LDH法测定纤维蛋白胶对人脂肪干细胞的细胞毒性

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LDH法的原理及应用

LDH法的原理及应用1. 原理LDH（Lactate dehydrogenase）法是一种用于测定体液中乳酸含量的常用方法。

乳酸是生物体在无氧代谢过程中产生的一种代谢产物，其浓度的升高常常与某些病理状态相关，因此测定乳酸浓度可以帮助医生评估病人的代谢情况和疾病严重程度。

LDH法的原理基于乳酸在存在乳酸脱氢酶（LDH）的催化下与还原型辅酶Ⅱ（NADH）发生氧化还原反应，生成丙酮酸和NAD+。

该反应可通过测定NAD+的减少量或NADH的增加量来间接测定乳酸的浓度。

具体步骤如下：1.取一定体积的待测液样加入反应溶液中，其中包括乳酸脱氢酶、NADH和缓冲剂。

2.反应开始后，乳酸脱氢酶催化乳酸与NADH反应，生成丙酮酸和NAD^+。

3.NADH的减少量可以通过光密度的变化来测定。

乳酸浓度与NADH减少量成正比。

4.通过比对标准曲线，可以确定待测液样中乳酸的浓度。

2. 应用LDH法广泛应用于临床医学、药物研究和生物学等领域。

下面列举了该方法在不同领域的应用：2.1 临床医学LDH法在临床医学中用于测定血液、尿液和其他体液中乳酸的浓度。

这对于评估病人的代谢情况、疾病状态和疾病严重程度非常重要。

LDH法在以下疾病的诊断和监测中有广泛应用：•心肌梗塞：乳酸浓度的升高与心肌梗塞相关。

•肝脏疾病：乳酸浓度的增加可能与肝功能受损有关。

•肾脏疾病：乳酸浓度的变化可以反映肾脏功能的改变。

2.2 药物研究LDH法可用于药物研究中对药物对细胞代谢的影响进行评估。

通过测定细胞中乳酸的浓度变化，可以了解药物对细胞氧化代谢的影响。

该方法可以帮助研究人员了解药物的治疗效果和毒副作用，进而指导药物的研发和应用。

2.3 生物学研究LDH法在生物学研究中也有一定的应用。

乳酸浓度的变化可以反映细胞的能量代谢状态。

通过测定乳酸浓度的变化，可以了解细胞在不同生理和病理条件下的代谢状态。

在细胞培养和细胞凋亡研究中，LDH法可用于评估细胞的损伤程度和细胞死亡情况。

LDH检测

乳酸脱氢酶释放法lactate dehydrogenase release assay碧云天的乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒(LDH Cytotoxicity Assay Kit)，也称乳酸脱氢酶检测试剂盒(LDH Assay Kit)或乳酸脱氢酶释放检测试剂盒(LDH Release Assay Kit)，是一种基于diaphorase催化的INT显色反应，通过比色法检测细胞毒性时释放的乳酸脱氢酶活性或检测其它样品中的乳酸脱氢酶活性的试剂盒。

本试剂盒可以用于常规的乳酸脱氢酶活性的检测，更常用于以LDH释放为指标的细胞毒性检测。

同时，基于细胞总乳酸脱氢酶活性的检测，本试剂盒也可以用于检测细胞增殖和细胞毒性检测。

细胞凋亡或坏死而造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)。

通过检测从质膜破裂的细胞中释放到培养液中的LDH 的活性，就可以实现对细胞毒性的定量分析。

LDH释放被看做细胞膜完整性的重要指标，并被广泛用于细胞毒性检测。

LDH释放被认为是以前使用放射性的51Cr标记细胞，随后通过51Cr释放进行细胞膜完整性检测的安全有效的替代方法。

本试剂盒的基本原理是，在乳酸脱氢酶的作用下，NAD+被还原生成NADH，NADH和INT(2-p-iodophenyl-3-nitrophenyl tetrazolium chloride)被硫辛酰胺脱氢酶(diaphorase)催化反应生成NAD+和强生色物甲臜(formazan)，在490nm波长下产生吸收峰，从而可以通过比色来定量乳酸脱氢酶的活性。

吸光度与乳酸脱氢酶活性成线性正相关。

该酶联反应原理的示意图如下：可检测细胞培养液、细胞裂解液等样品中乳酸脱氢酶的活性。

一个试剂盒可进行100次检测。

包装清单：产品编号产品名称包装C0016-1 LDH释放试剂 1.5mlC0016-2 乳酸溶液2mlC0016-3 酶溶液1ml×2C0016-4 INT溶液(10X) 0.2mlC0016-5 INT稀释液2ml—说明书1份保存条件：-20℃保存，一年有效。

乳酸脱氢酶同工酶电泳结果

乳酸脱氢酶同工酶电泳结果
【原创实用版】
目录
1.乳酸脱氢酶同工酶电泳简介
2.乳酸脱氢酶同工酶检测方法
3.乳酸脱氢酶同工酶结果分析
4.乳酸脱氢酶同工酶的作用
5.结论
正文
一、乳酸脱氢酶同工酶电泳简介
乳酸脱氢酶同工酶电泳（ldhisol）是一种分离和检测乳酸脱氢酶同
工酶的方法，它可将人组织中乳酸脱氢酶分离出 5 种同工酶区带。

乳酸
脱氢酶同工酶的检测方法包括电泳法、离子交换柱层析法、免疫法、抑制法和酶切法等，但迄今最好的和用得最多的是电泳法。

二、乳酸脱氢酶同工酶检测方法
1.电泳法：乳酸脱氢酶同工酶电泳采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，可以将乳酸脱氢酶同工酶分离成五个区带。

2.离子交换柱层析法：离子交换柱层析法可以对乳酸脱氢酶同工酶进行分离和测定。

3.免疫法：免疫法可以通过检测乳酸脱氢酶同工酶的抗原来进行测定。

4.抑制法：抑制法可以通过检测乳酸脱氢酶同工酶的活性来确定其存在。

5.酶切法：酶切法可以通过检测乳酸脱氢酶同工酶的降解产物来确定其存在。

三、乳酸脱氢酶同工酶结果分析
乳酸脱氢酶同工酶结果分析主要用于诊断疾病，如急性肾皮质坏死、各种血管内外溶血症、骨骼肌炎症、损伤及退化、肝损伤、癌等。

四、乳酸脱氢酶同工酶的作用
乳酸脱氢酶同工酶在生物体内参与乳酸的代谢过程，对维持细胞内外酸碱平衡具有重要作用。

此外，乳酸脱氢酶同工酶的变化还可以作为诊断某些疾病的参考指标。

五、结论
乳酸脱氢酶同工酶电泳是一种有效的检测方法，可以用于诊断多种疾病。

ldh实验的原理和步骤

ldh实验的原理和步骤LDH实验的原理和步骤一、实验原理LDH（Lactate Dehydrogenase，乳酸脱氢酶）是一种广泛存在于生物体内的酶，参与糖代谢过程中乳酸的产生和消耗。

