, 并确定其产酶的优化条件, 以便为这一菌株的应用提供参考依据。
1材料与方法1. 1 菌种从土壤或栽培香菇的烂筒中分离了18 株菌株: C真3、C放1、J1、E细2、S4、H真6、E细3白、J1白、K真2、I2、E细1、B放1、C真11、土木、C放2、N真1、E细3、M细4, 均由福建农林大学生命科学学院微生物教研室提供; 以康氏木霉13032(T richod erma koninig ii) 为对照菌株。
1. 2 培养基的制作1. 2. 1斜面菌种培养基马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA ):马铃薯（去皮）200g，蔗糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml,自然pH值[3]。
不同 酶活 测定方法
酶活测定方法羧甲基纤维素酶(CMC酶)活力测定取.05%CMCNa溶液lml,加入PH4.8,0.1M乙酸缓冲溶液4mL,蒸馏水lml,酶液1mL,于50℃水浴中糖化30min,取出,立即于沸水中煮沸15 min使酶失活,得糖化液,取糖化液lml,加3,5-DNS显色剂2mL,在沸水中显色15min,冷却后加蒸馏水22ml,摇匀,在550nm处比色。
以每分钟催化CMC水解生成1微克葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。
淀粉酶活力测定在试管中加入1%可溶性淀粉溶液(用pH4.8,0.1M乙酸盐缓冲溶液配制)1mL, 加入pH4.8,0.1M乙酸缓冲溶液4mL,蒸馏水1mL,酶液lmL,40℃水浴中保温30min,以后操作与羧甲基纤维素酶(CMC酶)活力测定相同。
定义以每小时酶促生成lmg葡萄糖的酶量定为一个酶活力单位。
漆酶活力测定O.1MpH4.5的乙酸缓冲液3.4ml,加入3.36mM的邻联甲苯胺1mL,再加入适当稀释的粗酶液0.5mL,25℃保温30min,756MC紫外可见分光光度计测600nm处的OD值。
定义每分钟引起0.01个吸光度的增加所需的酶液量为一个酶活力单位。
超氧物歧化(SOD)酶活性的测定1.将反应介质与核黄素按39:1比例混合。
2.在同样的六支试管,各加入反应介质与核黄素混合液4ml,再在测试管中加入酶液50ml,两支对照管中不加入酶液,可用50mL提取介质代替酶液。
3.照光1小时后测定样品在560nm处吸光度。
4.定义将硝基四哇蓝的还原抑制到对照一半(50%)时所需的酶量为一个酶活力单位。
过氧化物酶(POD)活性测定取光径1cm比色杯两只,在一只中加入反应混合液3 mL,以KH2PO41 mL作为校零对照,另一只比色杯中加入反应混合液3 mL。
酶液l mL(如酶活性过高可稀释之),立即开启秒表记录时间,反应20分钟后,于分光光度计上测量吸光度值,读数于波长47Omn下进行。
过氧化氢酶(CAT)活性的侧定反应完毕后,加入20% KI 1mL,三滴10% 钼酸按,4滴1%淀粉,用0.02N硫代硫酸钠滴定至蓝色刚好消失。
酶活性测定
所测酶包括：滤纸酶（总酶活）、纤维素内切酶（CMC酶）、纤维素外切酶（微晶纤维素酶）、β-葡萄糖甘酶（纤维二糖酶）和木聚糖酶。
1.培养基使用PCS培养基。
添加0.5%滤纸和1%秸秆，在50℃下静置培养。
2.底物所使用的底物分别为滤纸条50mg，2%（w）的羧甲基纤维素钠，2%（w）的微晶纤维素粉，0.5%（w）的水杨苷和1%（w）的燕麦木聚糖。
3.标准曲线绘制标准空白样：吸取3.5缓冲液4.0mL，加DNS 5.0mL，震荡后沸水浴5min，然后迅速用冷水冷却至室温，用蒸馏水定容至25mL，震荡摇匀。
葡萄糖：分别吸取葡萄糖溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0mL，分别用3.5缓冲液定容至100mL，配成浓度为0.10~0.70mg/mL的葡萄糖标准液。
