第四章DNA复制
生物医学概论生化第4章基因信息的传递和表达
5 3
串联重复序列 反向重复序列
3 5
· · · TGTGGATTA-‖-TTATACACA-‖-TTTGGATAA-‖-TTATCCACA
58
66
166
174
201
209
237
245
E. coli复制起始点 oriC
目录
引发体和引物
Dna B、 Dna C Dna A 5 3
引物 酶
进行解链，进行的是单点起始双向复制。
复制中的放射自显影图象
目录
3. 半不连续复制
3
前导链 (leading strand)
5 3
解链方向
后随链 (lagging strand)
5
目录
顺着解链方向生成的子链，复制是连续进行的， 这股链称为前导链(leading strand) 。
另一股链因为复制的方 A C T G G
T C C A T G A C G G T G A C C
C C A C T G G
G G T G A C C
AT GC GC TA AT CG TA GC CG CG AT CG TA GC GC
+
AT GC GC TA AT CG TA GC CG CG AT CG TA GC GC
氢键，使DNA双链解开成为两条单链。
单链DNA结合蛋白(single stranded DNA binding
protein, SSB) ——在复制中维持模板处于单链状
态并保护单链的完整。
目录
复制起始点附近区域的DNA双链解开成为两条单链。
SSB
解链方向 解螺旋酶
目录
DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态、理顺DNA链
第四章 DNA的复制-
• DNA的解链过程，首先在拓扑异构酶I的作 用下解开负超螺旋，并与解链酶共同作 用，在复制起点处解开双链，一旦局部解 开双链，就必须有SSB蛋白来稳定解开的 单链，接着由引发酶等组成的引发体迅速 作用于两条单链DNA。 • 不论是前导链还是滞后链，都需要一段 RNA引物以开始子链DNA合成。
• 冈崎片段与半不连续复制 由于DNA双螺旋的两条是反向平行的，因此在复制 叉附近解开的DNA链一条是5’-3’方向，另一条是 3’-5’方向，决定了前导链的复制是连续的，而滞 后链的复制是不连续的。因此称为DNA的半不连续 复制。 冈崎片段 在DNA不连续复制过程中，沿着后随 链的模板链合成的新DNA片段。随后共价连接成完 整的单链。其长度在真核与原核生物当中存在差 别，真核冈崎片段长度约为100～200核苷酸残 基，而原核为1000～2000核苷酸残基。
末端长度可变
A typical telomere has a simple repeating structure with a G-T-rich strand that extends beyond the C-A-rich strand. The G-tail is generated by a limited degradation of the C-A-rich strand.
The rolling circle replicates DNA
Phage λ
A rolling circle appears as a circular molecule with a linear tail by electron microscopy.
某种蛋白质介入而在真正的末端启动复制
真核细胞中DNA的复制调控
• 真核细胞中DNA复制有3个水平的调控 （1）细胞生活周期水平的调控 即决定细胞停 留在G1期还是S期，许多外部因素和细胞因子 参与限制点的调控。 （2）染色体水平的调控 决定不同染色体或同一 染色体不同部位的复制子按一定的顺序在S期 起始复制 （3）复制子水平调控 决定复制的起始与否
分子生物学：DNA复制
(CsCl gradient centrifuge)
N15
DNA
N14
Semi-Conservation Replication
Source:M. Meselson and F. W. Stahl, Sciences 44:675, 1958.
半半保保留留复复制制-小结
DNA生物合成时，母链DNA解开为两股单链，各自作为 模板(template)按碱基配对规律，合成与模板互补的子链。子代 细胞的DNA，一股单链从亲代完整地接受过来，另一股单链则 完全重新合成。两个子细胞的DNA都和亲代DNA碱基序列一致。 这种复制方式称为半保留复制。
RNA引物的形成
DNA链合成及延长
复制的终止
• RNApol (RNA polymerase)
[Rif S ]
完成对先导链引物的合成
实现DNA复制的转录激活起始
起
• dnaG (primase) [Rif R]
始
完成对后随链引物的合成
较先导链的启动落后一个Okazaki片断
• 完成10±NtRNA引物合成后.
遗传物质的基本属性：基因的自我复制 基因的突变 控制性状的表达
DNA复制
亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下， 分别以每 条 单链DNA分子为模板，聚合与 自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,合 成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代 DNA分子的过程。 主 要 包 括 引 发 、 延 伸 、 终止三个阶段。
复制发动温度敏感突变型（慢停突变） 42℃不能发动DNA复制、但可完成DNA延伸
37 ℃, 5 ci / mM H3-T , 6min
37 ℃, 52 ci / mM H3-T , 6min
DNA的复制(说课稿).
