人大肠癌细胞系HCTll6中Sirt1基因敲除细胞株的构建
一种SIRT1基因敲除的IPEC-J2细胞系的构建方法[发明专利]
![一种SIRT1基因敲除的IPEC-J2细胞系的构建方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/65aa08f4fad6195f302ba640.png)
专利名称：一种SIRT1基因敲除的IPEC-J2细胞系的构建方法专利类型：发明专利
发明人：鲁慧杰,马现永,陈卫东,邓盾,容庭,田志梅,刘志昌
申请号：CN201910467685.3
申请日：20190530
公开号：CN110184302A
公开日：
20190830
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种SIRT1基因敲除的IPEC‑J2细胞系的构建方法，包括如下步骤：(1)针对SIRT1基因的第一外显子设计并合成gRNA探针，gRNA的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其反向互补序列如SEQ ID NO.2所示；(2)将退火后形成反向互补的双链gRNA探针克隆到如图2所示的pSpCas9‑2A‑PuroV2.0载体中，构建同时表达如SEQ ID NO.1所示sgRNA和Cas9蛋白的质粒；(3)将步骤(2)构建好的质粒转染到IPEC‑J2细胞；(4)从步骤(3)转染后的IPEC‑J2细胞筛选单克隆突变细胞系，得到SIRT1基因敲除的IPEC‑J2细胞系，其相比野生型细胞系，缺少了SIRT1基因第一外显子中的5个碱基。
本发明首次构建SIRT1基因敲除的IPEC‑J2细胞系，筛选得到稳定的单克隆SIRT1基因敲除IPEC‑J2纯合细胞系，可作为研究仔猪肠道氧化应激的细胞模型。
申请人：广东省农业科学院动物科学研究所
地址：510000 广东省广州市天河区五山路大丰一街1号
国籍：CN
代理机构：广州三环专利商标代理有限公司
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cas9 构建基因敲除细胞系 步骤
cas9 构建基因敲除细胞系步骤1. 设计gRNA序列需要设计合适的gRNA（guide RNA）序列。
gRNA是一种由RNA和DNA组成的分子，在CRISPR-Cas9系统中起到引导Cas9蛋白识别和切割目标DNA的作用。
gRNA序列应当与目标基因的特定区域互补，并且要避免与其他基因的序列相互匹配。
2. 合成gRNA和Cas9蛋白合成设计好的gRNA序列，并将其与Cas9蛋白结合。
Cas9蛋白是CRISPR-Cas9系统中的核酸酶，能够与gRNA一起识别目标DNA 序列，并在其靶向区域引发双链断裂。
3. 转染细胞将gRNA和Cas9蛋白复合物转染到目标细胞中。
转染可以使用多种方法，如化学法、电穿孔法或病毒载体介导的转染等。
转染后，gRNA和Cas9蛋白会进入细胞质，并寻找目标基因。
4. 筛选敲除细胞系根据需要敲除的基因，选择适当的筛选方法来鉴定敲除细胞系。
常用的筛选方法包括PCR、Western blot和细胞克隆等。
通过这些方法，可以检测到目标基因的敲除情况。
5. 确认敲除细胞系对筛选出的细胞系进行进一步的确认。
可以使用DNA测序技术对目标基因的敲除位点进行测序验证。
此外，还可以通过功能实验来验证目标基因的敲除效果。
6. 存储和维护敲除细胞系成功敲除目标基因后，需要对敲除细胞系进行存储和维护。
细胞系应当保存在液氮中，以确保其长期保存和使用的稳定性。
同时，细胞系也需要定期培养和检测，以确保其生长状态和敲除效果。
以cas9构建基因敲除细胞系的步骤包括设计gRNA序列、合成gRNA和Cas9蛋白、转染细胞、筛选敲除细胞系、确认敲除细胞系以及存储和维护敲除细胞系。
这些步骤需要在实验室中进行，确保操作的准确性和稳定性。
