离子交换柱层析操作(包涵体蛋白)
蛋白纯化过柱具体步骤
蛋白纯化过柱具体步骤
《蛋白纯化过柱具体步骤》
蛋白纯化是生物化学研究中常见的实验技术，通过离子交换柱、亲和层析柱等手段，可以从复杂的混合物中分离纯化目标蛋白。
下面将介绍蛋白纯化过程中的具体步骤。
1. 条件优化
在开始纯化前，重要的第一步是优化实验条件。
这包括确定最佳的缓冲液、pH值、离子浓度和温度等。
这些条件将直接影响到纯化效果和目标蛋白的稳定性。
2. 准备离子交换柱
将离子交换树脂填充到柱中，并将其与离子交换缓冲液预先平衡。
离子交换柱具有吸附和解吸离子的能力，可以根据目标蛋白的特异性选择合适的树脂。
3. 样品负载
将混合物样品加入到经过预平衡的离子交换柱中。
样品中的蛋白将与柱中的树脂发生特定的吸附作用。
4. 柱洗脱
通过逐渐提高离子浓度或使用梯度洗脱缓冲液，将非特异性吸附的杂质从离子交换柱中洗脱。
目标蛋白则因为与柱上树脂的相互作用更强而保留在柱上。
5. 目标蛋白洗脱
选择合适的洗脱缓冲液，通过改变pH值、离子浓度或加入竞争性吸附剂等方法，将目标蛋白从离子交换柱上洗脱下来。
洗脱后的蛋白溶液即为纯化后的目标蛋白。
6. 纯化后处理
对纯化后的目标蛋白进行鉴定和定量分析。
可以使用SDS-PAGE或Western blot等技术来确定纯化效果和蛋白的纯度。
以上就是蛋白纯化过柱的具体步骤。
通过这一系列步骤的操作，可以从复杂的混合物中分离纯化目标蛋白，为后续的生物学研究提供纯净的蛋白样品。
离子交换层析原理步骤详细
离子交换层析原理步骤详细离子交换层析 (Ion Exchange Chromatography, IEC) 是一种常见的分离和纯化技术，广泛应用于生物科学、医药、环境和化学工业等领域。
本文将详细介绍离子交换层析的原理和步骤，并提供相关操作注意事项。
原理离子交换层析是基于离子交换剂与待分离物中的离子之间的相互作用来实现分离纯化的。
离子交换剂通常是一种带有功能基团的固体材料，如离子交换树脂。
当待分离物溶液通过离子交换层析柱时，待分离物中的离子与离子交换剂上的功能基团发生相互作用，使得不同离子具有不同的保留时间，进而实现分离纯化。
离子交换层析可以通过两种模式进行操作：阳离子交换和阴离子交换。
在阳离子交换中，离子交换剂具有负电荷的功能基团，可以吸附带有正电荷的离子，而排斥带有负电荷的离子。
在阴离子交换中，离子交换剂具有正电荷的功能基团，可以吸附带有负电荷的离子，而排斥带有正电荷的离子。
步骤离子交换层析通常包括以下几个步骤：1. 样品预处理在进行离子交换层析之前，需要对待分离样品进行预处理。
这包括将待分离物从其他成分中纯化或富集，并调整其pH值和离子浓度。
2. 选择合适的离子交换剂根据待分离物中的离子类型和性质，选择合适的离子交换剂。
如果待分离物中的离子是带正电荷的，则选择阴离子交换剂；如果待分离物中的离子是带负电荷的，则选择阳离子交换剂。
此外，还需要考虑离子交换剂的大小、形状、孔径和稳定性等因素。
3. 准备离子交换柱将选择的离子交换剂装填到离子交换柱中。
通常，离子交换剂以干燥的形式存在，因此在装填离子交换柱之前需将其充分湿润或反应活化。
4. 样品加载将经过预处理的待分离样品加载到离子交换柱中。
样品溶液会在离子交换柱中与交换剂的功能基团发生相互作用，从而实现分离纯化。
5. 洗脱通过改变洗脱缓冲液的条件，如改变pH值或离子浓度，来洗脱已经吸附在离子交换柱上的离子。
洗脱的条件需要根据待分离物和交换剂之间的相互作用来进行调节。
离子交换层析柱和填料选择指南
平衡 1M
样品 上样体积
梯度洗脱
不结合的分子在 梯度开始前被洗脱
[NaCl]
10–20 CV
5–10 CV 0
柱体积（CV）
图1.使用梯度洗脱的典型IEX分离。
洗涤 高盐洗涤
5 CV
再平衡
紧密结合 的分子在 高盐洗涤 中被洗脱
5–10 CV
蛋白质由含有可以被测定的弱酸和弱碱基团（即电离 基团）。因此，蛋白质的净表面电荷是高度依赖的p H，并将随着环境pH变化而逐渐改变。每种蛋白质都 有其针对pH的独特静电荷关系，这可以被视为滴定 曲线（图2）。这条曲线反映了蛋白质整体净电荷如 何根据环境的pH变化。可以在不同的pH值下利用IEX 以分离具有截然不同电荷性质的多种蛋白。图2显示 如何选择正确的pH（实现令人满意的分最重要参数 之一）。
清洗程序，方案1
用4 CV达到70%的乙醇或30%的异丙醇洗涤。 用至少2 CV的蒸馏水冲洗，直到紫外基线和洗 脱pH稳定。 立即用3 CV的起始缓冲液洗涤（流速与步骤2相 同）。
清洗程序，方案2
用2 CV含有去垢剂的碱或酸溶液洗涤（例如含有 0.1–0.5%非离子型去垢剂的0.1 M乙酸）。 用5 CV 70%乙醇冲洗以去除残留的去垢剂。 用至少2 CV的蒸馏水冲洗（流速与步骤1相同）， 直到紫外基线和洗脱pH稳定。 用3 CV的起始缓冲液洗涤（流速与步骤1相同）。
用于阳离子交换层析的缓冲液
pH间隔
物质
1.4-2.4 2.6-3.6 2.6-3.6 3.3-4.3 3.3-4.3 3.7-4.7 5.1-6.1 4.3-5.3 5.2-6.2 5.6-6.5 6.7-7.7 7.0-8.0 7.8-8.8
马来酸 甲基马来酸 柠檬酸 乳酸 甲酸 琥珀酸 琥珀酸 乙酸 甲基马来酸 MES 磷酸盐 HEPES BICINE
离子交换柱层析操作
离子交换柱层析操作离子交换柱层析在生物分离和纯化中广泛应用，包括蛋白质分离和纯化。
蛋白质通常具有带电的氨基酸残基，可以与柱子上的离子交换基团发生静电相互作用。