LDH存在于多种组织和细胞中，如肝脏、心肌、骨骼肌等，其活性的测定在临床诊断、疾病监测以及药物研发上具有重要意义。

LDH实验是通过测定样品中LDH的活性来评估疾病状态或药物对细胞的影响。

该实验原理基于LDH催化反应，反应方程式如下：乳酸+NAD^++H_2O⇌丙酮酸+NADH+H^+在此反应中，乳酸被氧化生成丙酮酸，同时NAD^+被还原为NADH。

实验中可以通过测定NADH的生成速率来间接测定LDH的活性。

二、实验步骤1. 样品处理：提取待测样品中的LDH。

样品可以是血清、尿液、细胞培养上清等。

在处理样品之前，需要进行离心等操作，将样品中的固体颗粒去除。

如样品为血清，可通过离心将红细胞沉淀去除。

2. 反应液的制备：根据实验需求，制备适量的反应液。

反应液通常包括缓冲液、辅酶NAD^+、底物乳酸等。

缓冲液的选择应根据样品的性质和实验要求进行优化。

3. 反应体系的组装：将样品溶液与反应液按照一定比例混合，组装成反应体系。

混合后需要充分搅拌均匀，确保反应的均一性。

4. 反应过程的监测：将组装好的反应体系置于恒温槽中，保持适当的温度（通常为37℃）。

在反应过程中，可以通过分光光度计或荧光等仪器监测NADH的产生速率。

NADH在340 nm波长下有吸光峰，可以通过测定吸光度的变化来计算LDH的活性。

5. 数据分析与结果判断：根据实验得到的数据，可以利用标准曲线或计算公式来计算样品中LDH的活性。

LDH的活性通常以单位时间内产生的NADH的量来表示，常用的单位是U/L（单位体积液体中的酶活性）。

活性的高低可以反映样品中LDH的含量或细胞的代谢状态。

6. 结果解读：根据实验结果，可以对样品进行定性或定量判断。

定性判断通常是根据LDH的存在与否来判断样品中是否存在疾病或细胞损伤。

乳酸脱氢酶同工酶电泳结果

乳酸脱氢酶同工酶电泳结果摘要：一、乳酸脱氢酶同工酶电泳简介二、乳酸脱氢酶同工酶电泳结果分析1.LDH1和LDH2的升高2.LDH5的升高3.LDH1/LDH2比值的意义三、乳酸脱氢酶同工酶电泳的临床应用1.急性心肌梗塞的诊断2.肝炎和肝损伤的诊断3.骨骼肌损伤和疾病的诊断正文：乳酸脱氢酶同工酶电泳（LDHI）是一种检测血清中乳酸脱氢酶同工酶活性的方法，对于诊断某些疾病具有重要的临床价值。

本文将介绍乳酸脱氢酶同工酶电泳的基本原理和结果分析，以及其在临床上的应用。

一、乳酸脱氢酶同工酶电泳简介乳酸脱氢酶（LDH）是一种的四聚体酶，由M型和H型亚基组成。

在电泳过程中，LDH同工酶会在聚丙烯酰胺凝胶电泳中分离出来，通过观察各同工酶的分布和活性，可以对某些疾病进行诊断。

二、乳酸脱氢酶同工酶电泳结果分析乳酸脱氢酶同工酶电泳结果主要包括LDH1、LDH2、LDH3、LDH4和LDH5的活性分布。

其中，LDH1和LDH2的活性升高，常见于急性心肌梗塞发作后。

这是因为心肌细胞受损后，LDH1和LDH2会从细胞内溢出，导致血清中活性升高。

此外，LDH5的升高，常见于肝炎、急性肝细胞损伤及骨骼肌损伤等情况。

而LDH1/LDH2比值的升高，对诊断急性心肌梗塞具有较高的敏感性和特异性。

三、乳酸脱氢酶同工酶电泳的临床应用乳酸脱氢酶同工酶电泳在临床上的应用主要包括以下几个方面：1.急性心肌梗塞的诊断：乳酸脱氢酶同工酶电泳结果中，LDH1和LDH2的活性升高，以及LDH1/LDH2比值的增加，对诊断急性心肌梗塞具有较高的价值。

2.肝炎和肝损伤的诊断：血清中LDH5活性的升高，有助于诊断肝炎、急性肝细胞损伤等情况。

3.骨骼肌损伤和疾病的诊断：LDH1和LDH2活性的升高，可以作为骨骼肌损伤和疾病的辅助诊断指标。

总之，乳酸脱氢酶同工酶电泳作为一种检测血清中乳酸脱氢酶同工酶活性的方法，在临床诊断中具有一定的应用价值，尤其在急性心肌梗塞、肝炎和骨骼肌损伤等疾病的诊断中具有重要意义。

ldh细胞毒性检测原理

ldh细胞毒性检测原理
LDH细胞毒性检测是一种常用的细胞毒性评价方法，其原理基于乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，简称LDH）在细胞损伤时释放到培养上清液中。

LDH是一种催化乳酸转化为丙酮酸的酶，在正常情况下主要存在于细胞内。

当细胞发生损伤或坏死时，LDH被释放到外界环境中。

因此，通过测定培养上清液中的LDH水平，可以间接反映细胞损伤程度。

LDH细胞毒性检测的具体步骤如下：
1. 给予细胞不同浓度的试剂处理，例如药物、化合物等。

2. 处理一段时间后，将培养上清液收集并离心，得到上清液。

3. 使用LDH试剂盒，按照说明书的步骤将上清液与试剂进行反应。

4. 将反应混合物置于检测设备中，通过测定OD值或荧光信号的强度，可以得到LDH的活性或浓度。

5. 将测定结果与对照组进行比较，可以评估细胞毒性的程度。

LDH细胞毒性检测的优点在于操作简便，结果可靠，常用于评估药物、化合物对细胞的毒性影响。

然而，需要注意的是LDH的释放并不一定代表细胞的坏死，因为在一些情况下，LDH也可能通过非坏死途径释放，如胞吞作用、葡萄糖缺乏等。

因此，综合分析LDH释放的动力学变化和其他细胞毒性指标，可以更全面地评估细胞的毒性情况。

乳酸脱氢酶(LDH)法操作说明

LDH法细胞毒性检测：原理：乳酸脱氢酶在胞浆内含量丰富,正常时不能通过细胞膜,当细胞受损或死亡时可释放到细胞外,所以细胞死亡数目与细胞培养上清中LDH活性成正比,用比色法测定实验孔LDH 活性,并与靶细胞对照孔进行比较,可计算效应细胞对靶细胞的杀伤百分率LDH（乳酸脱氢酶）是一种极为稳定的细胞质酶，存在于正常细胞的胞质中，一旦细胞膜受损，LDH 即被释放到细胞外； LDH催化乳酸形成丙酮酸盐，和INT（四唑盐类）反应转化成红色甲臢化合物，可通过酶标仪进行检测。