基因敲除细胞系的建立为研究基因功能和疾病机制提供了有力的工具，对于深入理解生命活动和疾病发生发展具有重要意义。
基因敲除细胞系构建流程
基因敲除细胞系构建流程
基因敲除细胞系构建流程通常包括以下步骤：
1. 确定目标基因：选择需要敲除的目标基因。
2. 基因敲除设计：设计合适的靶向序列，该序列将在基因敲除过程中与目标基因发生特异性的DNA双链断裂。
3. CRISPR-Cas9系统构建：构建CRISPR-Cas9系统，其中包
括Cas9核酸酶和相应的靶向RNA（sgRNA）。
4. 细胞系培养：培养适合的细胞系，如细胞株或原代细胞。
5. 转染：将CRISPR-Cas9系统转染到细胞中，可以使用化学
转染、电转染或病毒载体转染等方法。
6. 筛选敲除细胞：在转染后的细胞中，通过添加选择性抗生素或使用基因标记物等方法，筛选出含有目标基因敲除的细胞。
7. 制备克隆：将筛选出的细胞进行单细胞克隆，并培养扩增。
8. 确定敲除效果：通过PCR、Western blot、流式细胞术或其
他适合的实验方法检测敲除细胞的基因表达水平和蛋白质表达。
9. 验证敲除细胞的功能：通过细胞功能实验，如细胞增殖、凋亡、迁移等实验，验证目标基因敲除对细胞功能的影响。
注意：以上流程是一般化的基因敲除细胞系构建流程，具体步
骤和条件可能因实验目的、细胞类型、基因敲除方法等而有所不同。
敲除细胞系构建流程
敲除细胞系构建流程1. 背景介绍在基础医学研究和药物开发过程中，细胞系是不可或缺的研究工具。
一些细胞系在长期培养过程中产生了不稳定性和突变，导致细胞系极难与原始样本保持一致。
为了得到更加准确和可复现的实验结果，需要进行敲除细胞系构建。
敲除细胞系构建是在原始细胞系基础上进行基因敲除或基因编辑，使得细胞失去某种功能或表达特定目标基因。
这种细胞系常被用于基因功能研究和药物筛选。
本文将详细介绍敲除细胞系的构建流程。
2. 敲除细胞系构建流程2.1 细胞系选择敲除细胞系构建需要选择适合的细胞系作为基础细胞系。
常用的细胞系有HEK293、HeLa、U2OS等。
这些细胞系具有较高的增殖能力、易于培养和转染。
2.2 构建载体设计针对所需敲除基因或基因组编辑，需要设计相应的敲除载体。
常见敲除载体有CRISPR/Cas9和siRNA两种。
（1）CRISPR/Cas9系统CRISPR/Cas9系统是一种基因编辑技术，基于系统间自行获得的免疫机制，是一种高效、简便、具有基因组广泛靶向能力的技术。
其构建载体一般由RNA或DNA靶向序列、Cas9酶和选择标记三部分组成。
RNA靶向的载体可添加注释标记和基因识别码，以更好地确认敲除效果。
DNA靶向的载体可经由克隆技术，将CRISPR靶向序列和Cas9融合于同一内在表达序列当中。
选用足够活性的RNA靶向序列，可以提升Cas9酶的效率，并提高敲除细胞系的成功率。
可加入荧光标记，以鉴定敲除基因的表达情况。
（2）siRNA系统siRNA技术是通过小干扰RNA（siRNA）诱导RNA靶向降解，达到基因功能消除的效果。
siRNA载体由siRNA靶向序列和选择标记两部分构成。
siRNA与靶向序列互相排除形成，可识别靶标基因，导致靶标基因降解和切割。
siRNA敲除效率较低，对于一些重要的基因敲除来说，并不理想。
2.3 转染细胞系作为载体细胞，需要将敲除载体转染至细胞中，同时选择合适的转染试剂进行转染。
基因敲除细胞株构建
基因敲除细胞株构建
基因敲除细胞株构建是一种常用的实验方法，用于在细胞中将特定基因完全删除或失活。
这种方法可以帮助研究人员了解特定基因在细胞中的功能和调控机制。
基本的基因敲除细胞株构建步骤包括：
1.设计合适的敲除策略：选择目标基因的适当敲除策略，可以
是利用CRISPR/Cas9等技术携带与目标基因互补的RNA引导
序列来敲除基因，或者利用RNA干扰（RNAi）或转座子等方法敲除基因。
2.构建敲除载体：根据选择的敲除策略，构建相应的敲除载体，将引导序列、RNAi序列或转座子序列插入合适的表达载体中。
敲除载体可以通过DNA重组技术或化学合成方法制备。