在离子交换柱层析中，通过调节溶液的pH值和离子浓度，可以控制蛋白质与柱子上的离子交换基团之间的相互作用，从而实现蛋白质的选择性吸附和洗脱。
1.离子交换柱的选择：根据所要分离的目标分子的特性选择合适的离子交换柱。
离子交换柱可以根据其固定相的性质分为阴离子交换柱和阳离子交换柱，根据离子交换基团的类型分为疏水基团和孔隙基团等。
2.样品预处理：将待分离的样品进行预处理，包括清除杂质、富集目标分子等步骤，以获得较高的纯度和回收率。
3.样品加载：将预处理过的样品溶液加载到离子交换柱上。
样品溶液中的目标分子与离子交换基团之间发生静电相互作用，被柱子上的固定相吸附。
4.柱洗脱：通过调节洗脱缓冲液的pH值、离子浓度或盐浓度等条件，改变目标分子与离子交换基团之间的相互作用，使其从柱子上洗脱下来。
5.纯化目标分子：将洗脱得到的目标分子进一步纯化和收集，可以通过再次进行柱层析、凝胶过滤、电泳等方法进行。
离子交换柱层析操作对于蛋白质的纯化十分重要。
在蛋白质纯化中，可以根据蛋白质的等电点和溶液的pH值选择合适的离子交换柱，实现对特定蛋白质的选择性吸附和洗脱。
通过优化离子交换柱层析操作的条件，可以获得较高纯度和产量的蛋白质。
总结起来，离子交换柱层析操作是一种常用的用于生物分离和纯化的方法。
它利用样品中带电的离子与柱子上的离子交换基团之间的相互作用，实现对生物分子的选择性吸附和洗脱。
离子交换柱层析对于蛋白质的纯化具有重要意义，可以通过调节柱层析条件实现对特定蛋白质的纯化和富集。
离子交换柱层析操作是一种非常有用和广泛应用的生物分离技术。
生化分析实验课离子交换柱层析法
洗脱原理 图
A 280 nm A 280 nm
2
蛋白质分离效果图
1.5
1
0.5
0
0
2
4
6
8 10 12
时间(min)
-0.5
2
1.5
1
0.5
0 0
-0.5
蛋白质分离效果图
5
10
15
20
时间(min)
2、目的与要求
希望通过本次实验要求我们的同学能够了解离子交换柱层析中是如何装 柱、平衡、上样、洗涤、洗脱、收集、测定等柱层析技术的概念和要点。
1.5 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
100℃保温25min，冷却至室温
60％乙醇溶液 A570nm
3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0
友情提醒
• （1）、在装柱的同时应接通各仪器电源进行预热，并按要求不 断调试各仪器（如恒流泵的流速、自动部分收集器的时 间设定）。
• （2）、在开始上样之前，必须事先启动部分收集器、并开始进 行收集。
• （3）、在上样和洗涤阶段利用手动方式进行收集，洗涤结束 后，加洗脱液进行洗脱时，当收集管达到所需体积
离子交换柱层析法
一、实验原理与目的要求
1、 实验原理
我们今天所用的阳离子交换剂（树脂）；它的本质其实就是一类高 分子物质。这类高分子物质的一个明显的特点就是，它含有一些可以解离 的基团，例如–SO3H；–COOH等，而这些解离基团可以和溶液中的离子 产生 交换反应。
离子交换柱层析操作
离子交换柱层析操作规程（可溶性蛋白）1.装柱：1.1 取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子；1.2用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水；1.3取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱，1.4用去离子水冲洗填料5个柱体积；2.柱的平衡与上样：2.1用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱，直至流出液的pH为7.6；2.2对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合；3洗杂蛋白：3.1用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.3用含20mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.4用含40mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含40mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.5用含60mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含60mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.6用含80mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含80mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）4解离目的蛋白：4.1用含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.2 用含200mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含200mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.3 用含500mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含500mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.4用含1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul 做SDS-PAGE检测；（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）5.