《DNA的复制》说课稿各位老师：大家好，我今天说课的题目是苏教版高中生物必修2第四章第二节”DNA复制”这部分内容，接下来我就从以下几个方面来说说这一节课。
一、说教材1．教材地位和作用《DNA的复制》这一部分内容是第二章的重点内容之一。
DNA分子的结构和复制是遗传学的基本理论。
“DNA的复制”一课时，在联系DNA结构的基础上，进一步阐明DNA通过复制传递遗传信息的功能。
具体内容有：复制的概念、时间、场所、条件、过程、特点、意义。
学好这一课时，对于学生深刻认识遗传的本质是非常重要的。
二、说教学目标1．根据大纲要求和学生的实际，我确定了以下教学目标：（1）知识目标：1、记住DNA复制的概念2、简述DNA复制的过程，并分析、归纳出DNA复制过程的特点。
3、知道DNA复制在遗传上的意义（2）能力目标：１.通过介绍Meselson、stehl的试验，引导学生分析、比较、推理、归纳，培养科学的思维。
2.通过引导学生观察生活中复印和DNA复制的比较，鼓励学生大胆想象、猜测，培养学生自主探索、合作学习、分析问题、解决问题的能力。
（3）情感目标通过分组探究活动，培养学生的协作意识和科学态度。
2．教学重点、难点（1）教学重点：DNA复制的条件、过程及特点。
（2）教学难点：DNA复制的过程，特别是半保留复制。
3．教材处理及课时安排根据教材的重难点以及学生的实际情况，本节内容只安排一个课时。
教学顺序是“推测－实验证据－复制过程”进行。
三、说教法结合教材的特点和学生实际，本课时主要采用启发式教学法，结合直观、比较、讨论、探究等教学方法。
通过教师的引导，从知识的发生过程入手，教师把教材中的科学活动过程充分展开，着重引导学生自己去探索、观察、思考、分析、归纳、总结，使学生在教学活动中初步学会科学研究的一般方法，即发现问题——提出假说——试验验证——得出结论，培养学生的合作、探索的精神，发展学生的思维能力，为学生铺设符合知识规律的思维轨道。
分子生物学 ch4DNA复制
第四章 DNA的复制一、名词解释:1、半保留复制：DNA复制过程中，每个子代DNA分子的一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种方式称为半保留复制2、半不连续复制：DNA复制时，一条链是连续的，另一条链是不连续的，因此称为半不连续复制3、Klenow片段：E.coli DNA pol I是单一肽链的蛋白质，用枯草杆菌蛋白酶水解得到一个N端的小片段和C端大片段。
大片段含有5’→ 3’聚合活性和3’→ 5’外切活性，称为Klenow片段4、复制起始点（ori）：DNA复制起始点是特定的，表现为序列特异性，并有特异性蛋白和酶与之结合，这一特异性序列称为复制起始点5、冈崎片段：DNA滞后链的复制中产生的短片段6、回环模型：DNA双螺旋同时进行复制，在复制叉处滞后链模板形成一个环，以适应双链同时进行复制，这种复制模型称为回环模型7、复制子repicon：DNA分子上一个独立的复制单位8、复制体replisome：有解旋酶、引发酶和DNA pol III全酶组成的复合体，在DNA合成时，沿复制叉方向移动9、自主复制区ARS：酵母的复制起始点称为自主复制区。
10、端粒（telemere）：真核生物染色体DNA的两端是一种重复序列的特殊结构称为端粒11、引发体（primosome）：大肠杆菌DNA复制中，由DnaB解螺旋酶和DnaG引物酶构成复制体的一个基本单位称为引发体二、填空题1.在原核生物和真核生物DNA合成中负责填补空缺的酶分别是DNA聚合酶I和DNA聚合酶ε。
2.染色体中参与复制的活性区呈Y型结构，称为复制叉。
3.在DNA复制和修复过程中修补DNA螺旋上缺口的酶称为DNA连接酶。
4.在DNA复制过程中，连续合成的子链称前导链，另一条非连续合成的子链称为滞后链。
5.原核生物和真核生物中主要负责复制的酶分别是DNA聚合酶III和DNA聚合酶δ。
6.DNA后随链合成的起始要一段短的RNA引物，它是由DNA引发酶以核糖核苷酸为底物合成的，在真核生物中相同功能的酶是DNA聚合酶α。
核酸与蛋白质生物合成
2. DNA 连接酶： 催化DNA双链中缺口处3’-OH与5’-P 之间的磷酸二酯键的形成，从而将两个DNA片段连接 起来。
能量：动物细胞和噬菌体：ATP； P E coli 等细菌：NAD+
G C P P
C G OH P
A T P
T A P
DNA ligase ATP or NAD, Mg++ P
(In 1957)
Meselson and Stahl
DNA Replication is semiconservative Each DNA strand serves as template for the synthesis of a new strand, producing two new DNA molecules, each with one new strand and one old strand. This is semiconservative replication
5’
O HO P OH
O O P OH
O OH
5
A
O
1 3 2
O P O CH2
4
H
OH
OH
O HO P OH
O O P OH
O OH
5
C
O
1 3 2
O P O CH2
4
H
OH
OH
2. 延伸阶段：
3. 终止阶段： DNA模板含有终止转录的部位，称 为终止序列（终止信号），E coli 含有两类终止子。