3.细胞转染：选择合适的细胞系，将构建好的敲除载体转染进
细胞。
转染可以通过化学方法（如钙磷法或脂质体转染法）、电穿孔法或病毒载体介导的转染等方法进行。
4.筛选敲除细胞株：对转染后的细胞进行选择和筛选，利用适
当的选择压力（如抗生素或筛选标记基因）对未敲除或不包含敲除载体的细胞进行杀死或标记。
5.确认敲除细胞株：通过PCR、Western blot、免疫荧光染色
或测序等方法对候选细胞株进行确认，确保目标基因的敲除或失活。
基因敲除细胞株构建需要仔细设计和操作，确保目标基因的有效敲除和细胞株的正确筛选。
这种方法在基因功能研究、疾病机制探究和药物筛选等领域具有重要的应用价值。
基因敲除细胞系构建
基因敲除细胞系构建
基因敲除细胞系构建是一种利用基因编辑技术将特定基因从细胞系中删除的方法。
通过这种方法，可以研究该基因在细胞中的功能和作用机制。
基因敲除细胞系构建一般分为以下几个步骤：
1. 设计合适的基因编辑工具：使用CRISPR/Cas9或其他基因
编辑技术来设计和合成针对目标基因的DNA酶切酶和引物。
2. 转染细胞系：将设计好的基因编辑工具转染到目标细胞系中。
3. 酶切目标基因：通过合成的基因编辑工具，将酶切酶导入到目标细胞的细胞核中，使其与目标基因特定的DNA序列配对，并引发DNA双链断裂。
4. DNA修复：在DNA双链断裂的情况下，细胞会启动自身的修复机制。
如果不引入外源的修复模板，细胞往往会选择非同源末端连接或错配修复等机制，导致目标基因缺失或插入突变。
5. 筛选和检测：通过PCR、DNA测序等方法对细胞群体进行
筛选和检测，找出目标基因敲除细胞系。
通过基因敲除细胞系构建，可以研究目标基因在细胞生理和病理过程中的功能和作用机制。
同时，该方法也为研究相关基因治疗和药物靶点提供了重要的细胞模型。
构建敲除细胞系
构建敲除细胞系如何快速构建属于自己的基因敲除细胞系？这是很多做细胞基因功能研究的人关心的问题，需要多久？具体的流程? 怎么选择细胞？如果这些问题也困扰着你，那我们一起来看看如何快速构建一个基因敲除细胞系吧。
7、HepG2（人肝癌细胞，做肝脏研究），HEK293（做蛋白表达和基因功能研究），HCT116（人结肠癌细胞，上皮样细胞），K562（人白血病细胞，血液细胞），CAL27（人口腔鳞癌细胞，口腔研究），THP-1（人单核巨噬细胞），RAW1、上面的细胞就是比较好做的啦，好的细胞增殖好，培养基简单（有些细胞加的因子，会让你怀疑经费够不够被细胞宝宝吃的），最重要的是是不是能够形成单克隆（后面会讲到）；2、细胞有没有支原体感染（老问题，但是很重要，测过一大半的细胞都是不行的，很多实验室都不行，送过来检测有的细胞感染了：猪鼻支原体^(*￣(oo)￣)^，大概是这样的），还有就是一旦感染建议直接换细胞，不要想着去救，是救不过来的！3、再有就是细胞的基因检测；可以这么说吧，细胞在培养的过程中达尔文的进化论一直在起作用，所以每一代的细胞都会累积突变，两天一代，你可以想象细胞的进化速度得多快，没错.....他们就是进化得非常快，所以很多基因都不一样了和你想的。
凡是对细胞增殖有优势的基因都会被累积加起来。
所以我们要对目的敲除的基因的gRNA结合位点进行测序，看看sequence对不对，要不后面切不动也不知道怎样办！ლ(′◉❥◉｀ლ)就是这样做的：设计一对PCR的primer，扩出来去测序，再对比一下基因库；太简单就不说了！5、细胞做基因敲除之前要做的事情就是：养它三代以上，让它适用你的培养基和实验室环境。