柱的清洗与保存：5.1用含1000mMNaCL的TB bufferA缓冲液（PH7.6）以冲洗层析柱，共冲洗30ml；5.2用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml；5.3用过滤去离子水冲洗50ml；5.4用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。
蛋白质凝胶层析柱的洗脱顺序
蛋白质凝胶层析柱的洗脱顺序蛋白质凝胶层析是一种常用的蛋白质分离纯化技术，其原理是利用凝胶层析柱中的凝胶颗粒与蛋白质之间的物理化学互作用实现蛋白质的分离和纯化。
在蛋白质凝胶层析中，洗脱顺序是非常重要的，不同的洗脱顺序会对分离和纯化的效果产生明显的影响。
下面将详细介绍几种常用的蛋白质凝胶层析柱的洗脱顺序。
一、离子交换层析离子交换层析是一种利用离子交换树脂分离和纯化蛋白质的方法。
在离子交换层析中，蛋白质与树脂之间的相互作用是通过蛋白质和树脂之间的电荷相互吸引而实现的。
树脂表面带有固定电荷，蛋白质通常具有正电荷或负电荷，因此它们可以相互吸附在树脂上。
洗脱时，通常采用逐渐增加或减少盐浓度的方法，通过改变离子强度来控制蛋白质的吸附与解吸，实现蛋白质的分离和纯化。
离子交换层析的洗脱顺序通常分为以下几步：1. 预洗：用高盐缓冲液清洗层析柱，去除附着在树脂上的亲和物质和非特异性吸附物。
2. 去除杂质：使用低盐缓冲液洗脱非特异性吸附物，如组织碎片、细胞碎片和核酸等。
3. 分级洗脱：从低盐到高盐逐渐增加缓冲液中的离子浓度，根据蛋白质的亲和性和亲和强度，逐渐洗脱目标蛋白质。
4. 再生：在蛋白质完全洗脱之后，使用高盐缓冲液再次洗脱树脂上的杂质和非特异性吸附物。
5. 平衡：用平衡缓冲液平衡层析柱，使其恢复初始的交换能力。
二、尺寸排阻层析尺寸排阻层析是一种根据蛋白质的大小差异来分离和纯化蛋白质的方法。
在尺寸排阻层析中，凝胶层析柱中的凝胶颗粒具有固定的孔径，大分子蛋白质无法进入凝胶颗粒内部，而小分子蛋白质则可以进入凝胶颗粒内部。
因此，大分子蛋白质会流经凝胶颗粒，而小分子蛋白质会进入凝胶颗粒内部，实现二者的分离。
尺寸排阻层析的洗脱顺序通常分为以下几步：1. 预洗：用高盐缓冲液清洗层析柱，去除附着在凝胶颗粒表面的亲和物质和非特异性吸附物。
2. 去除杂质：使用低盐缓冲液洗脱非特异性吸附物，如细胞碎片、核酸等。
3. 分级洗脱：从大孔径到小孔径逐渐减少缓冲液中的孔径，根据蛋白质的大小差异，逐渐洗脱目标蛋白质。
离子交换层析操作方法
离子交换层析操作方法离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，例如蛋白质、核酸等。
其原理是利用固定在固相上的离子交换剂与样品中的离子之间发生物理吸附和解离平衡，通过调节其溶剂系统、pH值、盐浓度等条件，使样品中的不同离子以不同的速率从固相上解离下来，从而实现分离目标分子的目的。
离子交换层析操作可以分为以下几个步骤：1. 样品处理：样品的处理对于离子交换层析的成功与否至关重要。
通常情况下，样品需要经过蛋白质提取等步骤，获得纯净的样品溶液。
如果样品中含有较高浓度的盐类等杂质，可以通过浓缩、洗涤等方法去除。
2. 选择合适的离子交换剂：离子交换剂的选择是根据样品中所含离子的性质来决定的。
对于阴离子，通常选择带有正电荷的阳离子交换剂（如硫酸树脂、乙二胺树脂等）；对于阳离子，通常选择带有负电荷的阴离子交换剂（如盐酸树脂、硝酸树脂等）。
3. 准备离子交换柱：选择合适的柱子尺寸和填充物，通常为高分子量亲水性凝胶。
将填充物装入离子交换柱中，并保持均匀填充。
4. 培养条件：根据样品特性和目的，设置适当的培养条件。
其中包括pH值、溶剂系统和盐浓度。
这些条件的选择需要根据样品的性质（酸碱性，亲水性等）和需要分离的目标纯化物的性质来确定。
5. 样品加载：将经过处理的样品加入离子交换柱，采用适当的流速保持平衡。
溶剂的选择和流速的控制主要是为了交换离子的速率与静电吸附的速率之间达到适当的平衡。
6. 洗脱：通过改变培养条件或溶剂梯度洗脱目标分离物和杂质。
通常使用梯度洗脱的方式，即梯度调整溶剂中的离子浓度，以促进目标物质逐步从离子交换剂上脱附。
7. 浓缩和储存：将洗脱得到的目标分离物浓缩并储存。
离子交换层析操作常见的问题及解决方案：1. 样品中存在杂质：可以通过前处理步骤（如超滤、浓缩等）进行预处理，去除杂质，以保证在交换剂上发生特异性吸附。
2. 分离效果不佳：可以通过改变溶剂系统、pH值或盐浓度等因素来优化分离条件，选取合适的条件以提高分离效果。
离子交换层析纯化血清蛋白质
一、原理（1）
阴离子交换R-N+(CH3)3Cl- +A-B+
季胺基
阳离子交换R-SO-N+(CH3)3A-+B+ClR-SO-3 B + + A-H +
交换剂的基本类型包括： 树脂＼纤维素＼葡聚糖 依据被分离样品带电情况而选择阴阳交换剂。
二、器材与试剂