• PCR反应条件 95℃ 72℃ • PCR过程 • PCR的特点
PCR的基本原理
Taq
• PCR反应条件 72℃ 50℃ 95℃ Taq PCR过程 • • PCR的特点
DNA操作技术
个切割位点。如Bgl II只有6个，BamHI只
有5个，而SalI只有2个，意味着λDNA中
GC含量少于50%。
这种方法只能粗略的估计，只有实验能子（溶液）
酶
缓冲液（一般pH值7.4, 含Mg2+, NaCl, 还原剂如dithiothreitol稳定酶阻止 活）
1.1 核酸酶
作用：降解 磷酸二酯键 分为： 外切酶 内切酶
1.1 核酸酶
Bal 31(来自于细菌Alteromonas espejiana) 单链特异的核酸内切酶活性，
双链特异的内切酶活性。 依赖于Ca2+ 用途： 构建限制酶图谱 产生末端缺失突变 DNA超螺旋线性化
1.1 核酸酶
E. coli外切酶III
识别GATC。也有一些酶识别兼并序
列，如HinfI来自于Haemophilus influenzae品系Rf，识别GANTC，N
代表A, G, T, C。
2.4 限制性内切酶产物
钝端（平端） 粘性末端
粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末 端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成 氢键，所以称为粘性末端。
1.1 核酸酶
RNase H（E. coli）
–降解RNA:DNA杂交分子中 的RNA。
1.2 连接酶
广泛存在于各种生物中，连接3‘端羟基 和5’端磷酸形成磷酸二酯键。在DNA复 制、修复、以及 体外重组
过程中起
重要作用。
1.2 连接酶
T4-DNA连接酶 –连接粘性末端、平端 –修复双链DNA或RNA-DNA杂交
2.2 限制性内切酶分类
限制性核酸内切酶可分为三大类：
– I类 –II类* –III类
高中生物教案DNA复制
高中生物教案DNA复制
一、教学目标
1. 了解DNA的结构和功能；
2. 掌握DNA复制的基本原理和过程；
3. 理解DNA复制的意义和作用。
二、教学重点与难点
1. DNA的结构和功能；
2. DNA复制的过程、原理和重要意义。
三、教学内容
1. DNA的结构和功能；
2. DNA复制的基本过程：合成链、分子复制；
3. DNA复制的重要意义。
四、教学方法
1. 讲授相结合的教学方法；
2. 多媒体辅助教学；
3. 实验演示。
五、教学过程
1. 导入：利用多媒体展示DNA的结构和功能；
2. 讲解DNA复制的基本原理和过程；
3. 展示DNA复制的实验过程；
4. 学生讨论DNA复制的意义和作用；
5. 结束。
六、教学反馈
1. 组织学生进行小组讨论，让学生总结DNA的结构和功能以及DNA复制的过程；
2. 完成相关练习题目，检测学生对DNA复制的掌握情况。
七、教学延伸
1. 练习DNA复制的相关实验操作；
2. 深入学习DNA的进化意义。
八、板书设计
DNA复制
九、教学资源
1. 实验用具和材料；
2. 多媒体设备。
十、教学评估
1. 整体教学效果；
2. 学生的学习情况和表现。
分子生物学教学教案
分子生物学教学教案教案内容：一、教学内容：本节课的教学内容选自人教版《分子生物学》教材，第四章“DNA复制”。
具体内容包括：DNA复制的过程、DNA复制机制、复制起点和复制的酶等。
二、教学目标：1. 让学生了解DNA复制的过程及机制，掌握复制起点和复制的酶的作用。
2. 培养学生运用分子生物学知识解决实际问题的能力。
3. 激发学生对分子生物学的兴趣，培养学生的创新思维。
三、教学难点与重点：难点：DNA复制的过程及机制、复制起点和复制的酶的作用。
重点：DNA复制的过程、复制机制和复制酶的作用。
四、教具与学具准备：教具：多媒体教学设备、黑板、粉笔。
学具：教材、笔记本、彩色笔。
五、教学过程：1. 实践情景引入：以“克隆羊多莉的诞生”为例，引导学生思考DNA复制在生物繁殖中的重要性。
2. 知识点讲解：（1）介绍DNA复制的过程：解旋、合成子链、形成子代DNA分子。
（2）讲解DNA复制机制：半保留复制、双向复制。
（3）阐述复制起点的作用：启动复制、确定复制方向。
（4）介绍复制的酶：DNA聚合酶、解旋酶、连接酶等。
3. 例题讲解：分析DNA复制过程中可能遇到的问题，如复制错误、修复等。
4. 随堂练习：（1）简述DNA复制的过程。
（2）解释DNA复制机制的作用。
（3）列举至少三种复制的酶及其作用。
5. 知识拓展：介绍DNA复制在医学、生物科技领域的应用，如基因治疗、克隆技术等。
六、板书设计：板书DNA复制板书内容：1. 复制过程：解旋、合成子链、形成子代DNA分子2. 复制机制：半保留复制、双向复制3. 复制起点：启动复制、确定复制方向4. 复制酶：DNA聚合酶、解旋酶、连接酶等七、作业设计：1. 简述DNA复制的过程。
答案：DNA复制是指在细胞分裂过程中，DNA分子通过解旋、合成子链、形成子代DNA分子的过程。
2. 解释DNA复制机制的作用。
答案：DNA复制机制的作用是确保遗传信息的准确传递，保证子代细胞的基因组与亲代细胞一致。
第四章 DNA的复制
5′
3′
3′
5′
5′
3′
四、与DNA复制有关的物质
1、原料：dATP、dGTP、dCTP、dTTP
2、模板：DNA的两条链 3、引物：一段RNA(DNA聚合酶不能从头合成DNA) 4、引发酶：合成RNA引物的酶。
问题：为什么需要有RNA引物来引发DNA复 制呢?