分别吸取上述浓度系列的葡萄糖各2.0mL（2个平行），分别加入到7个试管中，在分别加入2mL蒸馏水和5mLDNS试剂，震荡均匀后沸水浴加热5分钟，然后迅速用冷水冷却至室温，定容至25mL，摇匀。
以标准空白样为对照调零，在540nm处测吸光值。
以葡萄糖浓度为y轴，吸光值为x轴。
4.酶活性的测定4.1 粗酶液的提取200mL三角瓶中配制180mLPCS培养基，接入20mL菌种，50℃下静止培养12d，每天取样1次。
每次取样时，定量称取新鲜的培养物，置于研钵中，加入15mL的去离子水，研碎之后转入离心管中，振荡1min，8000r/min离心10min，收集上清液，得到相应复合菌系的粗酶液。
4.2 滤纸酶的测定取1mL酶液，以滤纸为底物于50℃恒温水解反应30-60min，然后加入显色剂DNS 3mL，沸水浴中煮沸5min，显色后冷却至室温，在540nm处测定吸光值。
4.3 CMC酶活的测定取1mL酶液，以0.5ml2%（w）的羧甲基纤维素钠为底物于50℃反应30-60min，然后加DNS试剂3mL，，煮沸5min，显色后冷却至室温，在540nm处测定吸光值。
纤维素酶高产菌的筛选和鉴定
纤维素酶高产菌的筛选和鉴定魏亚琴;邵建宁;麻和平;张文齐;杨勇;刘彩云;赵昊星;慕婷婷【摘要】从兰州榆中县兴隆山国家自然保护区采集土样,先用羧甲基纤维素钠刚果红培养基筛选出79株Hc值较大的产纤维素酶菌株,再经液体发酵复筛测CMC酶活和滤纸酶活.结果表明,经复筛后菌株No-15A的纤维素酶活力最高,羧甲基纤维素酶活1 376.20 U/mL,滤纸酶活497.78 U/mL,其粗酶液分解滤纸快速明显,且该菌株生长速度最快,每日菌落直径增长量为4～5 cm.经形态学初步鉴定菌株No-15A 属青霉.【期刊名称】《食品与机械》【年(卷),期】2010(026)005【总页数】4页(P19-21,25)【关键词】纤维素酶;羧甲基纤维素酶活;滤纸酶活;青霉【作者】魏亚琴;邵建宁;麻和平;张文齐;杨勇;刘彩云;赵昊星;慕婷婷【作者单位】甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000;兰州大学生命科学学院,甘肃,兰州,730000;甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000;甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000;甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000;南开大学生命科学院,天津,300071;甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000;甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000;甘肃省科学院,甘肃,兰州,730000【正文语种】中文纤维素是自然界分布最广泛、最丰富、最廉价的多糖物质，是植物细胞壁主要成分［1］，也是地球上年产量最大，具有巨大潜力的可再生天然资源。
据估计，纤维素生成量每年高达1 000多亿t，中国每年农作物秸秆总产量为7亿多t，仅农业生产中形成的农作物残渣，如稻草、玉米秸、麦秸，每年就5亿t之多［2］，目前这些资源大部分通过简单焚烧，在浪费能源的同时也对环境造成污染。
随着石油、煤炭、天然气等不可再生资源日渐耗竭，有效转化，科学利用数量极其庞大的纤维素资源具有广阔的前景［3］。
利用纤维素酶水解纤维素成葡萄糖并进一步发酵转化成燃料乙醇、SCP饲料蛋白和各种平台化合物等，对缓解全球能源危机、饲料资源和化工原料紧张，保护环境等均具有重大意义［4］。
纤维素酶活力测定方法
５
塞 妒 蕾
０
５
图２葡萄糖标准曲线