1、器材： 层析柱 移液管 滴管 玻璃棒 烧杯 部分收集器 恒流泵 试管及试管架
滤纸 剪刀及镊子 塑料反应板
2、试剂： （1）0.3M pH6.5醋酸铵缓冲液 （2）0.06M pH6.5醋酸铵缓冲液 （3）0.02M pH6.5醋酸铵缓冲液 （4）200g/L 磺基水杨酸
三、操作
1、装柱：方法同“血清白蛋白盐析及分子筛层 析脱盐”，用0.02M NH4Ac平衡柱子。
2、加样：取2ml血清轻轻加于柱床上，待血清 样品全部进入柱床后，用移液管吸0.02M NH4Ac 溶液约4-5ml加于柱床上。
3、洗脱：连接衡流泵并以1-1.5ml/min的流速 继续用0.02M NH4Ac溶液淋洗，随时监测γ-球蛋 白的流出（约5-6ml液体），并接收，留作电泳 用。
四、现象及解释： 五、结果与讨论：
4、洗脱：收到γ-球蛋白后，继续洗脱30ml， 然后提高盐浓度至0.06M NH4Ac, α-球蛋白 和β-球蛋白可被洗脱下来，收集5-6ml，检 测到蛋白质后继续洗脱30ml。最后，再将盐 浓度提高到0.3M NH4Ac,则白蛋白被洗脱下 来，随时监测蛋白的流出并接收，留作电泳 用。
5、结束：收到白蛋白后继续洗脱１０－１ ５分即可结束。
一、原理（2）
DEAE纤维素为阴离子交换剂，能吸附带负电荷 的物质，在0.02M pH6.5醋酸铵缓冲液条件下，牛 血清中的白蛋白、α-球蛋白和β-球蛋白均带负电 荷，能被DEAE纤维素吸附。而γ-球蛋白带正电荷 不被吸附而直接流出，此时收集的即为提纯的γ球蛋白。
蛋白质的离子交换层析技术
离子交换层析技术层析（chromatography）也称为色谱，就是将混合物中各种组分分离的方法，是分离、纯化及鉴定生物大分子时最常使用的技术之一。
一个层析系统都包括两相，即固定相和移动相。
当移动相流过加有样品的定相时，由于各组分在两相之间的分配比例不同，它们（各组分）就会以不同的速度移动而相互分离开来。
定相可以是固体，也可以是被固体或凝胶所支持的液体。
定相可以被装入柱中或涂成薄层、薄膜，成为层析“床”。
动相可以是气体，也可以是液体，前者称为气相层析，或者成为液相层析。
离子交换层析技术是以离子交换纤维素、离子交换树脂或离子交换葡聚糖凝胶为固定相，以待分离的样品为移动相，分离和提纯蛋白质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。
（一）原理在纤维素与葡聚糖分子上结合有一定的离子基团，当结合阳离子基团时，可换出阴离子，则称为阴离子交换剂。
如二乙氨乙基（Dicthylaminoethyl，DEAE）纤维素。
在纤维素上结合了DEAE，含有带正电荷的阳离子纤维素—O—C6 H14N+H，它的反离子为阴离子（如Cl-等），可与带负电荷的蛋白质阴离子进行交换。
当结合阴离子基团时，可置换阳离子，称为阳离子交换剂，如羧甲基（Carboxymethy，CM）纤维素。
纤维素分子上带有负电荷的阴离子（纤维素－O－CH2－COO一），其反离子为阳离子（如Na+等）,可与带正电荷蛋白质阳离子进行交换。
溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。
反之，溶液的pH值小于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。
溶液的pH值距蛋白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。
反之则越少。
血清蛋白质均带负电荷，但各种蛋白质带负电荷的程度有所差异，以白蛋白为最多，依次为α球蛋白，β球蛋白和γ球蛋白。
在适当的盐浓度下，溶液的pH值高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。
离子交换柱层析法分离纯化蛋白质
离⼦交换柱层析法分离纯化蛋⽩质离⼦交换柱层析法分离纯化蛋⽩质⼀、实验⽬的学习层析技术，掌握离⼦交换柱层析法分离纯化蛋⽩质的操作⽅法。
⼆、基本原理离⼦交换层析是依据各种离⼦或离⼦化合物与离⼦交换剂的结合⼒不同⽽进⾏分离纯化的。
离⼦交换层析的固定相是离⼦交换剂，以液体为流动相。
离⼦交换剂由⼀类不溶于⽔的惰性⾼分⼦聚合物基质，通过⼀定的化学反应共价结合上某种电荷基团形成。
离⼦交换剂可以分为三部分：⾼分⼦聚合物基质、电荷基团和平衡离⼦。
电荷基团与⾼分⼦聚合物共价结合，形成⼀个带电的可进⾏离⼦交换的基团。
平衡离⼦是结合于电荷基团上的相反离⼦，它能与溶液中其它的离⼦基团发⽣可逆的交换反应。
平衡离⼦带正电的离⼦交换剂能与带正电的离⼦基团发⽣交换作⽤，称为阳离⼦交换剂；平衡离⼦带负电的离⼦交换剂与带负电的离⼦基团发⽣交换作⽤，称为阴离⼦交换剂。
假设以RA+代表阳离⼦交换剂，其中A+代表平衡离⼦，A+可以与溶液中的阳离⼦B+发⽣可逆的交换反应，其反应式为RA+ + B+↔ RB+ + A+上述反应能迅速达到平衡，平衡的移动遵循质量作⽤定律。
下⾯以阴离⼦交换剂为例简单介绍离⼦交换层析的基本分离过程。
阴离⼦交换剂的电荷基团带正电，装柱平衡后，与缓冲溶液中的带负电的平衡离⼦结合。
待分离溶液中可能有正电基团、负电基团和中性基团。
加样后，负电基团可以与平衡离⼦进⾏可逆的置换反应⽽结合到离⼦交换剂上，⽽正电基团和中性基团则不能与离⼦交换剂结合，随流动相流出⽽被去除。
通过选择合适的洗脱⽅式和洗脱液，如增加离⼦强度的梯度洗脱。
随着洗脱液离⼦强度的增加，洗脱液中的离⼦可以逐步与结合在离⼦交换剂上的各种负电基团进⾏交换，⽽将各种负电基团置换出来，随洗脱液流出。
