细菌的生理生化实验

1 目的

1.1 了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理

1.2 掌握测定细菌生理生化反应的技术和方法

2 原理

各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，这种差异就表现的更加明显。不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不相同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系统。即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。

3 材料

3.1 菌种

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌

（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面菌种

3.2 培养基

葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、糖发酵培养基（葡萄糖、乳糖或蔗糖）

3.3 试剂

40％NaOH溶液、肌酸、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚、1.6%溴甲基酚紫指示剂。

3.4 器具

超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、杜氏小套管。

4 流程

糖发酵试验→V-P试验→甲基红试验→吲哚试验

5 步骤

(一) 糖类发酵试验

1 目的

了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法．

2 原理

可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌

种的依据。是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察。

3 材料

3.2菌种

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌

（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）的斜面菌种

3.３培养基

葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管

４流程

发酵液试管→标记→接种→培养→观察→记录

5 步骤

5.1 试管标记图9-1 糖发酵产气

取分别装有葡萄糖、蔗糖和乳糖发酵培养液试管各Ａ不产气；Ｂ产气

4支，每种糖发酵试管中均分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌和空白对照。

5.2 接种培养

以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。将装有培养液的杜氏小管倒置放入试管中（图9-1），置37℃恒温箱中培养，分别在培养24h、48h、和72h

观察结果。

5.3 观察记录

与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“－”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“＋”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“＋”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“－”表示。（二）乙酰甲基甲醇试验(V．P试验)

1 目的

了解鉴别不同肠杆菌科各菌属的乙酰甲基甲醇试验原理，并掌握其操作方法．

2 原理

某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养液中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧，氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V－P（+）反应。

3 材料

3.1 菌种

大肠埃希氏菌（Escherichia coli）、产气肠杆菌

（Enterobacter aerogenes）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的斜面菌种

3.2 培养基

葡萄糖蛋白胨培养液的试管

４流程

培养液试管→标记→接种→培养→观察→记录

5 步骤

5.1 标记试管

取5支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、普通变形菌、枯草芽孢杆菌和空白对照。

5.2 接种培养

以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37℃恒温箱中，培养24～48h。

5.3 观察记录

取出以上试管，振荡2min。另取5支空试管相应标记菌名，分别加

入3～5ml以上对应管中的培养液，再加入40％NaOH溶液10～20滴，并用牙签挑入约0.5～1mg微量肌酸，振荡试管，以使空气中的氧溶入，置37℃恒温箱中保温15～30min后，若培养液呈红色，记录为V.P.试验阳性反应（用“＋”表示）；若不呈红色，记录为V.P.试验阴性反应（用“－”表示）。

注意：原试管中留下的培养液用作甲基红试验。

（三）甲基红试验（M.R.试验）

1 目的

了解鉴别肠杆菌科各菌属的甲基红试验原理，并掌握其操作方法．2 原理

肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。

3 材料

3.1 菌种

同V．P试验

3.2 培养基

同V．P试验

4 流程

培养液→指示剂→观察→记录结果

5 步骤

于V.P.试验留下的培养液中，各加入2～3滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“＋”或“－”表示。

（四）吲哚试验

1 目的

掌握吲哚试验(Ehrlich法)的原理和方法

2 原理

有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质)。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。

3 材料

3.1菌种

测试菌株．

3.2培养基

蛋白胨水培养基

3.3试剂

二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。

4流程

标记试管→接种→培养→观察→记录

5步骤

5.1 试管标记

取装有蛋白胨水培养液的试管5支，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、