２．５底物的选择对酶活力的影响 目前理论认为，大多数由微生物产生的纤维素酶 是一个多组分酶系，主要含有三种组分：内切ｐｌ，４一葡 聚糖酶、外切８ １，４一葡聚糖酶和ｐ—ｌ，４葡萄糖苷酶。其 中，内切（ｅｎｄｏ一）酶能进攻纤维素大分子链的中间部 位，任意地切断大分子，而生成较短的链；而外切 （”ｍ）酶仅从纤维索大分子链的非还原性末端切下 一个个纤维二糖；６－葡萄糖苷酶则把低分子葡聚糖催
Ｉ。＝（０．８３：
１），杰能科：ＰＬＵＳ Ｉ。一（０．６７；１）。这与不同酶的
Ｉ。，ＰＬＵＳ Ｌ一１：
我们选择三种酸性纤维素酶，分别以滤纸和ＣＭＣ 为底物，其酶括力（ＦＰＡ和ＣＭＣ…）的测试数据结果如
表ｌ所示。
表１不同酶种的滤纸酶活（ＦＰＡ）和ＣＭＣ酶活（ＣＭＣ。。）
结论
从表ｌ可知，ＣＭＣａｓｅ和ＦｐＡ两种酶活的大小顺 序是：杰能科＞ＮＯＶＯ Ｌ＞ＰＬＵＳ Ｌ。这几种酶的内切 酶活（ＣＭＣ。）较高，且比总酶活（ＦＰＡ）大，几乎相差一 个数量级，这说明酶对水溶性底物有很高的活力．而滤 纸与酶属多相催化，酶也是高分子物，所以反应的空间 阻碍较大，这也表明了吸附对酶的活性部位与纤维素 分子链段的结合及催化均有很大影响。 ２．６纤维素酶活与织物酶减量率的关系 用这几种酶对织物进行整理，织物的减量率与酶 种及酶量的关系如图３所示。从图３可看出，当三种酶 的用量分别为２％、４％、６％、８％、ｌＯ％（ｏｗｆ）时，对 应的减量率的比值平均（杰能科：ＮＯＶＯ
２墨：：！！：竺！：
＝＝兰２兰垒竺竺竺
《藏蠹ｊ
摘
纤维素酶活力测定方法
张瑞萍 南通工学院（２２６００７）
要用ＤＮＳ为显色剂，分别以滤纸和ＣＭＣ为底物，“滤纸糖酶括性（ＦＰＡ）和羧甲基纤维索酶活性（ＣＭＣｍ）表征
纤维素酶活力测定方法
印 染 （０ ２Ｎ ． ） ２ ０ ｏ ８ ｗ ｗ． ｄ ｎ．ｃ ｉ ｃ ｆ ｏ ｎ．ｃ ｎ
。
’
纤 维 素 酶 活 力 测 定 方 法
张 瑞 萍 南 通 工 学 院 （ ２ ０ ７ ２６０）
． ＞ ． ＞ ．＜＞ ．＜ ＞ ． ＞ ．＜＞ ． ＜ ＜ ＜
ｊ０６／『 ｇｌ
・
…
０ ｇ／ ８ ｔ
｝ １０ ／ ｊ ・ ． ｇ ｉ
Ｉ ２ Ｉ Ｉ ｇ， ＿
ｉ １ ４ Ｉ ｇ
１ ２ Ｆ Ａ 滤 纸 酶 活 力 和 Ｃ Ｃ 酶 活 力 的测 定 ． Ｐ Ｍ
１ ｇ／ ６ ＬＩ
２ ｇ ０ Ｌ
取 适 当稀 释 的 酶 液 ， 别 以滤 纸 或 １ 的 ＣＭＣ溶 分
酶 活 可 定 义 为 ： 毫 升酶 液 １ｍｉ 每 ｎ产生 １ｍｇ葡 萄
糖为一个单位 （ 。 ）
１ ３ 针 织 物 酶 减 量 率 的 测 定 ．
在 实 验 过 程 中发 现 ， 物 特 别 是 滤 纸 ， 含 有 一 定 底 也 的还原糖 ， 碱性 的 Ｄ 在 ＮＳ试 剂 中也 会 发 色 。 且 ， 验 而 试 所 用 的纤 维 素 酶 是 一 种 工 业 级 的 复 合 酶 ， 种 不 同 ， 品 其 本 身 含 糖 量 也 不 同 。 了 排 除 这 类 还 原 糖 的干 扰 ， 比 为 参 溶 液 取 失 活后 的 酶 、 物 、 底 ＤＮＳ等 共 热 的 反 应 物 。 ２ ４ 葡 萄 糖 标 准 曲线 ．
糖 酶 活 力 ） Ｃ Ｃ （ 甲基 纤 维 素 酶 酶 活 力 ） 本 文 和 Ｍ 羧 。
Ｄ ＮＳ（ 色 ） 黄
３氨 基 一一 基 水 杨 酸 （ 红 色 ） － ５硝 棕
四种纤维素酶酶活测定方法的比较
四种纤维素酶酶活测定方法的比较一、本文概述纤维素酶是一类能够水解纤维素链中β-1,4-糖苷键的酶类，它们在生物降解纤维素以及纤维素类物质的转化利用中发挥着至关重要的作用。
由于纤维素酶在纺织、造纸、生物燃料、食品工业等多个领域的广泛应用，对其酶活性的准确测定就显得尤为重要。
本文旨在比较四种常用的纤维素酶酶活测定方法，包括滤纸酶活法、羧甲基纤维素钠（CMC）酶活法、对硝基苯酚纤维二糖法（pNPC）和荧光底物法，以期为读者提供一个全面而深入的理解，帮助研究者根据实验需求选择合适的测定方法。
本文将首先简要介绍纤维素酶的重要性和应用领域，然后详细阐述这四种酶活测定方法的原理、操作步骤、优缺点以及适用范围。