颜色形成的量与裂解细胞的数目成正比。

应用一个96-孔平板读数计收集可见光波长的吸收值数据。

这个分析可用于测量在细胞介导的细胞毒性分析中细胞膜的完整性，这种情况下目标细胞被效应细胞裂解，可判断细胞受损的程度。

乳酸脱氢酶（LDH）在胞质内含量非常丰富，细胞处于正常状态下其不能通过细胞膜，但当细胞受到损伤或死亡时便可释放到细胞外，此时细胞培养液中 LDH 的活性与细胞的死亡数目呈正比，通过用比色法测定并与靶细胞对照孔的 LDH 活性进行比较，可计算出效应细胞对靶细胞的杀伤百分数。

该实验方法操作简便、快速，可应用于 CTL 和 NK 细胞活性测定及药物、化学物质或放射所引起的细胞毒性，目前已有 LDH 法测定 CTL 活性的试剂盒。

同时设4个对照:靶细胞最大释放组、体积校正对照组、背景对照组和自然释放组按5∶1、10∶1、20∶1（效应细胞∶靶细胞）细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大等因素会造成细胞自然释放乳酸脱氢酶操作流程：设立效应细胞孔（不同浓度的效应细胞设立效应细胞自发释放组）：50μl效应细胞+50μl培养基实验组：靶细胞不变，改变效应细胞：50μl效应细胞+50μl靶细胞设立靶细胞自发释放组：50μl靶细胞+50μl培养基设立靶细胞最大释放组：50μl靶细胞+50μl培养基+10μl裂解液（10×）设立体积校正对照组：100μl培养基+10μl裂解液（10×）设立背景对照组：100μl培养基250g离心4分钟37℃孵育4小时离心前45分钟添加裂解液（10×）至靶细胞最大释放组250g离心4分钟取上清50μl转移至另一孔板（可选）于独立的孔中加50μl LDH阳性对照（1：5000）于每孔中添加50μl再次稀释的底物混合物室温避光孵育30分钟添加50μl终止溶液490nm测吸收值1.靶细胞接种数目的优化1.1.设立检测板1.1.1.准备靶细胞：调整细胞浓度0, 5,000, 10,000, 20,000/100μl，使用与细胞毒分析相同的培养基及孔板终体积。

乳酸脱氢酶(LDH)测定操作规程(SOP)

乳酸脱氢酶(LDH)测定操作规程（SOP）一、用途本产品用于体外定量测定血清、血浆样品中乳酸脱氢酶（LDH）的活性。

二、临床意义（一）概述乳酸脱氢酶（LDH），又称L－乳酸－NAD+氧化还原酶，酶编号为EC 1.1.1.27，分子量约为34000道尔顿。

LDH是一种细胞质酶，存在于所有组织细胞中。

由于组织中的LDH 浓度比血浆高约500倍，即使组织的轻微损伤也将导致血清中活性的明显增高，在肝、心肌、骨骼肌和肾中发现高度组织特异性活性的酶。

（二）临床意义乳酸脱氢酶增高主要见于心肌梗死、肝炎、肺梗死、某些恶性肿瘤、白血病等。

某些肿瘤转移所致的胸腹水中乳酸脱氢酶活力往往升高。

目前，常用于心肌梗死、肝病和某些恶性肿瘤的辅助诊断。

（三）医学决定水平170U／L:此值在参考范围以内，等于或低于此值可排除许多与LDH升高有关的疾病，而考虑其他的诊断。

此值还可作为病人自身的对照，用来与以前或将来的测定值作比较。

300U／L：高于此水平时，应考虑到可能引起LDH升高的各种疾病，如心肌梗塞、肝病变、传染性单核细胞增多症、进行性肌营养不良等。

因此，应作其他各种试验，以作出明确诊断。

血清溶血可使测定值增高，应予以注意。

500U／L：高于此值，常见于巨幼细胞性溶血，急性白血病、慢性粒细胞性白血病、转移癌和肝昏迷等，此时应作其他多种检测来作出正确诊断。

三、检验原理L-乳酸＋NAD+−−LDH丙酮酸＋NADH＋H+−→NADH的生成速率与样品中LDH活性成正比，在340nm波长处，通过连续监测吸光度的上升速率(△A／min)，即可计算出样品中LDH的活性。

四、样品血液样品原则上采集晨起空腹血（禁食12小时）；患者处于平静、休息状态，减少患者由于运动、饮食带来的影响；静脉采血时患者应取坐位或卧位；止血带使用后1分钟内采血，回血后立即松开；正确使用抗凝剂；防止溶血；防止过失性采样。

样品运送过程中应防止过度振荡、防止样品容器的破损、防止样品被污染、防止样品及唯一性标志的丢失和混淆，防止样品对环境的污染、水分蒸发。

乳酸脱氢酶(LDH)释放法细胞繁殖与毒性定量检测试剂盒产

乳酸脱氢酶（LDH）释放法细胞繁殖与毒性定量检测试剂盒产品说明书（中文版）主要用途乳酸脱氢酶（LDH）释放法细胞繁殖与毒性定量检测试剂是一种旨在通过酶联连续反应系统检测由于细胞损伤导致的细胞内稳定的乳酸脱氢酶释放到细胞外，使四唑盐染料碘硝基氯化四氮唑（INT）还原为红色甲臜（farmazan），即比色法定量测定酶活性，以评价活体细胞繁殖的权威而经典的技术方法。

该技术经过精心研制、成功实验证明的。

适用于各种药物、化学、环境因子和营养因子处理的贴壁或悬浮生长中的动物或人体细胞。

替代传统的同位素[51 Cr]释放检测的最佳选择。

产品严格无菌，即到即用，简捷敏感，性能稳定，显色清晰，检测准确，重复性好。

技术背景细胞凋亡或坏死而造成的细胞膜结构的损害或完全裂解导致细胞浆内的酶释放外泄到培养液里，其中包括活性稳定的乳酸脱氢酶。

乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）释放法的测定是基于在乳酸脱氢酶的作用下，还原NAD+反应生成的NADH，再与氧化型2-（4-碘苯）-3-（4-硝基苯）-5-苯四唑（Iodonitrotetrazolium；INT）在硫辛酰胺脱氢酶（diaphorase）的催化下反应生成红色生色产物甲臜（formazan），在490nm波长下产生吸收峰，从而确定释放的乳酸脱氢酶的活性，作为细胞膜完整性的标志：吸光值与细胞死亡或毒性程度成线性正相关。