提高了DNA复制的准确性。因为DNA复制开 始时掺入的核苷酸往往容易出错，加的RNA 引物可以被切除，不会影响DNA复制的准确 性。
2、复制起始 （1）、DNA复制起点双链解开 ，形成复制叉。
DnaA蛋白在DNA复制的起始中起重要作用 4个9bp的重复序列----- DnaA结合位点
① DnaA蛋白在ATP的作用下与oriC处的4个 9bp保守序列相结合。
3个13bp的重复序列---解链的位点
②DnaA蛋白的结合促进3个13bp重复序列变性, 形成开链；
注意区别切口和缺口？
7、解旋酶：分离双螺旋DNA的两条链 8、单链结合蛋白：稳定DNA的单链状态
9、DNA 拓扑异构酶
DNA双螺旋，在外力作用往紧缠的方向捻 转时，产生的超螺旋为正超螺旋（左手超 螺旋）。
DNA双螺旋在外力作用向松缠的方向捻转时， 产生的超螺旋为负超螺旋（右手超螺旋）。
负超螺旋有利于双螺旋解旋。生物体内负超螺 旋稳定在5%左右。
2、端粒的作用
（1）稳定染色体末端结构； （2）防止染色体末端融合； （3）避免遗传信息在复制过程中丢失。
端粒和端粒酶：2009年诺贝尔奖
卡罗尔·格雷德 杰克·绍斯塔克 伊丽莎白·布兰克本
（端粒酶） （端粒的作用）
（端粒）
3、端粒酶
1）定义：端粒酶是自身携带RNA 模板的逆转录酶。
第四章DNA复制
4. DNA ligase： 连接冈崎片断。
4: 终止与分离 Termination and Segregation
终止
•引起终止的序列称为终止位点（ter site） 两个复制叉在Ori C 约1800的对面相遇 •Tus 蛋白: 终止位点结合蛋白， 可阻止Dna B解旋
大肠杆菌复制终点定位偏 离复制叉实际相遇点
• 就DNA复制而言，引物酶（dna G基因产物）合成RNA 链，它提供引发末端
DNA聚合酶需要3‘－OH 端来起始复制
有多种方法可以提供DNA聚合酶起始DNA合成的3‘OH端
大肠杆菌中发现的两类引发反应：
引发需要解旋酶、SSB和引物酶
1、ori C系统
2、ØX系统: 引发体（primosome）
Segregation
•拓扑异构酶IV（Topoisomerase IV）:
一种II型拓扑异构酶，功能是使子链
分离，DNA分配到两个子细胞中。
第四节
真核生物DNA的复制
离体实验体系 起始 端粒的复制
1: 离体实验体系
• 酵母（Sacharomyces cervisiae) • 猿猴病毒40（SV40） • 非洲爪蟾（Xenopus laevis）的卵中提出的无 细胞提取物
5 大肠杆菌DNA聚合酶(DNA Polymerase)
硫氧还蛋白 拇指
DNA聚合酶的一般结构 “右手”结构： 拇指（thumb） 手指（finger） 手掌（palm）
手指
扭曲的ＤＮＡ
DNA位于手掌上 由拇指和手指形 成的槽中
噬菌体T7 DNA聚合酶与 DNA复合体的晶体结构
核酸外切酶结构域 拇指结构域：与DNA结 合并在前进中起重要作 用
人教版必修二第四章DNA复制、转录、翻译默写
默写 班级 姓名1、DNA 的结构特点：由两条脱氧核苷酸链按 反向平行 方式盘旋而成的规则的 双螺旋 结构。
由 磷酸 和 脱氧核糖 连接，形成两条链上的碱基通过 氢 键形成 碱基对 ，即 A —T (氢键有 2 个)， G —C (氢键有 3 个)。
2、DNA 复制 时期： 有丝分裂间期或者减数分裂间期 。
场所： 细胞核 (主要)。
（另外：线粒体和叶绿体中）．模板：DNA 分子的 两条DNA 链 。
．原料：游离的 脱氧核糖核苷酸 。
．能量： ATP 。
．酶： DNA 解旋酶、DNA 聚合酶 等。
3、 由于DNA 的复制为半保留复制，因此可推出一个DNA 分子复制n 次后的以下数量关系： ．DNA 分子数子代DNA 分子数= 2n 个。
含有亲代DNA 链的子代DNA 分子数= 2 个。
不含亲代DNA 链的子代DNA 分子数= 2n -1 个。
．脱氧核苷酸链数子代DNA 分子中脱氧核苷酸链数= 2n 条。
亲代脱氧核苷酸链数= 2 条。
新合成的脱氧核苷酸链数= 2n-1 条。
．消耗的脱氧核苷酸数若一亲代DNA 分子含有某种脱氧核苷酸m 个，则：经过n 次复制需要消耗该脱氧核苷酸 m(2n -1) 个。
在第n 次复制时，需消耗游离的该脱氧核苷酸 m2 n-1 个。
4．基因：DNA 分子上具有 遗传效应 的片段，基因的表达通过 转录和翻译 来实现。
5．遗传信息的转录(1)概念：在 细胞核 中，以 DNA 为模板，按 碱基互补配对 原则，合成 mRNA 的过程。
(2)场所： 主要在 细胞核 ，少量在线粒体、叶绿体中(3)产物： RNA ，有3种类型：① 信使RNA (mRNA)② 核糖体RNA (rRNA)；③ 转运RNA (tRNA)(4)条件：模板：DNA 的一条链 原料： 脱氧核糖核苷酸 能量： A TP 酶： DNA 解旋酶 和RNA 聚合酶(5)遗传信息传递： DNA → mRNA 。
6．遗传信息的翻译(1)概念：游离在细胞质中的 氨基酸 ，以 mRNA 为模板合成具有一定 氨基酸 顺序的 蛋白质 的过程。
DNA复制
DNA复制，即DNA生物合成，是以碱基互补为基础的一个严格的脱氧核苷酸分子逻辑组合的过程，对真核细胞来说，它发生在细胞周期的S期。
揭示DNA复制的奥秘，起初是从原核细胞开始的，从中积累了丰富的实验依据，发现DNA复制的规律。
随后的研究进一步证明，真核生物DNA复制的过程与原核生物基本相似。
因此，本节主要叙述的是原核生物DNA复制过程。
DNA复制基本上可分为解链、引发、延长及终止四个阶段。
一、DNA复制的一般特点1.DNA的双螺旋的两条链在局部需要解开,以利于每条链作模板。
2. DNA的局部解旋引起周围区域过度缠绕, 拓朴异构酶使超螺张力释放.3.DNA聚合酶以5`到3`方向合成。
DNA的两条链方向相反，因此，,一条链的合成是连续的，而另一条链的合成则是不连续的。