通过对比这些方法的灵敏度、准确性、重现性、操作简便性等方面，我们将为读者提供一个清晰的方法选择指南。
本文还将讨论影响酶活测定准确性的因素，并提出相应的改进措施，以期提高纤维素酶酶活测定的准确性和可靠性。
我们将对纤维素酶酶活测定方法的未来发展趋势进行展望，以期为相关领域的研究和应用提供参考和借鉴。
二、方法介绍纤维素酶是一种能够水解纤维素链中β-1,4-糖苷键的酶类，其酶活测定对于了解纤维素酶的性质、优化酶的生产工艺以及评估其在各种工业应用中的效率至关重要。
目前，常见的纤维素酶酶活测定方法主要包括滤纸酶活测定法、羧甲基纤维素钠（CMC）酶活测定法、还原糖法以及荧光底物法。
滤纸酶活测定法：此方法是基于纤维素酶对滤纸的水解能力。
在一定条件下，纤维素酶将滤纸水解成还原糖，通过比色法或滴定法测定还原糖的含量，从而推算出纤维素酶的活性。
该方法操作简单，但受滤纸质量、实验条件等因素影响，结果可能存在一定误差。
羧甲基纤维素钠（CMC）酶活测定法：该方法以羧甲基纤维素钠为底物，通过测定酶解后释放的还原糖量来计算纤维素酶的活性。
该方法具有底物纯度高、反应条件易控制等优点，因此在许多研究中得到广泛应用。
然而，CMC与天然纤维素的结构差异可能导致测定的酶活与实际应用中的酶活不完全一致。
纤维素酶的检测方法新
纤维素酶的检测方法新-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1纤维素酶的检测方法摘要：本文主要介绍了纤维素酶的降解原理，通过实验比较了四种常用纤维素酶的检测方法的稳定性，以及纤维素酶的发展前景，为纤维素酶的应用提供了进一步的参考价值。
关键词：纤维素酶酶活测定葡萄糖回归方程一、纤维素酶及其降解原理纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，占植物总干重的30%-50%，是地球上分布最广，含量最丰富的可再生性碳源化合物，占地球总生物量的40%。
据报道，我国每年光作物秸秆，稻梗等含纤维素较丰富的物质就有5亿吨之多，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达吨，其中尚有89%未被人们利用，而大量的秸秆，稻梗等含纤维素丰富的物质的利用率也很低。
大多采用燃烧的方式来处理，这样就造成了环境污染，破坏了土壤的理化性质和丧失了有机质成分。
所以，纤维素的充分利用与有效的转化对于解决当前的能源危机，粮食短缺，环境污染等有重大意义。
纤维素酶是分解纤维素的一类酶，它能将纤维素分解为葡萄糖，充分的利用了纤维素。
自1906年Sellieres 在蜗牛消化液中发现纤维素酶以来，纤维素酶的研究和应用受到了国内外学者的极大关注，取得了很大进展。
目前，国内外学者通过筛选产酶菌株来发酵产酶，再应用纤维素酶到食品，医药，饲料，洗涤等工业中，不仅解决了纤维素的再利用问题还取得了很可观的经济效益。
纤维素酶是由许多具有高协同作用的水解酶组成的。
习惯上将纤维素酶分成三种主要成分：内切酶（内切β-1,4-葡萄糖酶，也称Cx酶）、外切酶（外切β-1,4葡萄糖酶，也称C1酶）、β-1,4葡萄糖酶（即为纤维二糖酶）[1]。
C1酶主要作用于天然纤维素，使之转变为非结晶的纤维素。
Cx酶又分为Cx1酶和Cx2酶。
Cx1酶是一种内断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-（1,4）糖苷键，生成纤维糊精和纤维二塘。
Cx2酶是一种外断型纤维素酶，它从水合性纤维素分子的非还原端作用于β-（1,4）糖背键，逐步切断β-（1,4）糖节键生成葡萄糖。
纤维素酶活力的测定方法
纤维素酶活力的测定方法1 原理纤维素酶是一种复合酶。
酶系包括外切B-1.4-葡聚糖酶（ExoB-1.4glucanase,EC3.2.1.9）内切B-1.4葡聚糖酶（Endoβ-1.4-glucanase,EC1.2.1.4）和纤维二糖酶。