第二步，做基因敲除的转染1、质粒脂质体的虽然低效也可以试试，好处是便宜（但是做基因点突变和KI就不用试了，效率肯定奇低无比）；2、病毒法（慢病毒）：效率高一般是两个病毒，一个带Cas9蛋白，一个带gRNA，但是成本高，一般实验室也不想搞病毒，周期长；3、我们用的是自己开发的VIRUS-Free技术：一个质粒搞定Cas9+gRNA+GFP+你想带的任何序列，构建稳转细胞株，和质粒一样的成本，和病毒一样高的效率，当然是结合我们独有的细胞电转技术实现的；第三步，挑克隆或是稀释克隆法将电转或者转染3天后的细胞进行单克隆化，筛选其中的纯合基因敲除细胞；1、药物筛选，如果没有药物筛选就只能盲筛了，多做几个96孔板去做PCR筛选就好了；大概一般需要5-10块板吧2、病毒法和VIRUS-Free一般就是药筛富集敲除细胞，然后就可以再接到96孔板进行单克隆，一般3-5块板；3、ClonePlus技术，基因敲除细胞克隆筛选的利器，克隆形成率98%，一般就需要2块板；顺带说一下：移码敲除和大片段敲除的差异！1、移码敲除：简单点说就是导致缺少了非3倍数的碱基（3个碱基编码一个氨基酸），所以会导致后面的转运回来氨基酸都是错的，所以导致了基因功能的缺失；优点：这个很多敲除公司使用的方法，好处是简单，便宜；缺点：WesternBlot不确定，而且细胞里面的不同基因的敲除的序列不一样，可能会有恢复修复的机制，同时mRNA也有多个转录本，不排除后面有部分的蛋白会出现。
【分享】基因敲除细胞株构建流程
【分享】基因敲除细胞株构建流程如果选择的方法不对，或者细胞株不对，不同的细胞株做基因敲除细胞系的改造会有什么变化呢？筛选细胞是基因敲除细胞成败的重要环节！如果没有正确的方法那么基因敲除的细胞株工作就不能顺利的进行，首先要知道影响基因敲除细胞系的主要关键点是什么？其次是要了解和熟悉具体的实验流程和实验步骤，让自己轻松的完成基因敲除细胞株的构建流程。
一. 如何选择基因敲除的细胞：1.关键点：支原体污染在绝大部分的实验室里都不太被重视，如果支原体污染了细胞，则会导致细胞产生很多问题：如细胞的增殖问题，同时还会影响细胞的代谢，产生的数据也会有很大的误差，所以在实验室里的技术人员都需要非常重视。
2.检测方法有两种：细胞培养和PCR鉴定。
3.基因敲除的优势：克隆形成率高，敲除效率高，细胞容易增殖，但是有一个例外就算是做了细胞基因敲除株的构建，也无法获得基因敲除的单克隆细胞，那就是没有多基因的问题；染色体不突变；难增殖的细胞；细胞的数量有限；做基因敲除细胞株难以得到纯合子敲除的细胞系的原因就是克隆的拷贝数太多。
4具体原因：只能是肿瘤细胞系，不能是永生细胞系，往往很多永生细胞系做起来都比较有挑战性，当在做基因敲除细胞株时，如果敲除效率是x，则拷贝数是n，那么纯合敲除的效率就是：x^n，可见效果就不显著了。
二. 基因敲除细胞系的敲除方法：1.建议首选：如果只是做常规的移码敲除，那么一个细胞里面只有2个基因位点，是很难保证两个基因位点是一样的移码，所以得到移码的数据也不同，当你在鉴定测序看图的时候就没有那么清晰，所以，选择片段敲除是一个较为有效的办法。
2.关键点：移码敲除在很多时候并不彻底，会在后续的实验中出现Western Blot的问题，出现神秘的条带，大片段的基因敲除是几kb的缺失，mRNA就没有目的蛋白的转录，Western Blot问题也解决了，鉴定敲除方法：纯合敲除细胞系，比移码敲除效率更高。
3.如何判断是大片段敲除的细胞系：主要是通过目的基因片段对PCR扩增的方式判断。
基因敲除动物模型构建步骤
基因敲除动物模型构建步骤
①. 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
②.ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
③.同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。
④.选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然发生率极低，动物的重组概率为10-2 ～10-5 ，植物的概率为10-4 ～10-5 。
因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。
目前常用的方法是正负筛选法(PNS法)，标记基因的特异位点表达法以及PCR 法。