不连续链每个片段的合成都是独立进行的，然后各片段再连接起来。
4. DNA复制必须高度精确, DNA复制错误率大约是1/1010,校正机制保证新合成的NA的正确性。
5. DNA的合成必须非常迅速, 其合成速度与基因组的大小及细胞分裂速度有关。
6. 复制器本身不能复制线性DNA的末端,一种特殊的端粒酶参与端粒的复制。
二、复制的起始DNA复制的起始阶段，由下列两步构成。
（一）预引发：1．解旋解链，形成复制叉由拓扑异构酶和解链酶作用，使DNA的超螺旋及双螺旋结构解开，碱基间氢键断裂，形成两条单链DNA。
单链DNA结合蛋白（SSB）结合在两条单链DNA上，形成复制叉。
图10-21 复制叉的三维作用结构（二）引发体组装：由蛋白因子（如dnaB等）识别复制起始点，并与其他蛋白因子以及引物酶一起组装形成引发体。
图10-22 引发体形成1.dnaA结合于复制起始点（oric）2.dnaA与DNA形成复合物引起DNA的解链3.dnaA在dnaC的辅助下推动DNA双链解开三、复制的延长（一）聚合子代DNA：1. 需要引物参与DNA复制的DNA聚合酶，必须以一段具有3’端自由羟基（3’-OH）的RNA 作为引物(primer) ，才能开始聚合子代DNA链。
分子生物学电子教案第四章
第四章DNA的复制第四章DNA复制(DNA Replication)1．主要内容1) DNA复制概览2) 细菌DNA复制3) 真核DNA复制2．教学要求1) 掌握原核生物和真核生物DNA的复制特点2) 熟悉原核生物和真核生物DNA复制的酶系统第一节DNA复制概述第二节DNA复制的酶学第三节原核生物DNA复制第四节真核生物DNA复制第一节DNA复制概述(DNA Replication: An Overview)一、基本概念二、DNA的半保留复制三、复制起点、方式和方向四、DNA复制的半不连续性一、基本概念复制子(Replicon，复制单位或复制元)οDNA中含有一定复制起点和复制终点的复制单位。
1.3万— 90万不等A unit of the genome in which DNA contain a region from origin to terminator复制体(Replisome)：复制叉处的许多酶和蛋白组成的复合体，协同动作合成DNA。
οThe multiο protein (30±) structure that assembles at replicating fork to undertake synthesis of DNA 二、DNA的半保留复制（Semi-Conservation Replication）CsCl (Cesium chloride) density gradient ultracentrifugation（CsCl密度梯度超离心）Labeled E.Coli DNA with 15N 14Nο三、复制起点、方向和方式• All prokaryotic chromosomes and many bacteriophage and viral DNA molecules are circles and comprise single replications. （单复制子）1、复制起点（origin，ori 或O，复制原点）复制开始处DNA分子的特定位置原核生物（Prokaryote）：单复制起点，即——整个染色体只有一个复制单位真核生物（Eukaryote）：多复制起点，即－－一个genome中有多个复制单位2、复制方向（复制过程的顺序性）复制叉（Replication fork）：染色体中参与复制的活性区域，即复制正在发生的位点复制眼（replication eye）：电子显微镜下观察正在复制的DNA，复制的区域形如一只眼睛真核生物的多复制子多个复制眼（1）单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉（2）复制的多模式单起点、单方向（原核）多起点、单方向（真核）单起点、双方向(原核)多起点、双方向（真核）3、复制方式（1）从新起始（de novo initiation ）或复制叉式（replication fork ）（2）置换式（Displacement form）又称D 环复制（3）共价延伸方式（covalence elongation）或滚环式复制（rolling circle replication）DNA复制方式（1）从新起始（de novo initiation ）或复制叉式（replication fork ）或θ 复制A replication eye forms a theta structure in circular DNA.（2）置换式Displacement form ，又称D 环复制线粒体和叶绿体DNA的复制方式（3）共价延伸方式（covalence elongation）或滚环式复制（rolling circle replication）由于复制时产生的滚环结构形状象ζ，又称ζ复制病毒、细菌因子四、DNA复制的半不连续性（Semi-Discontinuous Replication）复制方向的问题：冈崎片段（Okazaki fragment）1968年冈崎（Reiji Okazaki）设计了两组实验，其一是脉冲标记实验（pilse－labeling experiment）。
《现代分子生物学》第四章 1 DNA 复制
参与复制的DNA分子上 有两个区域，未复制的 区域由亲代DNA组成， 已复制的区域由两条子 代链组成。复制正在发 生的位点叫做复制叉 （replication fork）或 生长点（growing point）。
Origins can be mapped by autoradiography and electrophoresis Replicated DNA is seen as a replication eye flanked by nonreplicated DNA.