纤维素酶在一定温度和PH条件下，将纤维素酶底物（滤纸或羟甲基纤维素钠）水解，释放出还原糖。
在碱性，煮沸条件下，3.5-二硝基水杨酸（DNS试剂）与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖（与葡萄糖汁）含量成正比。
通过在540nm测定吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的FPA酶和CMCA酶活力，以此代表纤维素酶的酶活力。
2 操作A.FPA酶A.1绘制标准曲线按表1规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液、缓冲溶液和DNS试剂加入各管中，混匀。
表1葡萄糖标准曲线管号葡萄糖标准使用溶液缓冲液吸取量 DNS试剂吸取量ml 浓度mg/ml 吸取量ml 0 0.0 0.00 2.0 3.01 1.0 0.50 1.5 3.02 1.5 0.50 1.5 3.03 2.0 0.50 1.5 3.04 2.5 0.50 1.5 3.05 3.0 0.50 1.5 3.06 3.5 0.50 1.5 3.0将标准管同时置于沸水浴中，反应10min。
取出，迅速冷却至室温。
用水定容至25ml，盖塞，混匀。
用10mm比色杯，在分光光度计波长540nm处测量吸光度。
以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。
线性回归系数应在0.9990以上时方可使用（否则须重做）。
A.2 样品的测定A.2.1待测酶液的制备称取固体酶样1g，精确至0.1mg（或吸取液体酶样1ml,精确至0.01ml），用水溶解，磁力搅拌混匀，准确稀释定容（使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.3-0.4范围内），放置10min，待测。
A.2.2 滤纸条的准备----将待用滤纸放入（硅胶）干燥器中平衡24h----将水分平衡后的滤纸制成宽1cm、质量为（50±0.5）mg的滤纸条，折成M型，备用。
纤维素酶的滤纸酶活和CMC酶活的测定
52
印染助剂
19 卷
2 结果与讨论
2. 1 显色剂的选择 本试验选用3 ,5 - 二硝基水杨酸 (DNS) ,在碱性
条件下 ,与还原糖反应 ,生成有色化合物 ,通过分光 光度计进行比色测定 ,确定低分子糖的量.
DNS 黄色试剂在碱性条件下与还原糖共热反应 生成的棕红色氨基化合物3 - 氨基 - 5 - 硝基水杨酸 为比色法的测定基础物.
以上职位人员要求作风正派 、责任心强 ,一经录用 ,待遇优厚 。欢迎条件合适者将个人简历 、
联系电话、地址连同近照一张、身份证及有关证书复印件寄 : 广东省汕头市潮汕路金园工业城五 A2 - 2 汕头市联胜化工厂有限公司收 ,邮编 :515021合则约见 ,来件资料负责保密 ,恕不退回 ,谢绝来访。
第 19 卷第 5 期 2002 年 10 月
印染助剂 TEXTILE AUXILIARIES
Vol . 19 No. 5 Oct. 2002
纤维素酶的滤纸酶活和 CMC 酶活的测定
张瑞萍
(南通工学院 , 江苏南通 226007)
摘 要 : 采用3 ,5 - 二硝基水杨酸 (DNS) 为显色剂 、滤纸或 CMC 为底物 ,测定纤维素酶的滤纸酶活 ( FPA) 和 CMC 酶活 (CMCA) .
作为底物的滤纸结构较为松散 ,可及区较多 ,非 还原性末端也较多 ,容易同时被 endo - 酶和 exo - 酶 降解 ,再由β - 葡萄糖苷酶分解成葡萄糖等还原糖 . 用比色法定量测定还原糖的生成量 ,可反映纤维素 酶的总酶活 FPA. 由于 exo - 酶对纤维素链的专一性 高 ,而 endo - 酶的专一性较低. 在降解羧甲基纤维素 ( CMC) 时 ,主要是反映 endo - 酶的活力.