酶联连续反应系统为：lactate dehydrogenaseNAD+ + Lactate → Pyruvate + NADHdiaphoraseNADH + INT → NAD++ Formazan（red）产品内容裂解液（Reagent A）1毫升补充液（Reagent B）1毫升反应液（Reagent C）5毫升显色液（Reagent D）1毫升终止液（Reagent E）1毫升标准液（Reagent F）20微升产品说明书1份保存方式保存在－20℃冰箱里，反应液（Reagent C）和显色液（Reagent D）避免光照；有效保证6月用户自备96孔细胞培养板：用于细胞操作的容器细胞培养箱：用于孵育反应孔板离心机：用于沉淀细胞酶标仪：用于定量检测染色后的细胞实验步骤一、贴壁细胞检测1．准备96孔细胞培养板的待测细胞（每孔100微升）：包括未处理的对照细胞（样品对照孔），未处理的后续裂解的细胞（样品最大酶活性对照孔），以及药物处理的细胞（处理样品孔），并做好标记（细胞密度为每孔2 X 103至2 X 104细胞）2．到规定的检测时间点前1小时，从湿润的细胞培养箱里取出待测的96孔细胞培养板（注意：确保细胞培养液维持在100微升容量）3．加入10微升裂解液（Reagent A）到未处理的后续裂解的细胞孔里（样品最大酶活性对照孔）4．同时加入10微升补充液（Reagent B）到其余所有检测孔里5．放回湿润的细胞培养箱里，继续培养1小时，即规定检测时间6．从湿润的细胞培养箱里取出待测的96孔细胞培养板7．放进孔板离心机离心10分钟，速度为250g8．分别小心移取50微升上清液到新的96孔板的相应孔里，避免触摸细胞颗粒，同时注意做好标记9．分别加入50微升反应液（Reagent C）（注意：使用前，须混匀）10．分别加入10微升显色液（Reagent D）11．摇动96孔板混匀12．在室温下孵育30分钟，避免光照13．（选择步骤）分别加入10微升终止液（Reagent E）14．即刻放进酶标仪里测读：波长490nm15．计算处理样品实际吸光读数：处理样品孔吸光读数－样品对照孔吸光读数16．计算样品细胞最大酶活性的实际吸光读数：样品最大酶活性对照孔吸光读数－样品对照孔吸光读数17．计算细胞毒性或死亡率（％）：（处理样品实际吸光读数÷样品细胞最大酶活性的实际吸光读数）X 10018．或绘制细胞生长曲线：纵座标（Y轴）为实际吸光读数（A）；横坐标（X轴）为细胞数或时间点或药物浓度；据此计算其LD50二、悬浮细胞检测1．准备96孔细胞培养板的待测悬浮细胞（每孔100微升）：包括未处理的对照细胞（样品对照孔），未处理的后续裂解的细胞（样品最大酶活性对照孔），以及药物处理的细胞（处理样品孔），并做好标记（细胞密度为每孔5 X 103至5 X 104细胞）2．到规定的检测时间点前1小时，从湿润的细胞培养箱里取出待测的96孔细胞培养板（注意：确保细胞培养液维持在100微升容量）3．加入10微升裂解液（Reagent A）到未处理的后续裂解的细胞孔里（样品最大酶活性对照孔）4．同时加入10微升补充液（Reagent B）到其余所有检测孔里5．放回湿润的细胞培养箱里，继续培养1小时，即规定检测时间6．从湿润的细胞培养箱里取出待测的96孔细胞培养板7．放进孔板离心机离心10分钟，速度为250g8．分别小心移取50微升上清液到新的96孔板的相应孔里，避免触摸细胞颗粒，同时注意做好标记9．分别加入50微升反应液（Reagent C）（注意：使用前，须混匀）10．分别加入10微升显色液（Reagent D）11．摇动96孔板混匀12．在30℃温度下孵育30分钟，避免光照13．（选择步骤）分别加入10微升终止液（Reagent E）14．即刻放进酶标仪里测读：波长490nm15．计算处理样品实际吸光读数：处理样品孔吸光读数－样品对照孔吸光读数16．计算样品细胞最大酶活性的实际吸光读数：样品最大酶活性对照孔吸光读数－样品对照孔吸光读数）17．计算细胞毒性或死亡率（％）：（处理样品实际吸光读数÷样品细胞最大酶活性的实际吸光读数）X 10018．或绘制细胞生长曲线：纵座标（Y轴）为实际吸光读数（A）；横坐标（X轴）为细胞数或时间点或药物浓度；据此计算其LD50注意事项1．本产品为100次（1个96孔板）操作2．操作时须戴手套3．整个操作须无菌操作4．建议每个样品安排3个孔，即重复3次，计算时取其平均值5．检测体系相应增加，试剂用量按比例相应增加：例如200微升检测体系，试剂用量增加1倍6．每孔中的培养液需100微升，避免使用周边培养孔（常常液体蒸发而减少）7．系统测试，可以加入2至5微升标准液（Reagent G）到50微升无细胞的细胞培养液里，然后按照说明书加入反应液（Reagent C）和显色液（Reagent D）即可8．细胞裂解效果不佳，可以使用20微升裂解液（Reagent A）处理9．孵育时，须避光10．染色完成后，建议即刻检测，最迟不得超过1小时11．细胞培养和处理时，避免使用草酸（OXALATE），草氨酸（OXAMATE）和EDTA，否则影响检测的准确性12．血清含有乳酸脱氢酶，建议使用浓度不要超过1％13．细胞过度生长、密度过高、离心速度过大、培养箱内外温差过大等因素会造成细胞自然释放乳酸脱氢酶14．酚红会干扰检测15．样品最大酶活性对照孔或最大OD吸光读数与细胞裂解程度密切相关16．如果用户没有孔板离心机，则移取上清液时格外小心17．如果用户没有匹配的波长，可以使用波长470nm至570nm之间的任一波长替代18．本公司提供系列细胞繁殖检测试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定检测敏感使用承诺杰美基因秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。

PD-1敲除及GPC3修饰的嵌合抗原受体T细胞治疗肝癌的实验研究

DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.004·论著·PD-1敲除及GPC3修饰的嵌合抗原受体T细胞治疗肝癌的实验研究姜舒，王冰，郭霞，张芸，谢亮，罗朝霞，刘赢滢【摘要】目的构建程序死亡受体1（PD-1）敲除及磷脂酰肌醇蛋白多糖-3（GPC3）修饰的嵌合抗原受体T 细胞（GPC3-PD1gRNA-CART cells），研究其对肝癌细胞株HepG2 的体外杀伤作用，以及其对肝癌动物模型的体内抗肿瘤作用。