与离⼦交换剂结合⼒⼩的负电基团先被置换出来，⽽与离⼦交换剂结合⼒强的，需要较⾼的离⼦强度才能被置换出来，这样各种负电基团就会按其与离⼦交换剂结合⼒从⼩到⼤的顺序逐步被洗脱下来，从⽽达到分离⽬的。
化工专业实验-蛋白质的离子交换层析分离实验-2013
化工专业实验蛋白质的离子交换层析实验一、实验目的1．了解离子交换层析分离蛋白质的基本原理。
2．掌握离子交换层析分离操作的基本步骤及方法。
二、实验原理1. 离子交换层析蛋白质的基本原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography，简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析分离方法。
离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成，带负电荷能吸附正电荷的称之阳离子交换树脂，而带有正电荷能吸附负电荷的称之阴离子交换树脂。
蛋白质（protein）是生命的物质基础，它是与生命及与各种形式的生命活动紧密联系在一起的生物大分子物质。
蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸按不同比例组合而成的。
虽然蛋白质是大分子有机物，但由于蛋白质中含有氨基、羧基等亲水基团，蛋白质长链中的亲水基团向外而疏水基团向内，可以形成特定的三维结构，所以大部分蛋白质仍能较好的溶解在水溶液中。
在一定的离子强度范围内，溶液中的小分子离子在静电作用下吸附包裹在蛋白质表面亲水基团外侧，形成双电层结构，一定程度上有助于稳定蛋白结构及其水溶性。
但蛋白质在不同的pH条件下，其带电状况不同。
当pH较低时，蛋白质表面正电荷多于负电荷，总体电性为正；当pH较高时，蛋白质表面正电荷少于负电荷，总体电性为负；当蛋白质表面正电荷量与负电荷量相当时，蛋白质总体显示电中性，双点层结构解体，蛋白质亲水性降到最低，将表现出明显的疏水性，发生疏水性团聚和沉淀，此时的pH值即为蛋白质的等电点。
不同蛋白质结构不同，等电点亦不同，但大部分已知蛋白多属于阴离子蛋白，在中性溶液中显示出电负性。
离子交换层析可以用于蛋白质的分离纯化：阴离子交换基质能吸附带有负电荷的蛋白质，阳离子交换基质能结合带有正电荷的蛋白质。
一般而言，pH越低，蛋白质净正电荷数越多，pH越高，蛋白质净负电荷数越多；蛋白质分子个头越小，净电荷数越多，离子交换吸附作用越强，越难被洗脱；溶液中小分子离子含量越多，蛋白质可吸附量越少，但若小分子离子含量过低，蛋白质双电层结构不易形成，其水溶性会降低。
包涵体纯化实验报告
一、实验目的1. 掌握包涵体纯化的基本原理和操作步骤。
2. 学习利用离子交换层析法对包涵体进行纯化。
3. 评估包涵体纯化效果，并探讨优化纯化条件的方法。
二、实验原理包涵体是细菌表达外源蛋白时形成的一种不溶性蛋白质聚集体。
由于包涵体中的蛋白质缺乏生物活性，因此需要通过一系列操作将其溶解、复性，并最终纯化得到具有生物活性的蛋白质。
本实验采用离子交换层析法对包涵体进行纯化，通过改变缓冲液中的离子强度和pH值，使包涵体中的蛋白质与层析柱上的亲和基团结合，从而实现蛋白质的分离和纯化。
三、实验材料1. 包涵体样品2. 离子交换层析柱3. 标准蛋白样品4. 标准缓冲液5. 蛋白质浓度测定试剂盒6. 超声波破碎仪7. 离心机8. 荧光分光光度计9. 数据处理软件四、实验步骤1. 包涵体样品的处理将包涵体样品用超声波破碎仪处理，使包涵体溶解。
然后将溶液离心，取上清液作为后续实验的样品。
2. 样品预处理将样品用缓冲液稀释，调整离子强度和pH值，使包涵体中的蛋白质与层析柱上的亲和基团结合。
3. 离子交换层析将预处理后的样品上柱，用缓冲液进行洗脱，收集洗脱液。
4. 蛋白质纯化效果评估采用蛋白质浓度测定试剂盒对洗脱液进行蛋白质浓度测定，比较不同洗脱液中的蛋白质浓度，评估纯化效果。
5. 数据处理与分析利用数据处理软件对实验数据进行统计分析，探讨优化纯化条件的方法。
五、实验结果1. 包涵体样品经过超声波破碎后，溶液变得清澈，说明包涵体已成功溶解。
2. 通过离子交换层析法，成功将包涵体中的蛋白质与层析柱上的亲和基团结合，实现了蛋白质的分离和纯化。
3. 通过蛋白质浓度测定，发现洗脱液中的蛋白质浓度明显高于未处理的样品，说明纯化效果良好。
4. 通过数据分析，发现改变缓冲液中的离子强度和pH值对包涵体纯化效果有显著影响。
在一定范围内，增加离子强度和降低pH值有利于提高蛋白质的纯化效果。
六、实验结论1. 本实验成功实现了包涵体的纯化，并获得了具有生物活性的蛋白质。
离子交换层析的基本操作
不同蛋白质与离子交换剂之间形成离子键数目不同，即亲和力大 小有差异，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的成分逐个 洗脱下来，达到分离纯化的目的
离子交换剂的分 类
阳离子交换剂：强酸型和弱酸型
阴离子交换剂：强碱型和弱碱型
阳离子交换剂 分为强酸型、中强酸型和弱酸型三类，强酸型含有－R－SO3H，中 强酸型含有－PO3H2、－PO2H2或－O－PO2H2，弱酸型含有－COOH 或－OH。 阳离子交换进行的反应如下：
合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出
然后改变流动相成份，将结合的亲和物洗脱下来
亲和层析（affiuity chromatography）
