微生物的生化试验和血清学试验-福州黎明职业技术学院

第四章微生物的生化试验和血清学试验【教学内容】：细菌生化试验的概念；各种生化试验的原理、试验方法和试验结果的观察及记录。

【教学要求】：1、掌握细菌生化试验的概念；2、掌握各种生化试验的原理、试验方法和试验结果的观察及记录。

【重点】：各种生化试验的原理、试验方法和试验结果的观察及记录。

【难点】：各种生化试验的试验方法的掌握和如何利用试验结果来判别某种细菌此试验的阴阳性。

【教学内容】第一节微生物的生化试验一、概述（一）、什么是生化试验指通过利用生物化学的方法来测定微生物的代谢产物、代谢方式和条件等来鉴别细菌的类别、属种的试验。

（二）检验细菌的生化试验范围1、糖（醇）类代谢试验2、氨基酸和蛋白质代谢试验3、有机酸盐和铵盐的利用试验4、呼吸酶类试验5、毒性酶类试验（三）生化试验的方法1、在培养物中加入某种底物与指示剂,经接种、培养后,观察培养基的PH值变化。

2、在培养物中加入试剂，观察它们同细菌代谢产物所生成的颜色反应。

3、根据酶作用的反应特性，测定酶的存在。

4、根据细菌对理化条件和药品的敏感性，观察细菌的生长情况。

（四）生化试验的注意事项1、待检菌应是新鲜培养物。

培养18~24h。

2、待检菌应是纯种培养物。

3、遵守观察反应的时间。

观察结果的时间，多为24或48小时。

4、应做必要的对照试验。

5、提高阳性检出率，至少挑取2~3待检的疑似菌落分别进行试验。

二、糖（醇）类代谢试验（一）糖(醇)类发酵试验不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同，有的能分解多种糖醇），有的只能分解1~2种糖醇，有的分解糖醇能产酸产气，有的分解糖醇只产酸不产气，根据这些特点，可鉴别细菌。

（二）葡萄糖氧化发酵（O/F）试验细菌对葡萄糖的分解，分为氧化型和发酵型。

氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖，无氧的条件下不能分解葡萄糖；发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。

根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。

（三）V-P试验某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为双乙酰，在α-萘酚和肌酸的催化作用下，双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。

（四）甲基红（Methyl Red）试验细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后，由于代谢的途径不同，有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红色，为甲基红试验阳性；有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物，培养液pH＞5.4，甲基红指示剂呈桔黄色，为甲基红试验阴性。

（五）七叶苷水解试验七叶苷被细菌分解后，生成葡萄糖和七叶素，七叶素与Fe2+结合，生成黑色化合物，使培养基呈黑色，以此鉴别细菌。

（六）甘油品红试验某些细菌可分解甘油成为丙酮酸，并进一步脱羧生成乙醛，乙醛与无色品红生成醌式化合物，呈深紫红色，以此鉴别细菌。

三、氨基酸和蛋白质代谢试验（一）靛基质（吲哚）试验某些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成靛基质（吲哚）。

吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合，可形成红色化合物，即玫瑰吲哚，以此鉴别细菌。

（二）H2S试验某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物，产生硫化氢，硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物PbS或FeS，以此鉴别细菌。

（三）尿素酶试验某些细菌能产生尿素酶，将尿素分解产生氨，氨使培养基变为碱性，使培养基中的酚红指示剂呈粉红色，培养基由黄色变为红色，为阳性。

以此鉴别细菌。

（四）氨基酸脱羧酶试验某些细菌能产生氨基酸脱羧酶, 可使赖氨酸、鸟氨酸生产脱羧作用, 生成胺类物质和CO2。

胺类物质使培养基呈碱性变紫色，为阳性, 如呈黄色为阴性，以此鉴别细菌。

（五）苯丙氨酸脱氨酶试验某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基，形成苯丙酮酸，苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物，以此鉴别细菌。

(六) 明胶（Gelatin）液化试验有些细菌具有明胶酶（亦称类蛋白水解酶），能将明胶先水解为多肽，又进一步将多肽水解为氨基酸，明胶失去凝胶性质，使培养基由固态变为液态。

四、有机酸盐和铵盐的利用试验（一）枸橼酸盐利用试验某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源，分解枸橼(柠檬)酸盐生成碳酸盐；同时分解培养基的铵盐生成氨，使培养基变为碱性，使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为深蓝色，为阳性。