方法制备GPC3-PD1gRNA-CART 细胞，用流式细胞仪检测PD-1、GPC3 CAR 的表达情况。

体外实验中，设立不同的效靶比（1:1、2:1、4:1），用LDH 法测定刀豆蛋白刺激后的GPC3-PD1gRNA-CART 细胞体外对HepG2 细胞株的杀伤率，检测刀豆蛋白刺激后的GPC3-PD1gRNA-CART 细胞和HepG2 细胞株共孵育18 h 后的细胞培养上清液中IFN-γ 的释放水平。

设置受刀豆蛋白 A 刺激的和未受刀豆蛋白 A 刺激的GPC3 修饰的CART 细胞（GPC3 CART cells）作为对照组。

于重度免疫缺陷小鼠（NDG 小鼠）皮下注射HepG2 细胞建立肝癌动物模型，观察GPC3-PD1gRNA-CART 细胞体内抑瘤作用。

实验分为模型组、实验组（GPC3-PD1gRNA-CART 组、GPC3 CART组），模型组和实验组通过皮下注射 1 × 106个HepG2 细胞造模，在肿瘤长径达3 mm 后实验组经尾静脉注射5 × 106个GPC3-PD1gRNA-CART 细胞或GPC3 CART 细胞，模型组经尾静脉注射0.9% NaCl，每周注射 1 次，共 3 周，注射体积均为0.2 ml。

每隔 2 天观测肿瘤体积情况，治疗 3 周后取皮下肿瘤组织，HE 染色检测肿瘤组织情况。

结果流式细胞术分析结果显示，GPC3 CAR 表达率为98.8%。

乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒一站式解决方案

乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测试剂盒一站式解决方案乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LD 或LDH ，EC1.1.1.27 ）是一类NAD依赖性激酶，有LDHA、LDHB、LDHC三种亚基，可构成6种四聚体同工酶。

动物乳酸脱氢酶是由4个亚单位组成的四聚体，常见的A、B 两种亚基构成的5种LDH同工酶（LDH1-5），C亚基则仅组成一种LDH同工酶即LDH-C4。

乳酸脱氢酶为含锌离子的金属蛋白，分子量为135-140kD，是糖无氧酵解及糖异生的重要酶系之一，可催化丙酸与L-乳酸之间的还原与氧化反应，也可催化相关的α-酮酸。

LDH广泛存在于人体组织中，以肾脏含量最高，其次是心肌和骨肌。

红细胞内LDH约为正常血清的100倍。

一、乳酸脱氢酶分类1.根据结合辅酶的不同，微生物体一般包含两种乳酸脱氢酶，NAD-依赖型乳酸脱氢酶（NAD-dependent lactate dehydrogenases，nLDHs）和NAD-非依赖型乳酸脱氢酶（NAD-independent lactate dehydrogenases，iLDHs）两大类。

2.按其催化底物的构型不同，NAD-依赖型乳酸脱氢酶可以分为NAD依赖型-L-乳酸脱氢酶（L-NAD-依赖型乳酸脱氢酶）和NAD依赖型-D-乳酸脱氢酶（D-NAD-依赖型乳酸脱氢酶）两大类，分别催化丙酮酸合成L-乳酸和D-乳酸。

3.根据天然电子受体的不同，可以将NAD-非依赖型乳酸脱氢酶分为三类。

第一类为膜蛋白，利用膜醌类作为外部的电子受体；第二类直接利用O2作为电子受体，根据氧化终产物的不同，又将其细分为乳酸氧化酶（Lactate oxidase，LOX）和乳酸单氧酶（Lactate monooxygenases，LMO），其中前者产生丙酮酸和H2O2，而后者产生乙酸、CO2和H2O；第三类是硫胺b2（flavocytochrome b2），存在于真菌中，它天然的电子受体为细胞色素c。

LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测实验方法

LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测LDH释放检测方法：a。

根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96孔细胞培养板中，使待检测时细胞密度不超过80-90％满。

b. 吸去培养液，用PBS液洗涤一次。

换新鲜培养液（推荐使用含1%血清的低血清培养液或适当的无血清培养液），将各培养孔分成如下几组：包括无细胞的培养液孔（背景空白对照孔),未经药物处理的对照细胞孔(样品对照孔），未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔(样品最大酶活性对照孔）,以及药物处理的细胞孔(药物处理样品孔），并做好标记.按照实验需要给予适当药物处理（如加入0-10μl 左右特定的药物刺激,可设置不同浓度,不同处理时间，对照孔中需加入适当的药物溶剂对照），继续按常规培养。

到预定的检测时间点前1小时,从细胞培养箱里取出细胞培养板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂,加入量为原有培养液体积的10%.加入LDH释放试剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育。

c。

到达预定时间后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。

分别取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。

准备工作:a。

INT溶液(1X）的配置：根据所需的INT溶液(1X)的量，取适量INT溶液（10X）用INT稀释液稀释至1X。

例如，取20μl INT溶液(10X)，加入180μl INT稀释液,混匀后即配置为200μl INT溶液（1X)。

INT 溶液(1X)宜现配现用，配置后4℃保存可于当天使用，不宜配置后冻存.b。

LDH检测工作液的配制: 根据待测定的样品数(含对照)，参考下表在临检测前新鲜配制适量的检测工作液.注意：LDH检测工作液必须现配现用,配制和使用过程中均要注意适当避光.样品测定：a. 各孔分别加入60μl LDH检测工作液。

b. 混匀，室温（约25℃）避光孵育30min（可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动)。

LDH检测

本试剂盒可以用于常规的乳酸脱氢酶活性的检测，更常用于以LDH释放为指标的细胞毒性检测。

同时，基于细胞总乳酸脱氢酶活性的检测，本试剂盒也可以用于检测细胞增殖和细胞毒性检测。

细胞凋亡或坏死而造成的细胞膜结构的破坏会导致细胞浆内的酶释放到培养液里，其中包括酶活性较为稳定的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)。