其中应用最多的是PNS法。
⑤.表型研究：通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。
⑥.得到纯合体：由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。
Tff1基因敲除小鼠构建技术原理
Tff1基因敲除小鼠构建技术原理
基因敲除小鼠是什么？是否就是我们平日所说的实验室用的小白鼠?其实小鼠有很多种，小白鼠只是其中一种，通常普通的小白鼠多被药厂用作临床试验，而基因敲除的小鼠，则用于更尖端的生物医学研究。
基因敲除小鼠技术原理：是先在小鼠的胚胎干细胞上通过基因重组的办法进行基因修饰——就是将胚胎干细胞中的靶向基因改掉,然后将“修饰”后的胚胎干细胞植入小鼠的早期胚胎,生成嵌合体小鼠。
这种嵌合体小鼠长大后,体内同时存在被“修饰”过的基因和未被“修饰”的基因。
下面是，Tff1敲除小鼠介绍
TFF1是一种肿瘤抑制因子，主要由胃小凹表面黏液细胞表达，调节胃腺的正常分化，通过与各种粘蛋白的相互作用，TFF1可以保护胃粘膜免受侵蚀。
Tff1敲除（Tff1-/-）小鼠在1周龄时出现胃上皮细胞增生，其中30%小鼠在20周时出现上皮内多发的大病灶甚至浸润腺癌[4]。
Tff1的敲除会促进经典NF-κB信号传导途径的激活，进而导致胃癌形成过程中的炎症加强。
SIRT1基因敲低增强HepG2细胞对单壁碳纳米角的敏感性
SIRT1基因敲低增强HepG2细胞对单壁碳纳米角的敏感性贺轲;黄睿;夏正林;段小鹏;何景亮;李伯伟;张锦前;向国安【期刊名称】《中国医学物理学杂志》【年(卷),期】2017(034)005【摘要】目的:探讨SIRT1基因敲低增强HepG2细胞对单壁碳纳米角(Single-Walled Carbon Nanohorns,SWNHs)的敏感性.方法:通过在HepG2细胞中建立过表达和敲低SIRT1的细胞株,流式细胞检测不同SIRT1表达水平对HepG2细胞周期的影响;采用不同浓度SWNHs对HepG2细胞进行处理,CCK-8法评估HepG2细胞对SWNHs的敏感性;采用Westernblotting探索SIRT1影响HepG2细胞凋亡的机制.结果:获得低表达si-SIRT1和高表达pLV-SIRT1细胞株,发现si-SIRT1组细胞周期阻滞,并且有(14.94±1.22)％细胞出现凋亡,HepG2组和pLV-SIRT1组细胞凋亡率分别为(5.43±0.34)％和(4.49+0.34)％,si-SIRT1组与之相比,差异具有统计学意义(P＜0.05);SIRT1基因敲低增强HepG2细胞对SWNHs的敏感性,低表达si-SIRT1组的数据显示,低浓度SWNHsl0在24h后si-SIRT l-HepG2细胞的活性下降到(43.22±2.21)％,而最大剂量SWNHs40在48 h后si-SIRTl-HepG2细胞的活性下降到(2.02±0.13)％,与对照组(HepG2组)相比差异具有统计学意义(P＜0.05);通过Western-blotting验证,si-SIRT1组的P53表达增高,其相关下游凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-7也出现高表达.结论:通过敲低SIRT1后HepG2细胞周期阻滞,对SWNHs的敏感性显著增强,SWNHs有望成为一种有效的生物治疗肝癌的新方法.【总页数】5页(P484-488)【作者】贺轲;黄睿;夏正林;段小鹏;何景亮;李伯伟;张锦前;向国安【作者单位】广东省第二人民医院普通外科,广东广州510317;广东省第二人民医院普通外科,广东广州510317;广东省第二人民医院普通外科,广东广州510317;广东省第二人民医院普通外科,广东广州510317;广东省第二人民医院普通外科,广东广州510317;广东省第二人民医院普通外科,广东广州510317;广东省第二人民医院普通外科,广东广州510317;广东省第二人民医院普通外科,广东广州510317【正文语种】中文【中图分类】R392.12【相关文献】1.