二、DNA聚合酶（包括DNA复制酶及参与复
制的附属反应或损伤DNA的修复合成）
1 大肠杆菌的DNA聚合酶 大肠杆菌中发现了三种DNA聚合酶：DNA聚合 酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅱ、DNA聚合酶Ⅲ。 DNA聚合酶Ⅰ参与损伤DNA的修复，并在半保 留复制中起切除RNA引物的作用。 DNA聚合酶Ⅱ也参与修复。 DNA聚合酶Ⅲ是一个多亚基的蛋白质，是合成 DNA新链的主要复制酶。
Semi-conservative mechanism
15N
labeled DNA
15N
labeling experiment
1. 2. 3. 4.
15N
labeling: grow cells in ?? Collect DNA: grow cells in ?? Separation: method ?? Result interpretation
第四章
DNA 复制
DNA的复制（replication）是指以原来的DNA分 子为模板合成出相同的DNA分子的过程。
遗传信息通过亲代DNA分子的复制传递给子代。 DNA复制在保持生物物种遗传的稳定性方面起 着重要的作用。
第四章 DNA的复制(简)
α ：130 K(polC 即 dna E)— DNA 合成 ε ：25K(dnaθ ) —3'－5'外切酶活性,校对 θ ：10K—使核心酶相互连接。
τ ：71K(dna ZX) —使核心酶形成二聚体，与模板连接。具有 ATP 活性。 δ ：32K EF Ⅲ, 催化β 亚基转移到模板链上。 EFⅡ γ ：52K(dna ZX) 催化β 亚基转移到模板链上。 δ ' ：35K χ ：15K ψ ：12K
聚合酶III 核心酶
-夹子 -聚体 -夹子 RNA引物
滞后链
聚合酶I
前导链
原核生物复制起始的相关蛋白质
蛋白质（基因） DnaA (dnaA) DnaB (dnaB) DnaC (dnaC) DnaG (dnaG) SSB 拓扑异构酶 (gyrA, B) 引物酶 单链DNA 结合蛋白 解螺旋酶 通用名 功能 辨认起始点 解开DNA双链 运送和协同DnaB 催化RNA引物生成 稳定已解开的单链 理顺DNA链
图 11-22 DNA 聚合酶Ⅰ的内切酸活性 (仿 D.Freifelder: 《MOLECULAR BIOLOGY》 1983,Fig.8-20)
A：DNA-pol的外切酶活性切除错配碱基；并用 其聚合活性掺入正确配对的底物。 B：碱基配对正确， DNA-pol不表现活性。
DNA-pol Ⅱ
• DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。
（一）预引发体的形成
• 1. DnaA结合在9bp处
• 2. 20-40个DnaA聚合在一起形成核心 • 3. DnaA作用于13bp处 • 4. DnaB/DnaC结合在13bp处 DnaB六聚体与6个DnaC结合
需ATP
（二）复制复合物的改型
DNA的复制123
拓朴异构酶I 首先在大肠杆菌中发现，过 去称为ω-蛋白，分子量为 110000，一条肽链，它可切 断DNA一条链，增加一个螺 旋，再接起来，所以它可消 除负超螺旋，也可增加正超 螺旋，不需供给能量。
拓扑异构酶 I 的功能
（1）双链DNA超螺旋与松弛态的相互转换
（2）单链结状DNA和环状无结状DNA的相互转换
线粒体DNA 的复制
复制的主要 酶，与先导 链合成有关
2. 引物酶（primase） 功能：以DNA为模板，催化合成一小段 与DNA互补的RNA ，即引物。引物：10—60个核苷酸
• 引物酶本身无活性，只有与另外6种蛋白质结合为引发体 （primosome）才可催化引物的合成。
• dnaB是六聚体。在ATP、Mg2+存在时可与6个dnaC结合成复合 体。此复合物在i-蛋白协助下与结合在单链DNA上的n、n’、n”组 成引发前体。引发前体再与引物酶结合则形成引发体。
亚基
分子量（kD） 基因
组装层次
α
130
dnaE
ε
27.5
dnaQ
θ
10
τ*
71
dnaX
γ*
47.5
dnaX
δ
35
33
Pol III Pol III’
χ
15
ψ
12
β
40.6
dnaN
Pol III* Pol III全酶
DNA聚合酶的一般 结构
“右手”结构： 拇指（thumb） 手指（finger） 手掌（palm）
亚基数 M.W 聚合作用 连续聚合作用 聚合速度(N/s) 5′－3 ′外切酶 3′－5 ′外切酶
功能
第四章 DNA的复制
第四章DNA的复制第一节DNA复制的特点一、DNA的半保留复制DNA复制的可能机制：全保留复制散布式复制半保留复制二、复制的起点（Orient）复制起点或复制原点，常用Ori或O表示。
复制起点的结构（以E.coli为例）1、框架结构(Frame structure)间隔序列变化大，识别序列较保守2、有一系列的反向重复序列（回文结构），故易形成高级结构3、有4个9bp的重复序列—“dna盒”较保守，TTATNCANA，是OriC复制起始时dnaA蛋白的特异结合位点。
4、有3个13bp的重复序列GATCTNTTNTTTT，dnaA蛋白结合位点，DNA融化解链。