通过检测从质膜破裂的细胞中释放到培养液中的LDH 的活性，就可以实现对细胞毒性的定量分析。

LDH释放被看做细胞膜完整性的重要指标，并被广泛用于细胞毒性检测。

LDH释放被认为是以前使用放射性的51Cr标记细胞，随后通过51Cr释放进行细胞膜完整性检测的安全有效的替代方法。

吸光度与乳酸脱氢酶活性成线性正相关。

该酶联反应原理的示意图如下：可检测细胞培养液、细胞裂解液等样品中乳酸脱氢酶的活性。

一个试剂盒可进行100次检测。

包装清单：产品编号产品名称包装C0016-1LDH释放试剂C0016-2乳酸溶液2mlC0016-3酶溶液1ml×2C0016-4INT溶液(10X)C0016-5INT稀释液2ml—说明书1份保存条件：-20℃保存，一年有效。

ldh法原理

ldh法原理LDH法（Lactate Dehydrogenase Assay）是一种常用的生物化学分析方法，用于测定体液或体内组织中的乳酸脱氢酶（LDH）活性。

本文将从LDH的作用原理、实验步骤和应用领域等方面进行介绍。

一、LDH的作用原理乳酸脱氢酶是一种重要的酶类，在细胞内起着关键的生物催化作用。

它能够催化乳酸与辅酶NAD+之间的氧化还原反应，将乳酸氧化为丙酮酸，并同时还原NAD+为NADH。

这个反应是一个可逆反应，乳酸脱氢酶的活性反映了这个反应向前或向后进行的程度。

二、LDH的实验步骤1. 样本制备：将待测样本通过离心等方式，得到清澈的上清液。

若有沉淀，则需避免将沉淀物一同吸取。

2. 反应体制：将样本与含有乳酸和辅酶NAD+的反应液混合。

反应液中含有缓冲剂，以维持适宜的pH值。

同时，还会加入一种LDH 抑制剂，以避免其他非特异性酶的干扰。

3. 反应温度：反应一般在37℃下进行，以模拟体内环境。

4. 反应时间：通常反应时间为5-10分钟。

5. 读取光密度：使用分光光度计，在340nm处测定反应体系中的NADH的吸光度。

6. 结果计算：将吸光度值代入公式，计算出样本中LDH的活性。

三、LDH的应用领域1. 临床诊断：LDH是一种常见的临床指标，用于辅助判断心肌梗死、肝炎、肾脏疾病等疾病的程度和预后。

2. 肿瘤标志物：某些肿瘤细胞释放的LDH含量较高，因此可以通过测定血清中的LDH水平来评估肿瘤的活动性和治疗效果。

3. 药物研发：LDH活性与细胞的新陈代谢水平密切相关，因此可以作为药物的靶点评估药效。

4. 食品安全：LDH活性的变化可以反映食品的新鲜度和质量，被用于食品加工和保存过程中的质量控制。

LDH法是一种用于测定体液或组织中乳酸脱氢酶活性的常用方法。

其原理是通过测定乳酸脱氢酶催化乳酸与辅酶NAD+之间的反应来评估乳酸代谢水平。

LDH法在临床诊断、肿瘤标志物、药物研发和食品安全等领域有着广泛的应用前景。

靶细胞杀伤实验：LDH法

靶细胞杀伤实验：LDH法
一、效应细胞的制备
激惹5天后，于无菌条件下取出受鼠引流的腹股沟淋巴结，100目钢网研磨，调整细胞浓度为2×107.ml-1。

台盼蓝色要求存活率>95%。

二、靶细胞的制备
P815细胞株系DBA/2小鼠的肥大细胞瘤细胞株。

连续传代培养，调整细胞浓度为2×105/ml或3.33×105/ml（加入α-Lyt2 mAb时的靶细胞浓度），台盼蓝染色成活率>95%。

三、LDH释放法测定CTL的功能
按表1加样于96孔培养板中，设3个复孔。

混匀置二氧化碳培养箱中孵育4h。

室温离心，用微量加样器每孔取上清液100μl，送全自动生化分析仪测定每孔的LDH含量。

表1 LDH释放法测定CTL活性的加样情况（μl）
分组效应细
胞靶细
胞
α-Lyt2 m
Ab
1% Triton X-1
00
完全培养
基
自然释放
孔
100 100
最大释放
孔
100 100
实验孔1 100 100
实验孔2 100 60①40
注：靶细胞浓度为3.33×105/ml
四、计算CTL活性
特异杀伤率(%)=(实验孔LDH值-自然释放孔LDH值)/(最大释放孔LDH值-自然释放LDH 值)
五、统计学处理
DTH的测定，4组间比较采用方差分析，两组比较采用q检验。

对于CTL的特异杀伤率，先进行百分数的平方根反正弦转换后采用方差分析进行4组间比较，两两比较采用q检验。

煤矿尘体内外细胞毒性和致纤维化作用的相关研究.

煤矿尘体内外细胞毒性和致纤维化作用的相关研究曾昭玉1 杨赛丽1 沈汉明2 张琪凤1 谢隆化1研究粉尘对机体的危害作用，主要采用慢性动物实验，辅以体外细胞培养或支气管肺泡灌洗(BAL)方法。

有关粉尘体外细胞毒性与体内致肺纤维化作用相关性的报道不一［1～3］，而体内肺细胞毒性与致纤维化性的相关关系报道较少。

为了探讨3项试验间的关系，我们通过对3种煤矿尘致病性的研究，运用灰色关联度分析，比较了体内外细胞毒性与致纤维化作用之间的相关性。

一、材料与方法1.实验用粉尘：样尘取自浙江省3个煤矿的井下巷壁沉积尘，经研磨使90%以上尘粒<5 μm。

3种矿尘(A、B、C)的游离SiO2分别占27.0%、25.3%和10.6%。

标准石英粉尘由中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所提供。

2.体外细胞毒性试验：按Myrvik法经BAL收集大鼠肺巨噬细胞(AM)，制成1×106/ml浓度的细胞悬液，常规培养，细胞贴壁后换液加尘，粉尘的实验终浓度为150 μg/ml。

37℃下接尘24小时后，用台盼蓝染色法检测AM存活率，用显微分光光度法测定酸性磷酸酶(ACP)的相对含量［4］。

3.体内肺细胞毒性试验：体重200 g左右的雄性Wistar大鼠，随机分为矿尘A、B、C 3组和石英与生理盐水对照组，经气管内1次注入50 mg粉尘悬液1 ml或生理盐水1 ml，染尘后2周解剖动物，以生理盐水行BAL，将灌洗回收液离心，用丙酮酸法测定上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活性，沉淀物做细胞计数。

4.体内致纤维化试验：动物分组与染尘方法同前。

大鼠染尘后6个月剖检，取肺测定全肺干重和胶原蛋白含量(氯胺T法)。

二、结果1.体外细胞毒性：AM加尘培养后细胞存活率和ACP含量的变化，提示矿尘对AM膜通透性、溶酶体膜稳定性的影响，反映矿尘的细胞毒性(表1)。

表1 煤矿尘对大鼠肺巨噬细胞的影响(每组6例，±s)组别巨噬细胞存活率(%) 酸性磷酸酶相对含量(AU/μm2)矿尘A89.2±0.66*△ 1.42±0.059*△矿尘B89.0±0.89*△ 1.66±0.058*△矿尘C76.6±0.68*△ 2.18±0.051*△石英64.2±1.242.46±0.062对照96.6±0.60 0.53±0.032方差分析，与对照组比较*P<0.01，与石英组比较△P<0.01，下同2.体内肺细胞毒性：染尘后早期，大鼠肺灌洗回收液(BALF)中细胞总数和LDH活性的变化，提示肺组织炎性反应和肺细胞损伤情况，反映矿尘的肺细胞毒性，结果见表2。