原理：
a. 理论依据：待纯化分子和配体间具有亲和性
理想的分离纯化介质应具有下列性质：
对目标蛋白具有较高的分离效率
对目标蛋白不会造成变性
化学性能和机械性能稳定，重复性好
价格低廉
• Sephadex 是由葡聚糖通过环氧氯丙烷交联 形成的三维网状凝胶颗粒 • Superose是在珠状琼脂糖颗粒的基础上经 过两次交联后得到的
5. 分离纯化过程的规模化
蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合适， 如：
离子交换纤维素：
离子交换纤维素是携带功能基团纤维素衍生物，具有松散的亲水 性网状结构以及较大的表面积，大分子可以自由通过，因而对生物大 分子（如蛋白质）的交换容量比离子交换树脂大
阳离子型离子交换纤维素包括羟甲基纤维素（CM纤维素）等
阴离子型离子交换纤维素包括二乙基氨基乙基纤维素（DEAE纤 维素）
弱碱性阴离子交换剂在pH值升高时，其电离率逐渐降低，离子
交换能力逐渐减弱
常用的离子交换 剂
离子交换层析的操作步骤
离子交换层析的操作步骤嘿，朋友们！今天咱就来唠唠离子交换层析的那些事儿。
离子交换层析啊，就好比是一场精细的筛选游戏。
你想想看，就像是在一堆五颜六色的糖果中，要挑出你最喜欢的口味一样。
首先呢，你得准备好你的“游戏道具”，也就是离子交换剂啦。
这可是关键，就像你得有副好牌才能打好牌局嘛！得选那种质量好、性能稳定的离子交换剂，这可不能马虎。
然后呢，就是把你的样品溶液弄好。
这就像是给糖果们排好队，准备进入筛选的环节。
样品溶液的浓度、酸碱度啥的都得调好，不然可没法顺利进行游戏哦。
接下来，就是让样品溶液和离子交换剂来个亲密接触啦！这就像糖果们一个一个地走过选口味的关卡。
在这个过程中，那些符合离子交换剂要求的“糖果”就会被吸附住，其他的就会被淘汰掉。
吸附完了可不算完事儿哦，还得进行洗脱呢！这就好比是把选好的糖果从关卡里拿出来。
用合适的洗脱液去冲洗离子交换剂，把吸附在上面的东西给弄下来。
这可得掌握好洗脱液的浓度和流速，就像掌握好拿糖果的力度一样，太轻了拿不下来，太重了可能会把好东西也给冲坏了。
哎呀，你说这离子交换层析是不是很有意思呀？就像是一个神奇的魔法盒子，能把你想要的东西从一堆混合物里变出来。
在整个过程中，每一步都很重要哦！要是哪一步没做好，可能就得不到你想要的结果啦。
就像搭积木一样，一块没搭好，可能整个房子就歪了。
所以啊，大家在做离子交换层析的时候，一定要细心细心再细心，耐心耐心再耐心。
可别马马虎虎的，不然到最后哭都没地方哭去。
反正我觉得离子交换层析这玩意儿真的很神奇，能帮我们解决好多问题呢！大家只要认真去学，认真去做，肯定能掌握好这个技术，让它为我们服务！你们说是不是呀？。
离子交换柱层析操作
离子交换柱层析操作规程（可溶性蛋白）1.装柱：1.1 取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子；1.2用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水；1.3取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱，1.4用去离子水冲洗填料5个柱体积；2.柱的平衡与上样：2.1用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱，直至流出液的pH为7.6；2.2对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合；3洗杂蛋白：3.1用0.02M TB bufferA 缓冲液(PH7.6)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.3用含20mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.4用含40mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含40mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.5用含60mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含60mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.6用含80mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含80mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）4解离目的蛋白：4.1用含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.2 用含200mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含200mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.3 用含500mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含500mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；4.4用含1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含1000mMNaCL的TB bufferA 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul 做SDS-PAGE检测；（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）5.