[知识]两种常用纤维素酶活力测定方法---滤纸酶活-CMC酶活
![[知识]两种常用纤维素酶活力测定方法---滤纸酶活-CMC酶活](https://img.taocdn.com/s3/m/42357e4776232f60ddccda38376baf1ffc4fe322.png)
检测纤维素酶酶活力—滤纸酶活力(FPA)滤纸酶活力代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
采用3，5一二硝基水杨酸法测定酶活：(简称DNS法)1、原理：纤维素经纤维素酶水解后生成还原糖，还原糖能将3，5一二硝基水杨酸中硝基还原成氨基，溶液变为橙色的氨基化合物，即：3一氨基一5二硝基水杨酸，在一定的还原糖浓度范围内，橙色的深度与还原糖的浓度成正比，据此可以推算出纤维素酶的活力。
2、采用的滤纸酶活单位定义：滤纸酶活反映了纤维素酶的3种水解酶，即内切型葡聚糖酶、外切型葡聚糖酶和β葡聚糖苷酶组成的诱导复合酶系的协同水解纤维素能力。
是该菌株整个纤维素酶系的酶活力水平的综合体现。
代表了纤维素酶的三种酶组分协同作用后的总酶活。
在此滤纸酶活单位定义为：以滤纸为底物，在一定反应条件(pH4.8，50℃，恒温lh)下，以水解反应中，1ml纤维素酶液1min催化纤维素生成lug葡萄糖为1个滤纸酶活单位，以U表示。
3、滤纸酶活力(FPA)的测定：①取0．5ml适当稀释的酶液，加入PH值为4.8，0.1mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液lml或柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液lml；②再加入50±0.5mg滤纸(1cmx6cm)一条，于50℃保温酶解反应1小时，(先预热5分钟)；③加入DNS显色液3ml(标准曲线用量是1.5ml)，放入已沸腾的水中沸水浴lOmin，流水冷却后在540nm下测吸光度；④同时用100℃煮沸lOmin后失活的酶液做对照，扣除本底；⑤根据吸光度从葡萄糖标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，根据生成的葡萄糖克数计算出酶活值。
滤纸酶活按下面公式计算：X=（WxNxlOOO）／（TxM）X:为滤纸酶酶活力，单位U／mL。
W：为从葡萄糖标准曲线中查得的葡萄糖的浓度。
N：为酶液稀释总倍数。
T：为反应时间。
M：为样品的体积。
4、葡萄糖标准曲线绘制方法标准曲线绘制：取25ml具塞刻度试管6支，加入1.0 mg /ml的葡萄糖标准溶液0.0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0ml,加蒸馏水2.0、1.6、1.2、0.8、0.4、0.0ml,加DNS试剂1.5 ml，混匀后在沸水浴中加热5分钟，取出立即用冷水冷却，用水定容至25 ml，摇匀，测吸光度A，以吸光度为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。
三种主要酶活测定方法
土壤纤维素酶活性测定（3,5- 二硝基水杨酸比色法）一、原理纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。
在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。
所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。
纤维素酶解所生成的还原糖与3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。
二、试剂1）甲苯2）1%羧甲基纤维素溶液：1g 羧甲基纤维素钠，用50%的乙醇溶至100ml。
3）pH5.5醋酸盐缓冲液：0.2mol/L 醋酸溶液 11.55ml 95% 冰醋酸溶至1L.0.2mol/L 醋酸钠溶液 16.4g C2H3O2Na或27.22g C2H3O2Na.3H2O溶至1L.取11ml 0.2mol/L 醋酸溶液和88ml 0.2mol/L 醋酸钠溶液混匀即成PH 5.5醋酸盐缓冲液. 4）3,5-二硝基水杨酸溶液：称1.25g二硝基水杨酸，溶于50ml 2mol/LNaOH和125ml水中，再加75g酒石酸钾钠，用水稀释至250ml（保存期不过7天），5）葡萄糖标准液（1mg/mL）预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。
准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。
若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。
三、操作步骤葡萄糖标准曲线：分别吸1mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL 于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
称10g土壤置于50ml三角瓶中，加入1.5ml甲苯，摇匀后放置15min，再加5ml 1%羧甲基纤维素溶液和5ml pH5.5醋酸盐缓冲液，将三角瓶放在37℃恒温箱中培养72h。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
分析确定了酶活测定用波长为530nm ,参比溶液应为失活酶 、底物和 DNS 等共热的反应物 ,比较了两种底物的酶活测定方法 ,结果表
明 :纤维素酶的 CMC 酶活比滤纸酶活高 ,酶对水溶性底物有较高的活力 ,吸附对酶的活性部位与纤维素分子链段的结合及催化均有
很大影响.
关键词 : 纤维素酶 ; 酶活 ; 测定
本试验选择了3种酸性纤维素酶 ,分别以滤纸和 CMC 为底物 ,其酶活 ( FPA 和 CMCA) 的测试数据结果 如表1所示.