敲低CUEDC2基因表达可增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性 [J], 李金航;王爱春;周涛;李涛;蔡宏;刘爱军2.敲低CUEDC2基因表达可增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性 [J], 李金航;王爱春;周涛;李涛;蔡宏;刘爱军;3.敲低和敲除OPTN基因SKOV3细胞的构建及其对抗癌药物敏感性的影响 [J], 王鹏;陈曦;徐恰;刘会;郭若文;刘芸;许尹;秦宜德4.单壁纳米碳管增强纳米铝基复合材料的制备 [J], 钟蓉;丛洪涛;成会明;卢柯5.单壁纳米碳管/纳米铝基复合材料的增强效果 [J], 丛洪涛;钟蓉;成会明;卢柯因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
SIRT1基因对猪卵巢颗粒细胞凋亡因子表达量的影响
SIRT1基因对猪卵巢颗粒细胞凋亡因子表达量的影响赵芳;郅西柱;任守文;付言峰;李碧侠【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2014(030)002【摘要】为探究SIRT1基因在猪卵巢颗粒细胞凋亡中的作用机制,采用荧光定量PCR方法检测不同浓度白藜芦醇和尼克酰胺处理的颗粒细胞中SIRT1基因的表达规律性,以及凋亡相关因子基因Bax、Caspase-3、Bcl-2表达量的变化,采用SPSS 统计分析SIRT1基因与凋亡相关因子表达量的相关性.结果表明,一定浓度的白藜芦醇和尼克酰胺能调节猪卵巢颗粒细胞中SIRT1基因表达;SIRT1基因的表达与Bax、Caspase-3的表达呈正相关,相关系数分别为0.664和0.815;SIRT1基因的表达与细胞凋亡因子基因Bcl-2的表达相关性不显著.说明S1RT1基因可通过影响线粒体信号通路中凋亡因子的表达参与猪卵巢颗粒细胞凋亡的调控.【总页数】6页(P325-330)【作者】赵芳;郅西柱;任守文;付言峰;李碧侠【作者单位】江苏省农业科学院畜牧研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院畜牧研究所,江苏南京210014;南京农业大学动物科技学院,江苏南京210095;江苏省农业科学院畜牧研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院畜牧研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院畜牧研究所,江苏南京210014【正文语种】中文【中图分类】S828.2【相关文献】1.去乙酰化酶SIRT1过表达对猪卵巢颗粒细胞中AMPK活性的影响 [J], 赵芳;任守文;赵为民;付言峰;李碧侠2.猪卵巢颗粒细胞中SIRT1基因表达量对卵泡闭锁的影响 [J], 李碧侠;赵芳;任守文;王学敏;方晓敏;付言峰;涂枫;王金玉3.SIRT1基因对猪卵巢颗粒细胞中生殖激素受体基因表达量的影响 [J], 李碧侠;赵芳;任守文;付言峰4.猪卵巢颗粒细胞中SIRT1基因表达量与雌激素分泌的相关性 [J], 李碧侠;赵芳;付言峰;王学敏;方晓敏;涂枫;任守文;王金玉5.补肾益冲抗衰汤对卵巢储备功能下降大鼠卵巢颗粒细胞凋亡因子Bcl-2、Bax、Caspase-3的影响 [J], 张妙;邱晓晓;朱长玲;朱程芬;程泾因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
MT1-MMP基因敲除细胞诱导性多能干细胞系的构建的开题报告
MT1-MMP基因敲除细胞诱导性多能干细胞系的构建
的开题报告
摘要：
诱导性多能干细胞(iPSCs)是通过重新编程成熟细胞转化为全能状态
的细胞，是干细胞研究中最具有前景的领域之一。