柱的清洗与保存：5.1用含1000mMNaCL的TB bufferA缓冲液（PH7.6）以冲洗层析柱，共冲洗30ml；5.2用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml；5.3用过滤去离子水冲洗50ml；5.4用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。
14重组蛋白纯化——离子交换柱纯化包涵体
包涵体蛋白纯化1. 包涵体蛋白的获取1.1 从半固体培养基平板上挑取一个表达菌单集落，加入2ml含有相应抗生素的LB培养基37℃培养活化过夜；次日，2L培养瓶加入1L含相应抗生素LB培养基，接种1ml活化好的表达菌，37℃振摇条件下培养至A600nm=0.6;1.2 加入异丙基β-D-硫化半乳糖苷( IPTG)至0.5～1 mM，诱导目的蛋白表达；1.3 诱导3～4h后，15 000 r/min离心15 min收获细胞，用小体积的培养上清液重悬细胞，然后将其转移至预先称重的50 ml离心管中，离心沉淀细胞。
记录细胞沉淀的湿重，并冻存于-80℃备用。
（用此方法一般每升可得到1.5～2.0g湿重的大肠杆菌细胞。
）1.4 裂解细胞，用30 ml裂解缓冲液[50 mM Tris-HCl ( pH7.9 ), 0.1 mM EDTA,5%甘油，0.1mM DTT,0.1M NaCl]悬浮细胞，超声波破碎细胞至清亮（冰上操作，60%功率4次，每次20秒，间隔1min）1.5 加入纯Triton X-100至终浓度为1%，吹打或者轻度超声以溶解和洗涤细胞膜蛋白；裂解物于冰上静置10min，然后15000r/min 离心15min沉淀包涵体，弃上清。
1.6 加入30ml含1% Triton X-100的裂解缓冲液洗涤包涵体，吹打或者轻度超声，冰上静置10min，然后15000r/min 离心15min沉淀包涵体，弃上清。
1.7 加入30ml裂解缓冲液洗涤包涵体，吹打或者轻度超声，冰上静置10min，然后15000r/min 离心15min 沉淀包涵体，弃上清。
此时,包涵体纯度达到90%左右。
2. 包涵体蛋白的溶解将洗涤后的包涵体重悬于合适的变性缓冲液,使其变性和溶解;变性之后15000r/min离心15min去除残余不溶物。
注：通常使用的变性缓冲液以裂解缓冲液为基础溶液，加入6M盐酸胍，8M尿素或者0.3%十二烷基肌氨酸钠等，变性和溶解的时间根据包涵体的性质确定，上文已经提及。
实验十二离子交换柱层析法分离蛋白质综述
实验十二离子交换柱层析法分离蛋白质实验原理1．离子交换与洗脱所谓离子交换，是指溶液中的某一种离子与另一种靠静电力结合在惰性载体上的离子进行可逆交换的过程，即溶液中的离子结合到载体上而载体上的离子被替换下来。
若惰性载体上以共价键结合着带正电荷的活性基团，则可交换阴离子，叫阴离子交换剂；若以共价键结合着带负电荷的活性基团，则可交换阳离子，叫阳离子交换剂。
在一定的条件下，混合物中不同蛋白质所带电荷的性质及电荷多少不同，有的能与特定离子交换剂结合，有的不能结合；能与离子交换剂结合的蛋白质中，结合力的大小也不一定相同，所以，采用适当的洗脱条件，可以对它们进行有效的分离。
离子交换过程可以表示如下：一一一一■一R+Y+x→■一R+X+Y (阴离子交换)■一R—Y++x+→■一R—X++Y+ (阳离子交换)上式中，■代表惰性载体；R代表惰性载体上的活性基团；Y代表平衡离子(可替换离子)； x代表蛋白质分子。
样品进入离子交换柱之前，共价结合于惰性载体上的活性基团大部分处于溶剂化状态，并吸附着平衡缓冲液中带相反电荷的离子。
蛋白质样品进入离子交换柱后，由于分子表面一些基团的电荷性质与交换剂上活性基团的电荷性质相反，因而会通过静电引力结合于交换剂上，并把其原来吸附的平衡离子取代下来。
蛋白质是两性电解质，它与离子交换剂的结合力取决于分子表面能够与离子交换剂形成静电键的数目，而后者首先与分子所携带的电荷的数目有关，其次与蛋白质分子的大小及电荷排列也有一定关系，因为它们与蛋白质分子是否易于在离子交换剂上的适当部位形成静电键有关。
总的来说，蛋白质分子与交换剂之间存在三种不同的结合状态：①蛋白质分子与交换剂之间的静电键数目很多，以致它们同时解离的机率等于零。
洗脱时，这部分蛋白质由于结合紧密而停留在柱顶端。
②蛋白质分子与交换剂之间的静电键数目相对较少，它们同时解离的机率达到某一有限值(0～1之间)。
洗脱时，某一种蛋白质分子的静电键在某一时间里同时解离，随洗脱液向下移动。
GE离子交换层析柱
GE离子交换层析柱 protocol 5ml（举例子）Preparation1. Buffer:（pH 根据蛋白的 pI 进行调整，pH 尽量远离 pI。
pH>pI,过 Q 柱；pH>pI,过 S 柱）A: 50mM Tris-HClB: 50mM Tris-HCl 1M NaCl过滤除杂质，4℃静置过夜除气泡。
2. Protein:用滤器过滤除质；或者分装于 EP 管，14000rpm，4℃离心 20min，去除沉淀。