（二）丙二酸盐利用试验某些细菌可以利用培养基中的丙二酸盐作为唯一碳源,丙二酸盐被分解成碳酸钠,使培养基变为碱性,培养基由草绿色变成蓝色，为阳性，以此鉴别细菌。

五、呼吸酶类试验（一）氧化酶试验氧化酶使细胞色素C氧化后，氧化型细胞色素C再使盐酸二甲基对苯二胺氧化，使生成玫瑰红色到暗紫色的醌类化合物,再和α-萘酚结合,生成吲哚酚蓝,呈蓝色反应，为阳性。

（二）过氧化氢酶试验某些细菌可分泌过氧化氢酶，加入过氧化氢后，可将过氧化氢分解生成水和氧气，产生气泡，即为阳性反应。

（三）硝酸盐还原试验某些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，在酸性条件下，亚硝酸盐可生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，生成重氮苯磺酸，重氮苯磺酸再与α-萘胺作用，生成红色的化合物，呈红色反应，为阳性反应。

（四）氰化钾试验氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂,可与呼吸酶作用使酶失去活性,抑制细菌的生长,但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长,以此鉴别细菌。

六、毒性酶类试验（一）溶血试验某些细菌在代谢过程中能产生溶血素，可使人或动物的红细胞发生溶解，不同的细菌有不同的溶血反应，借此可鉴别细菌。

（二）链激酶试验A群链球菌群能产生链激酶，该酶能使血液中的纤维蛋白酶原变成纤维蛋白酶，而后溶解纤维蛋白，使血凝块溶解 ,为阳性反应。

此试验用于测定链球菌的致病性。

阳性反应具有致病性。

（三）卵磷脂酶试验某些微生物能产生卵磷脂酶，在钙离子存在时，能迅速分解卵磷脂，生成不溶性甘油酯和水溶性磷酸胆碱，在卵黄琼脂平板上菌落周围形成不透明的乳浊环或混浊白环，或使血清、卵黄液变混浊，以此鉴别细菌。

（四）血浆凝固酶试验致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，可使血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白，附着在细菌的表面，形成凝块；或作用于血浆凝固酶原，使它成为血浆凝固酶，从而使抗凝的血浆发生凝固现象,为阳性。

七、三糖铁（TSI）琼脂试验如果细菌可利用乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气，培养基全部变黄；如果只可以利用葡萄糖，葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面最后为红色，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，仍保持黄色。

如果细菌又能分解含硫化合物，产生硫化氢，培养基底部变黑。

复习题：1、什么是生化试验?2、做生化试验要注意哪些事项？3、简述糖醇类发酵试验的原理，写出其试验方法和结果的记录。

4、简述甲基红试验（MR）的原理，写出其试验方法和结果的记录。

5、简述靛基质试验的原理，写出其试验方法、结果的记录和注意事项。

6、简述硫化氢试验的原理，写出其试验结果的记录和注意事项。

7、简述尿素酶试验的原理，写出其试验方法、结果的记录。

8、简述氨基酸脱羧酶试验的原理，写出结果的记录、阳性反应试验管颜色变化过程和原理。

9、写出溶血试验的溶血类型及现象。

10、简述链激酶试验的原理。

11、简述血浆凝固酶试验的原理，并写出玻片法的试验方法。

12、简述三糖铁（TSI）试验的试验的原理。

第二节血清学试验血清学反应：指相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，所出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。

一、抗原与抗体1、抗原的概念抗原(Ag)：是指凡能刺激机体免疫系统诱导免疫应答，并能与应答产生的抗体或致敏淋巴细胞发生特异反应的物质。

2、抗原的特性：免疫原性、免疫反应性3、抗体：是指机体内的淋巴系统细胞在抗原物质的激发下，所合成的一种具有特异性免疫功能的球蛋白(免疫球蛋白)。

4、抗体的理化性质：（1）抗体是球蛋白（2）免疫球蛋白5、抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应二、血清学反应的特点1、具有特异性与交叉性2、具有敏感性3、具有定理特性。

4、反应的两个阶段性5、反应的稳定性与可逆性的三、影响血清学试验的的因素1、抗体2、抗原3.、电解质常用:0.85％氯化钠或各种缓冲液作用:中和胶体粒子上的电荷，使胶体粒子的电势下降，促使抗原抗体复合物从溶液中析出，形成可见的沉淀物或凝集物。

4、酸碱度: pH为6～8进行5、温度:一般以15~40℃为宜，最适为37℃。

四、血清学反应的种类1、凝集反应2、沉淀反应3、中和反应4、标志抗体技术复习题：1、血清学反应、抗原、抗体、抗原抗体反应的概念。

2、影响血清学试验的因素有哪些？3、血清学试验常用的电解质有哪些，有什么作用？4、写出血清学试验中玻片凝集法的原理和试验的方法步骤。

5、诊断血清、抗O血清、抗H血清、多价诊断血清、单价诊断血清、因子诊断血清的概念。