农药致慢性细胞毒性及基因毒性机制研究进展

农药致慢性细胞毒性及基因毒性机制研究进展陈洁;张积仁【摘要】The cytotoxicity and genotoxicity in human cells induced by chronic exposure of pesticides have been confirmed,proved by the epidemiologic studies and many alternative test methodsin vivo and in vitro.The formation of DNA adduct and DNA single and/or double strand breakage are the main forms of DNA damage.In addition,oxidative stress plays an important role and may be a promoting factor in the mechanism of pesticide-induced cytotoxicity and genotoxicity in humancells.Overall,the specific molecular mechanism of pesticide is not entirely clear at present and further researches are needed to be done.%大量流行病学研究和体内、体外检测分析表明,长期低剂量接触农药可以导致人体细胞和分子损伤,诱导细胞凋亡.农药致细胞及DNA损伤的机制主要与DNA加合物的形成、DNA单链和/或双链的断裂有关.此外,氧化应激参与农药致细胞及DNA损伤的过程,可能成为农药致细胞及DNA损伤的促发因素.从总体上看,其具体分子机制还不十分清楚,有待进一步研究.【期刊名称】《生态毒理学报》【年(卷),期】2017(012)001【总页数】7页(P82-88)【关键词】农药;细胞毒性;基因毒性;氧化应激【作者】陈洁;张积仁【作者单位】南方医科大学珠江医院肿瘤中心,广州 510282;广东省靶向肿瘤干预与防控研究院,清远 511500【正文语种】中文【中图分类】X171.5农药的广泛应用给现代社会，尤其是发展中国家带来了革命性的益处。

基线ldh水平

基线ldh水平基线LDH水平是指人体内的乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，简称LDH）的基准值或正常范围。

LDH是一种酶，存在于人体的多个组织和器官中，包括肝脏、心脏、肌肉和红细胞等。

正常情况下，基线LDH水平可以反映各种组织和器官的正常代谢状态。

LDH是一种催化乳酸转化的酶，参与能量代谢过程中的乳酸产生和消耗。

它存在于细胞内和细胞外，当细胞损伤或破坏时，LDH会释放到血液中。

因此，基线LDH水平的测量可以作为一种常规检查项目，用于评估细胞损伤或疾病的程度。

正常情况下，基线LDH水平的范围在血液中大约为100-190单位/升。

不同实验室可能会有略微不同的测量方法和参考范围。

超出正常范围的LDH水平可能表明存在某种疾病或疾病的恶化。

因此，医生通常会将LDH水平与其他临床症状和实验室检查结果结合起来，以确定可能的诊断。

LDH水平的升高可能与多种疾病和情况有关。

其中一些常见的疾病包括心肌梗塞、肝炎、肝硬化、肺炎、肿瘤、贫血等。

此外，某些药物和药物治疗也可能导致LDH水平的升高。

LDH水平的降低相对较少见，通常与遗传性疾病或特定类型的贫血有关。

然而，LDH水平的降低并不常见，并且通常不是一个独立的诊断指标，需要结合其他临床表现和实验室检查结果来进行综合分析。

需要注意的是，基线LDH水平只是一种参考指标，不能作为唯一的诊断依据。

临床医生通常会根据患者的具体情况，结合其他临床症状、体征和实验室检查结果，综合分析来确定疾病的诊断和治疗方案。

基线LDH水平是评估细胞损伤或疾病的一个重要指标。

通过测量LDH水平，可以帮助医生诊断和监测某些疾病的发展和治疗效果。

然而，需要注意的是，LDH水平的升高或降低并不是一个特异性的指标，需要结合其他临床信息进行综合分析和判断。

大气细颗粒物水溶成分和非水溶成分的细胞毒性_曹强

大气细颗粒物水溶成分和非水溶成分的细胞毒性
曹强 1, 钱孝琳 1, 张澍 2, 宋伟民 1, *
1. 复旦大学公共卫生学院环境卫生教研室, 上海 200032
2. 上海国际机场检验检疫局, 上海 201202
收稿日期: 2007-04-19
修回日期: 2007-07-20
录用日期: 2008-03-11
摘要: 为了研究细颗粒物不同成分细胞毒作用的差异, 以细颗粒物水溶成分和非水溶成分对人肺癌上皮细胞株 A 549 细胞染毒. 结果表明, 在染毒剂量为 100 Lg# mL- 1、200 Lg#m L- 1和 300 Lg#mL- 1的范围内, 水溶成分的细胞毒性明显高于非水溶成分 ( P < 0. 05 ), 表现为抑制细胞活性, 导致细胞膜损伤增加, 并且诱导细胞活性氧 ( RO S )的产生. 使用 N-乙酰半胱氨酸 ( NAC ) 和抗坏血酸 ( V it C ) 阻断活性氧 ( RO S ) 产生的研究结果表明, 与未加上述抗氧化剂的染毒组相比, 加抗氧化剂的染毒组细胞的活性明显增强, 因此, 提示细颗粒物水溶成分是最主要的毒性成分之一, 而氧化-应激损伤可能是细颗粒物细胞毒作用的重要机制之一. 关键词: 细颗粒物; 水溶成分; 非水溶成分; 活性氧
26细胞内活性氧ros含量的检测fanning1998dcfhda是一种非极性非荧光化学物质能迅速透过细胞膜进入胞质被细胞内的脂酶降解为二氯荧光素dcfh后者可被活性氧族ros自由基迅速氧化成为高效荧光物质dcfdcf的荧光强度与细胞内ros含量呈正相关且不能自由进出细胞膜因此可通过测定细胞悬液的荧光强度来反映细胞内ros的含量
2 材料与方法 ( M ater ia ls and m ethods)