表1 不同酶种的滤纸酶活 ( FPA) 和 CMC 酶活 (CMCA)
酶种 杰能科
CMCA 528. 16
酶活/ u
FPA 71. 63
NOVO L
417. 40
30. 92
第 19 卷第 5 期 2002 年 10 月
印染助剂 TEXTILE AUXILIARIES
Vol . 19 No. 5 Oct. 2002
纤维素酶的滤纸酶活和 CMC 酶活的测定
张瑞萍
(南通工学院 , 江苏南通 226007)
摘 要 : 采用3 ,5 - 二硝基水杨酸(DNS) 为显色剂 、滤纸或 CMC 为底物 ,测定纤维素酶的滤纸酶活( FPA) 和 CMC 酶活 (CMCA) .
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
52
印染助剂
19 卷
2 结果与讨论
2. 1 显色剂的选择 本试验选用3 ,5 - 二硝基水杨酸 (DNS) ,在碱性
条件下 ,与还原糖反应 ,生成有色化合物 ,通过分光 光度计进行比色测定 ,确定低分子糖的量.
DNS 黄色试剂在碱性条件下与还原糖共热反应 生成的棕红色氨基化合物3 - 氨基 - 5 - 硝基水杨酸 为比色法的测定基础物.
NO2 OH COOH + 还原糖
NH2 OH COOHNO2Fra bibliotekNO2
2. 2 最大吸收波长的确定 根据物质的颜色和吸收光颜色的关系 ,以及 DNS
从图2 可知 ,标准曲线 y = 2. 0666 x + 0. 1362 , 线 性相关系数 R2为0. 9991 ,线性相当好 ,可以用于酶活 力的测定. 2. 5 底物的选择对酶活的影响
大多数由微生物产生的纤维素酶是多组分的酶 系 ,主要含有3种组分 : ( 1) endo - β - 1 ,4 - 葡聚糖酶 ; ( 2) exo - β - 1 ,4 - 葡聚糖酶 ; ( 3)β - 1 , 4 - 葡萄糖苷 酶. 其中 ,endo - 酶能进攻纤维素大分子链的中间部 位 ,任意地切断大分子成较短的链 ;而 exo - 酶则仅能 从纤维素大分子链的非还原性末端切下一个个纤维 二糖 ;β - 葡萄糖苷酶则把低分子葡聚糖催化分解成 葡萄糖. 纤维素酶复合体与纤维素纤维作用的最终 效果 ,是由各种酶综合作用所决定的.
所以 ,为了使酶在基质上充分发挥作用 ,至少要 满足两个条件 :首先 ,酶分子要非常接近 、附着于基 质 ,并和基质分子配位 ,形成中间络合物 (对基质的 亲和性) ;其次 ,以某种程度促进酶和基质分子的反 应 (对基质的活性) . 纤维素织物不溶于水 ,纤维素酶 在对其攻击时会有空间障碍 ,而吸附于纤维素上的 纤维素酶的活性又受时间的限制 ,在尚存活性时 ,如 果不与基质作用 ,就会失活. 所以 ,纤维素酶对基质
在实验过程中发现 ,底物特别是滤纸 ,也含有一 定的还原糖 ,在碱性的 DNS 试剂中也会发色. 而且 , 试验所用的纤维素酶是工业级的复合酶 ,品种不同 , 其本身含糖量也不同. 为了排除还原糖的干扰 ,参比 溶液取失活后的酶 、底物 、DNS 等共热的反应物. 2. 4 葡萄糖标准曲线
用不同浓度的葡萄糖溶液作为标准溶液 ,与 DNS 共热反应显色后 ,测出其吸光度 OD 值 ,结果如图 2 所示.
Z HAN G Rui-p i ng ( Nantong Institute of Technology , Nantong 226007 , China)
Abstract : With 3 ,5 - dinitro salicylic acid (DNS) a s develop er and filter paper or CM C a s the substrate , filter pa2 p er enzym e activity (FPA) and CM C enzym e activity ( CM CA) of cellula se w ere determined. Throu gh analysis , w ave length for determining enzym e activity w a s set a s 530nm . The reference solution should be the reactant of inactivated enzym e . substrate and DNS. The determination m ethods for two kinds of substrate s w ere com pared. The re sult indi2 cated that CM CA of cellula se is higher than FPA and enzym e is more active to w ater solable substrate . ad sorption ha s great influence on the bondin g of active part of cellula se with molecular chain of cellulo se and the catalysis .
将酶处理前后的试样在105 ℃烘箱中烘至恒重.