本研究旨在构建MT1-MMP基因敲除的iPSCs系，探究MT1-MMP对iPSCs的影响及其作用机制，为干细胞治疗提供新的理论和实验基础。
研究内容：
1. 构建MT1-MMP基因敲除的iPSCs系：采用CRISPR/Cas9技术，
设计MT1-MMP基因的sgRNA序列，转染至iPSCs系，筛选出MT1-MMP 基因敲除的单克隆细胞。
2. 鉴定MT1-MMP敲除的iPSCs系：通过PCR、Western blot、免疫荧光标记等方法，进行MT1-MMP的基因和蛋白表达检测，并比较与野生型iPSCs系的差异。
3. 比较MT1-MMP敲除iPSCs系与野生型iPSCs系的生长特性、克隆形成能力等：通过细胞增殖实验、克隆形成实验等方法，检查MT1-MMP 敲除iPSCs系的生长情况、细胞增殖速度、克隆形成能力等与野生型iPSCs系的差异。
4. 探究MT1-MMP对iPSCs的分化和自我更新的影响：通过细胞培
养实验，比较MT1-MMP敲除iPSCs系与野生型iPSCs系的多向分化能力和自我更新能力的差异，并探究MT1-MMP在调控iPSCs的分化和自我更新机制方面的作用。
研究意义和目标：
本研究将为MT1-MMP在干细胞分化和自我更新机制中的作用提供
新的理论和实验基础，探究其对iPSCs的影响及作用机制，为干细胞治疗
提供新的思路和方法。
同时，通过CRISPR/Cas9技术构建MT1-MMP敲除iPSCs系，为干细胞研究提供新的工具和方法。
基因敲除细胞株技术介绍
基因敲除细胞株技术介绍
基因敲除细胞系
在我们研究基因功能的时候，基因敲除（Knock out，KO）是实现基因loss of function的重要调控方式。
相比于传统的基因干扰（RNAi）技术，基因敲除可完全消除目的基因的表达，最终使其蛋白完全不表达或功能彻底丧失，也让我们可以更好地观察细胞表型的变化。
但基因敲除细胞模型的构建过程较为繁琐，需要耗费很长的实验周期，而且对于经验不是很丰富的研究者，很容易出现做了三四个月却最终敲除效果不彻底的情况，导致研究进度受阻。
细胞敲除成功案例
项目名称：人HCT116细胞PSME3基因敲除（片段敲除）
1、gRNA设计：
gRNA位点1：ATACGCTACCTAACATGGCTGGG；gRNA位点2：CCAGCATGCAAAATACAATGGGG
2、引物合成及质粒构建：
3、细胞转染
首先确定最佳的电转参数，进而通过电转的方式将载体转染进细胞。
4、筛选单克隆细胞并培养
5、PCR及电泳鉴定：
鉴定策略的原理如下：
6、测序鉴定：
ATAAACAGAGGATTTAAGACTTTTGTTATGTTTTAGACGC-del；1809bp--
AGTGGCTAATGCCT GTAATCC CACCACTTTGGGAGGCCAA
7、克隆状态：
细胞检测结果：无菌、无支原体
培养体系：McCoy's 5A+ 10% FBS + 500μg/mL Hygromycin；1:3传代。
基因敲除细胞株构建
基因敲除细胞株构建引言基因敲除是研究基因功能的重要方法之一。
通过敲除目标基因，可以揭示其在生物体内的作用和调控机制。
基因敲除细胞株构建是实现基因敲除的关键步骤之一，它可以为后续的功能研究提供可靠的实验材料。
本文将介绍基因敲除细胞株构建的原理、方法和注意事项。
基因敲除细胞株构建的原理基因敲除细胞株构建的原理是利用DNA重组技术将目标基因的编码区域替换为选择标记基因，从而实现对目标基因的敲除。
选择标记基因通常是抗生素抗性基因或荧光蛋白基因，可以通过抗生素筛选或荧光显微镜观察来筛选敲除细胞。
基因敲除细胞株构建的步骤包括：设计敲除载体、构建敲除载体、转染细胞、筛选敲除细胞株等。
基因敲除载体的设计基因敲除载体是实现基因敲除的关键。
它通常包括目标基因的上下游序列、选择标记基因和重组酶切位点等。
1.目标基因的上下游序列：为了确保敲除载体能够特异地定位到目标基因的编码区域，需要设计目标基因的上下游序列。
这些序列可以通过PCR扩增或人工合成获得。