5、有11个GA*TC序列A的甲基化是必须的，若缺失，则复制功能受影响复制起点的功能复制的起动（主要功能）控制复制（有些参与）A、控制拷贝数B、控制复制周期C、控制复制方向三、复制的方向双向等速复制：E.coli、酵母、果蝇、哺乳动物单向复制：动物线粒体不对称复制：枯草杆菌DNA复制子：生物体的单个复制单位，包含一个复制原点，也可能包括一个复制终点。
通常，细菌、病毒和线粒体DNA都只含有一个复制子，而真核基因组含有多个复制子。
四、DNA复制的方式1、复制叉式、“复制叉”、“复制眼”2、θ型复制(Cairns复制)1963年Cairns提出。
E.coli DNA的复制为θ型复制。
3、滚环型复制λ噬菌体：产生多联体尾巴ΦX174：成环滚环型复制4、D环型复制线粒体和叶绿体的环状DNA第二节DNA复制有关的酶和蛋白质一、原核DNA聚合酶的种类DNA聚合酶I（DNA pol I）DNA聚合酶II（DNA pol II）二、DNA pol I的性质DNA pol I分子量为109kd，约1000个残基，由polA基因编码。
用枯草杆菌蛋白酶处理DNA pol I，可获得两个片段。
大片段分子量为76kd，具有5'-3'聚合酶活性和3' -5'外切酶活性，被称为Klenow片段。
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DNA的生物合成
基础医学院生化教研室 柳春
【目的要求】
★遗传信息传递的中心法则，复制、半保留复制、
复制子的基本概念，参与DNA生物合成的主要物质
及其作用 ▲原核生物DNA复制的的基本过程，逆转录的基本过 程，基因突变的类型和修复方式 ● DNA重组，真核生物染色体DNA复制的特点，端粒
和端粒酶概念及其意义
2.滚环复制
切断闭环双链DNA的一股，形成一个3’端，由DNA聚合酶
催化，以未切开的一股DNA作为模板，合成新的DNA。随着3’
端不断延伸，5’端不断甩出，环状DNA模板好像在滚动一样， 所以这种复制方式称为滚环复制。
3.D环复制
线粒体DNA复制时先以一股链作为模板指导合成新链， 且只朝一个方向进行。当新链的合成进行到全环的2／3时， 另一股链的复制起点才暴露出来，开始合成另一股新链。这 种复制的前期是以新链替换原链的过程，且原链的游离结构 形如字母D，所以这种复制方式称为D环复制。
二、复制过程
1. 复制起始
大肠杆菌DNA复制的起始点oriC
参与大肠杆菌DNA复制起始的酶和蛋白质
作用：在复制起始点解链，组装前引发复合物。
①约20个DnaA· ATP复合物结合于9bp 重复序列上，由DNA缠绕形成复合物 ②类组蛋白HU与DNA结合，使13bp重 复序列解链，成为开放复合物
⑵ Ⅱ型拓扑异构酶（拓扑异构酶Ⅱ和拓扑异构酶Ⅳ）
催化DNA的 两股链同时发 生断裂和再连 接，既可以消 除负超螺旋， 也引入负超螺 旋，需ATP供 给能量。Ⅱ型 拓扑异构酶参 与DNA的复制 合成。
（三）引物酶
DNA复制需要RNA引物，RNA引物由引物酶催 化合成。 大肠杆菌的引物酶是DnaG，DnaG单独存在时 相当不活泼。当开始解链时，DnaG与解旋酶结合， 组成引发体。在模板的—定部位合成引物，合成 方向是5’3’。
框移ment)
1.错配 DNA分子上的碱基错配又称点突变(point mutation)
1. 转换
发生在同型碱基之间，即嘌呤代替另 一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。
2. 颠换 发生在异型碱基之间，即嘌呤变嘧啶
或嘧啶变嘌呤。
错义突变：一个氨基酸密码子被另一个氨基酸密码子取代 无义突变：一个氨基酸密码子变为终止密码 同一突变：同义密码子的转变
典型重组模型 Holliday 模型
双股断裂修复模型
⒈ Holliday模型
⒉ 双股断裂修复模型
二、位点特异性重组（site-specific recombination)
概念 位点特异性重组是由重组酶催化，在两个DNA 序列的特异位点间发生的整合。 效应 基因表达的调控、胚胎发育过程中的程序性基因 重排、一些病毒和质粒DNA复制周期中发生的整合 与分离等。
第二节
原核生物DNA的复制
一、参与DNA复制的酶和蛋白质
DNA聚合酶 解旋酶 拓扑异构酶 引物酶 DNA连接酶
（一）DNA聚合酶
DNA聚合酶的作用是催化DNA合成，其活性需要 Mg2+的存在。
DNA聚合酶具有多种活性： 1.5'→3'聚合酶活性与延伸能力 2.3'→5'外切酶活性与校对功能 3.5'→3'外切酶活性与切口平移
TTTTGGGGTTTTGGGG…
功能
• 维持染色体的稳定性
• 维持DNA复制的完整性
•端粒酶
组成 • 端粒酶RNA (human telomerase RNA, hTR) • 端粒酶协同蛋白(human telomerase associated
protein 1, hTP1)
• 端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse
transcriptase, hTRT)
端粒酶的催 化延长作用
爬 行 模 型
DNA聚合酶复制子链
进一步加工
第四节
概念
DNA重组
DNA分子内或分子间发生遗传信息的重新组合，
称为DNA重组(DNA recombination)。 方式 同源重组：发生于两个同源序列之间 位点特异性重组：发生于特定的DNA序列之间 DNA转座：是某些DNA片段的移位