乳酸脱氢酶(LDH)

tamyltransferase, Lactate Dehydrogenase, Alanine Aminotransferase and Creatine Kinase at 37°C.A document describing the determination of prelim-inary upper reference limits is also in preparation. The procedure described here is deduced from the previ-ously described 30°C IFCC reference method (1). Dif-ferences are tabulated and commented on in Appen-dix1. Clin Chem Lab Med 2002; 40(6):643–648Key words:IFCC reference procedure; Lactate dehy-drogenase; Preliminary reference interval. Abbreviations:ALT, alanine aminotransferase; AST, aspartate aminotransferase; LDH, lactate dehydroge-nase; NAD, β-nicotinamide adenine dinucleotide; NADH, β-nicotinamide adenine dinucleotide, reduced form.Reaction PrincipleL-(+)-Lactate + NAD+–LDH→Pyruvate + NADH + H+SpecimensCalibration materials, control specimens and human sera.Measurement ConditionsConcentrations in the final reaction mixture and the measurement conditions are listed in Tables 1 and 2.Reagents1.N-Methyl-D-glucamine, (C7H17NO5), M r=195.222.L(+)-Lactic acid, monolithium salt (C3H5O3Li),M r=96.013.β-Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), freeacid (C21H27N7O14P2), M r=663.44.NAD, lithium salt, dihydrate (C21H26N7O14P2Li .2H2O), M r=705.45.Hydrochloric acid (HCl), M r=36.46, 2mol/l6.Sodium chloride (NaCl), M r=58.44Note:NAD can contain inhibitors for LDH. The absence of inhibitors should be declared by the manufacturer.Reagents of the highest purity must be used. If a chemical is suspected of containing impurities affect-ing the catalytic activity of the analyte, further investi-gations must be performed, parisons with products from different manufacturers and different lots.It is recommended to use reagents which have al-ready been tested and approved in comparisons. Charts for the Adjustment and the Control of the pH Values (Procedure for the Adjustment of pH Values at Temperatures Diverging from 37°C)Both the thermometer and the pH electrode are sus-pended in the mixed solution simultaneously. The stirred solution is then titrated to the pH value listed in the chart for the currently measured temperature. The speed of agitation should be the same during the cali-bration, the control and the adjustment of the pH value. The pH electrode should be positioned in the centre of the stirred solution.The fact that the temperature can change during the titration must be taken into account. For this reason, the temperature in the proximity of the target value should be controlled again and the target pH value corrected according to Table3, if necessary. The same applies to the adjustment of the temperature compensation of the pH meter.Preparation of SolutionsThe given mass of the compounds for the preparation of solutions refers to 100% content. If the content of the reagent chemical employed is less (e.g.yz %), the amount equivalent to the given mass is calculated by the use of a factor: F content=100/yzHighly purified water with a quality comparable to bi-distilled water (conductivity < 2µS/cm, pH 6–7, sili-cate < 0.1mg/l) shall be used for the preparation of the reagent solutions.The expanded (k=2) combined uncertainty (normally distributed) of each weighing procedure (including the uncertainty of the purity of the substance) shall be ≤1.5%.Reaction solution7.30 g (373.8mmol/l) N-Methyl-D-glucamine0.552 g (57.50mmol/l) Lactic acid, monolithium salt–Dissolve in about 80ml water.–Adjust to pH (37°C) 9.4 with 2mol/l hydrochloric acid.–Transfer to a 100ml volumetric flask.–Equilibrate the volumetric flask and water to 20°C.–Fill the water (20°C) up to the calibration mark of the volumetric flask.Stability at 2°C–8°C: 1 monthStart reagent solution0.240 g (36.23mmol/l) NAD, free acid0.556 g (78.78mmol/l) NAD, lithium salt, dihydrate Note:The use of NAD free acid without NAD lithium salt for the preparation of the start reagent solution (as stipulated for the IFCC 30°C reference method) reason-ably decreases the pH value of the final complete reac-tion mixture.A start reagent solution containing a mixture of NAD free acid and NAD lithium salt has two advantages:1.The pH value of the final complete reaction mixture does not decrease.2. The absorbance of NAD depends strongly on the pH value but the change of the absorbance due to a change of the pH value occurs not spontaneously. Therefore, the reagent blank rate reaction remains non-linear for about 4–6 minutes if NAD free acid as the start reagent solution is added to the alkaline reaction solution. This effect is considerably reduced if the start reagent solution contains a mixture of NAD free acid and NAD lithium salt.Note:The above recommended NAD free acid/NAD lithium salt mixture dissolves rather slowly. Raising the temperature (up to 40°C) speeds up the dissolving process.–Dissolve in about 6ml water.–Transfer to a 10ml volumetric flask.–Equilibrate the volumetric flask and water to 20°C.–Fill water (20°C) up to the calibration mark of the vol-umetric flask.Stability at 2°C–8°C: 1 weekSample blank rateDue to the lactate content in the sample, it is not possi-ble to determine the sample blank rate.Upper limit of the measurement rangeIf the change of absorbance exceeds 0.00275 s-1(0.165 min-1) in the measurement interval an analytical portion of the sample must be diluted with 9g/l (154mmol/l) sodium chloride solution and the measurement proce-dure must be repeated with the diluted specimen. The obtained value must then be multiplied by the corre-sponding factor of the dilution.Sources of errorIf alanine aminotransferase (ALT) or aspartate amino-transferase (AST) have been examined in the cuvette prior to the LDH determination, a possible interference of displaced LDH from AST/ALT test mixtures with the measurements must be taken into account. CalculationThe temporal change of absorbance (s-1) is calculated with the analysis of regression (method of the least squares). After subtraction of the reagent blank rate the corrected change of absorbance is multiplied by the factor:F=3651 (measurement at 339nm, ε339(NADH)= 630m2/mol).The catalytic concentration of LDH is calculated in µkat/l.∆A/∆t LDH: change of absorbance (in s-1) after correction of the reagent blank rateb LDH: catalytic concentration of LDHb LDH=3651 .∆A/∆t LDHThe catalytic concentration in µkat/l can be converted to U/l by multiplication by the factor f=60.Preliminary Upper Reference LimitsThe preliminary upper reference limits for adults (≥17 years) were investigated separately for men (n=441) and women (n=438) (1).Gender Upper reference limit* (and 90% confidence interval)Women 4.12 µkat/l (4.07 µkat/l–4.25 µkat/l)Men 4.13 µkat/l (4.05 µkat/l–4.22 µkat/l)Gender Upper reference limit* (and 90% confidence interval)Women247 U/l (244 U/l–255 U/l)Men248 U/l (243 U/l–253 U/l)* The upper reference limits are the 97.5th percentiles of the reference collectives.Inside parentheses are the 90% confidence intervals of the 97.5th percentiles.Appendix 1: Changes in the IFCC Reference Procedure for Measurements at 37°C Compared with the Reference Method for Measurements at 30°C as Described in the Original IFCC DocumentThe primary reference procedure is deduced from the IFCC reference method (1) which provides optimised conditions for the measurement of catalytic activity concentrations of LDH. The measurement temperature of 37°C instead of 30°C requires only minimal changes of certain measurement parameters to retain the opti-mum measurement conditions. The modifications are listed and commented on in Table5. Furthermore, if in comparison to the 30°C reference method a more ac-curate specification has become necessary for improv-ing the high standardisation of the measurements, it is also described here.References1.Bais R, Philcox M. International Federation of Clinical Chem-istry (IFCC). Approved recommendation on IFCC methods for the measurement of catalytic concentrations of en-zymes. Part 8. IFCC method for lactate dehydrogenase. Eur J Clin Chem Clin Biochem 1994; 32:639–55.。