2.选择标记基因：选择标记基因是敲除载体的重要组成部分，它能够在细胞中提供一个可观察的表型，用于筛选敲除细胞。
常用的选择标记基因有抗生素抗性基因和荧光蛋白基因等。
3.重组酶切位点：重组酶切位点是敲除载体中的特殊序列，用于引导重组酶的切割和连接。
常用的重组酶有限制酶和序列特异性核酸内切酶等。
基因敲除载体的构建基因敲除载体的构建是将目标基因的上下游序列和选择标记基因插入到适当的载体中，形成完整的敲除载体。
构建敲除载体的步骤如下：1.扩增上下游序列：使用PCR扩增目标基因的上下游序列。
这些序列应包含足够的长度，以确保敲除载体能够特异地定位到目标基因的编码区域。
2.构建重组载体：将扩增得到的上下游序列和选择标记基因插入到适当的重组载体中。
可以使用限制酶切割和连接技术，也可以使用序列特异性核酸内切酶。
3.验证敲除载体：通过测序等方法验证敲除载体的正确性。
确保目标基因的上下游序列和选择标记基因已正确插入到载体中。
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疾 病动 物模 型 的建 立 和基 因治 疗 等 方 面 都起 到很 大 贡献 。与小 鼠基 因敲 除相 比 ， 由于人 类体 细胞 同源 重 组 效率 低 ， 而 限制 了基 因敲 除技术 人类体 细 胞 系 中 从 的应用 ’ 。研 究 发 现 ｒ Ａ Ａ Ｖ载 体 中 的外 源 Ｄ Ａ 序 Ｎ 列 整合 进染 色体 同源 位点 的效 率较 高 ， 有证 据 证 明其
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人 大 肠 癌 细 胞 系 ＨＣ ｌ ６中 Ｓｒ Ｔｌ ｉｔ １基 因 敲 除 细 胞 株 的 构 建
贾一帆 张慧 慧 王 卫星 杜 润蕾
摘 要 目的 利 用 Ａ Ｖ 介 导 的 体 细 胞 基 因 敲 除 技 术 ， 人 大 肠 癌 细 胞 系 Ｈ Ｔ １ 中对 靶 基 因 Ｓ ｔ Ａ 在 Ｃ １６ ｉ ｒ １进 行 敲 除 ， 到 基 因 达
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升高和（ ） 或 降低 基 因 的表 达 是研 究 基 因功 能 最 为常用 的两 种 手 段 。小 鼠基 因敲 除 技 术 作 为基 因功
沉 默 的 目的 。 方 法
构 建 Ｓｒ ｉｌ打 靶 载 体 ， 过 病 毒 包 装 、 染 、 物 筛 选 、 Ｃ ｔ 通 感 药 Ｐ Ｒ鉴 定 、 ｓ ｒ ｌｔｎ 定 等 步 骤 获 得 Ｓ ｔ Ｗｅｔ ｎｂｏ ｉ ｅ ｔ ｇ鉴 ｉ ｒ １基 因
敲 除 的细 胞 株 。 结 果 经过 筛 选 和鉴 定 后 获得 两个 Ｓ ｔ Ｉ一 ｉｌ ／ 阳性 克 隆 ， 功 构 建 Ｈ Ｔ １ ｉｌ 一 胞 系 。结 论 通 过 体 细 胞 敲 ｒ 成 Ｃ １６Ｓｒ 细 ｔ 除技 术 ， 们 成 功 地 获 得 Ｓｒ 我 ｉｌ敲除 肠 癌 细 胞 株 。 ｔ
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关 键 词 体 细 胞 基 因敲 除 同源 重 组 Ｓｒ １ ｉ ｔ
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效 率 比质粒 载体 高 ２ ５倍 。本 研究 拟通 过 Ａ Ｖ介 Ａ 导的 同源重 组技 术 ， 在肠 癌细胞 系 中建立 体细胞 基 因
Ｈ ｃ ｎ 公 司 ； ｕｅｅ转 染 试 剂 购 自 Ｒ ｃｅ 抗 生 素 新 霉 素 ｙｌ ｅ ｏ Ｆ ｇｎ ｏｈ ； （ ４８ Ｇ １ ）购 自 Ｇ Ｂ Ｏ （ ） 他 ： ｉｌ抗 体 购 自 ｐｏｅ ｔｃ ＩＣ 。 ３ 其 Ｓｔ ｒ ｒ ｉ ｅｈ ｔｎ ｇｏｐ公 司 ， 羊 抗 兔 Ｉ Ｂ —ａｔ ｒｕ 山 ｇ Ｇ、 ｃｉ ｎ抗 体 购 自 ｃｌ ｓ ｎｌ ｇ ｅ ｉ ａ ｎ ｌ ｇ ｉ