⒈ 位点特异性重组的机制
噬菌体与大肠杆菌DNA的整合过程
⒉ 位点特异性重组的效应
插入、缺失、倒位
三、DNA转座（transposon）
DNA片段移位的现象称为DNA转座。
DNA转座与基因表达调控有关
种类
简单转座子
复合转座子
⑴ 简单转座子 又称插入序列，
由转座酶基因
和两端的反向
重复序列构成。
（四）连接酶
环状DNA或冈崎片段合成之后都留下切口，需要DNA连接 酶催化切口处的5’-磷酸基与3’-羟基连接形成磷酸二酯键。 原核生物由NAD供给能量，真核生物则由ATP供给能量。
连接酶的功能： •DNA连接酶在复制中起最后接合缺口的作用。 •在DNA修复、重组及剪接中也起缝合缺口作用。 •也是基因工程的重要工具酶之一。
E.Coli的DNA聚合酶有3种
⒈ 5'→3'聚合酶活性与延伸能力
⒉ 3'→5'外切酶活性与校对功能
⒊ 5'→3'外切酶 活性与切口平移
切口平移的意义
• DNA复制中切除引物并填 补缺口。
• 在DNA修复中发挥作用。
• 在基因操作中制备探针等。
大肠杆菌DNA聚合酶
DNA-pol Ⅰ （109kD）
功能：对复制中的错误进行校读，对复制和 修复中出现的空隙进行填补。
N端
DNA-pol Ⅰ 木瓜蛋白酶
C端
小片段
323个氨基酸 5 核酸外切酶活性
大片段/Klenow 片段
604个氨基酸 DNA聚合酶活性 5 核酸外切酶活性
•Klenow片段是实验室合成DNA，进行 分子生物学研究中常用的工具酶。
DNA-pol Ⅱ（120kD）
• DNA-pol II基因发生突变，细菌依然能存活。
• 它参与DNA损伤的应急状态修复。
DNA-pol Ⅲ
(250kD)
功能 是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。
（二）解链、解旋酶类
1.DNA解链酶 解开DNA双链，需ATP供能。大肠杆菌至少有四 种解链酶：Rep、Ⅱ、Ⅲ和DnaB等。只有DnaB参加 DNA复制。 2.单链DNA结合蛋白 能与被解链酶解开的DNA单链结合，从而稳定 解开的单链DNA，阻抑其重新形成双链，抗核酸酶 降解。
起 始 过 程
③解旋酶在DnaC蛋白的协助下与开放区 域结合，沿随后链模板5’3’方向移动， 形成复制叉结构。SSB与单链DNA结合， 拓扑异构酶Ⅱ消除因解链而产生的拓扑 张力。
⒉ 复制延长
前 导 链 和 后 随 链 的 合 成
前 导 链 和 后 随 链 的 协 同 合 成
DNA复制过程中的双重校对
中心法则
第一节
概念
DNA复制的基本特征
以亲代DNA为模板，合成碱基序列与其完全
相同的子代DNA分子，从而将遗传信息准确地传 递给子代DNA分子，这一过程称为DNA复制(DNA replication)。
基本特征
• 半保留复制
• 从复制起点双向复制
• 半不连续复制
• 复制方式 ：复制 、滚环复制 、D环复制
5’3’聚合酶活性的选择作用
错误率为10-4-10-5
3’5’外切酶活性的校对作用
错误率降低至10-6—lO-8 。
3.复制终止
大肠杆菌闭环双链DNA的两个复制叉向前推进， 最后在终止区相遇并完成复制。
大肠杆菌DNA的终止区
终止蛋白Tus 特异性地识别 并结合终止序 列Ter的共有序 列GTGTGGTGT， 阻止解旋酶解 链，从而阻抑 复制叉推进。
缺失C
3.重排 基因组DNA分子发生较大片段的交换，但 不涉及遗传物质的丢失或获得
由基因重排引起的两种地中海贫血基因型
⒋ 共价连接
二、引起损伤的因素
复制错误
自发性损伤
物理因素 化学因素 生物因素
UV
亚硝酸盐致突变机制
二、DNA修复
修复(repair) 是对已发生分子改变的补偿措施，使其回复 为原有的天然状态。 修复的主要类型
碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传
信息，体现了遗传的保守性。
遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础， 但不是绝对的。
二、从复制起点双向复制
绝大多数生物的DNA复制都是双向复制。
原核生物
真核生物
Ori 5’ 3’ Ori Ori Ori
5’ 3’
三、半不连续复制
• 合成方向与其模板的解链方向一致，可连续合成 的链称为前导链。
生物学意义
• 参与DNA复制
• 参与DNA修复 • 参与基因表达调控 • 在真核细胞分裂时促进染色体正确分离 • 维持遗传多样性
• 在胚胎发育过程中实现程序性基因重排
一、同源重组 (homologous recombination)
概念
同源重组是指通过DNA同源序列进行的片段交换。
真核生物同源染色体的交换属于同源重组。
第三节
真核生物DNA的复制
⒈ DNA聚合酶
⒉ 参与复制的其他因子
复制起点识别复合物 需要CDC6、CDT1、MCM2和MCM7等蛋白因子
真核生物也有I、Ⅱ型拓扑异构酶
真核生物的SSB称为复制蛋白A
⒊ 端粒与复制终止
• 端粒 指真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。 结构特点 • 由末端单链DNA序列和蛋白质构成。 • 末端DNA序列是多次重复的富含G、T碱基 的短序列。
• 突变导致死亡