1 实验方法
减量率 = 处理前织物干质量 - 处理后织物干质量 ×100 % 处理前织物干质量
收稿日期 : 2002 - 03 - 18 作者简介 : 张瑞萍 ( 1964 - ) ,女 ,江苏南通人 ,副教授 ,硕士 ,从事酶在纺织品染整加工中的应用工艺及配套助剂的研究.
加盟联胜化工 ,踏上成功之路 !
联胜化工是专业生产和销售纺织助剂的精细化工公司 ,公司有完善的管理 , 发展前途广阔 ,在香港特区和大陆有完善的销售及售后服务网络 ,为适应公司的 快速发展 ,诚聘英才加盟我公司(长期有效) 。
纺织助剂开发工程师 要求本科以上学力 ,三年以上同行业生产或产品开发经验 ,有科研成果 ,在染整助剂领 域有特长者优先 。 营销经理 、营销人员 高中以上文化程度 ,45 岁以下 ,要求有多年熟悉本行业工作经验 ,有丰富的社会经验 及较强的业务开拓能力 ,工作环境可灵活安排 ,有汽车驾驶证者优先考虑 。
的接近 、附着不仅是单纯的物理结合 ,而且对纤维素 水解反应的影响也很大.
3 结论
3. 1 葡 萄 糖 浓 度 与 吸 光 度 OD 值 的 相 关 系 数 在 0. 9991以上 ,从而确定该标准曲线可用于酶的活力测 定. 3. 2 分析确定了 DNS 法测定活力的波长为530nm , 参比溶液应为失活酶 、底物和 DNS 等共热的反应物. 3. 3 底物不同 ,活力的测定值也不同 ,以羧甲基纤维 素为底物测得的酶活值 CMCA 比以滤纸为底物测得 的酶活值 FPA 高 ;这说明酶对水溶性底物有较高的 活力 ;也表明了吸附对酶的活性部位与纤维素分子 链段的结合及催化均有很大影响. 参考文献 :
1. 1 化学药品 、材料 纤维素酶 ( 工业品) ,DNS 试剂为自配 ,冰醋酸 、
醋酸钠 、葡萄糖均为分析纯 ,滤纸 ( 定性) 、羧甲基纤 维素钠 (试剂级) . 1. 2 FPA 滤纸酶活和 CMC 酶活的测定
取适当稀释的酶液 ,分别以滤纸或1 % CMC 溶液 为底物 ,于 50 ℃恒温水解反应 1h , 然后加入显色剂 DNS ,沸水浴中煮沸5min ,再加入蒸馏水 ,于530nm 测 定吸光度 OD 值 . 酶活定义 : 1ml 酶液 1min 产生 1mg 葡萄糖为一个单位 ( u) . 1. 3 织物酶减量率的测定
[ 1] C. H. 温著[ 英 ] . 罗 兰译. 酶的结构和功能[ M] . 北京 :科学技 术出版社 ,1983.
[ 2] 相尺孝亮著[ 日 ] . 黄文淘译. 酶应用手册[ M] . 上海 :上海科技出 版社 ,1986.
[ 3] Ghose T. Measurement of Cellulase Activities[J ] . Pure Appl . Chem , 1987 ,58( 2) : 257 - 268.
© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved.
5期
张瑞萍 :纤维素酶的滤纸酶活和 CMC 酶活的测定
53
的空间阻碍较大 ,这也表明了吸附对酶的活性部位 与纤维素分子链段的结合及催化均有很大影响. 另 外 ,从酶整理过程中机械处理条件对织物减量率的 影响 (如图3所示) ,也说明了这一点.
以上职位人员要求作风正派 、责任心强 ,一经录用 ,待遇优厚 。欢迎条件合适者将个人简历 、
Key words : cellula se ; enzym e activity ; determination
近年来 ,酶特别是纤维素酶在纺织工业上的应 用已受到纺织染整和生物工程界人士的高度关注. 纤维素酶是多组分的复合物 ,各个组分的底物专一 性不同 ;另外 ,纤维素酶作用的底物比较复杂 ,加上 反应产物不同 ,致使纤维素酶活的测定方法很多 ,各 国采用的方法亦不统一. 本试验选择滤纸 、CMC 为底 物 ,其原理为利用纤维素酶催化水解纤维素 ,产生纤 维多糖 、二糖及葡萄糖等还原糖与显色剂反应 ,求出 还原糖的浓度 ,再求出酶的活力. 由不同底物测得的 酶活分别称作 FPA(滤纸酶活) 和 CMCA( CMC 酶活) . 本实验分析酶活测定的主要条件 ,比较两种底物酶 活测定方法的结果 ,为生产中酶的利用提供了依据.