3 .Prepare enough tubes有流速时，禁止将泵的探头暴露到空气中!!! 柱子在仪器上时，无论何时均要限压!!! Procedure1 打开仪器总开关，电脑。
检查：泵的探头是否放入纯水中。
洗泵：Manual--pump--pump basic wash--A on ,B on--insert--execute洗系统：Manual--pump--flow--10ml/min--insert--executeManual--other--End time--volume--40 ml2 安装柱子给流速：Manual--pump--flow--3ml/min--insert--execute(仪器显示系统压力为*Mpa)限压力：Manual--Alarms--Alarms pressure--+*)Mpa--insert--execute 是 Hitrap Q 柱子的最大限压)装柱子：先装上面，再下面，装完后用纸巾擦干，观察是否漏液。
3 清洗柱子限压力：Manual--Alarms--Alarms pressure--+*)Mpa--insert--execute给流速：Manual--pump--flow--1ml/min--insert--execute（低流速下装柱子）Manual--other--End time--volume--10 ml（第一次使用的新柱子或者装有乙醇的柱子，必须先用纯水洗以上。
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离子交换柱层析操作
（包涵体蛋白）
1.装柱：
1.1 取出层析柱，用去离子水冲洗干净，连接好管子后固定柱子；
1.2用水冲洗层析柱3-5次，每次10ml去离子水；
1.3取出填料，静止至室温后，根据需要用移液器取出3-5ml的填料进行装柱，
1.4用去离子水冲洗填料5个柱体积；
2.柱的平衡与上样：
2.1用0.02M TB bufferB 缓冲液(PH7.6)平衡Ni柱，直至流出液的pH为7.6；
2.2对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让蛋白充分结合；
3洗杂蛋白：
3.1用0.02M TB bufferB 缓冲液(PH7.6)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至流出液与缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；3.2用含10mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含10mM咪唑的TB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；
3.3用含20mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含20mM咪唑的TB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；
3.4用含40mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含40mM咪唑的TB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；
3.5用含60mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含60mM咪唑的TB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；
3.6用含80mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含80mM咪唑的TB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；
3.2用含100mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流
出液与含100mM咪唑的TB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；
（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）
4解离目的蛋白：
4.1用含100mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含100mM咪唑的TB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；
4.2 用含200mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含200mM咪唑的TB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；
4.3 用含500mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含500mM咪唑的TB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul做SDS-PAGE检测；
4.4用含1000mM咪唑的TB bufferB 缓冲液（PH7.6）过柱，共洗约30ml，至流出液与含1000mM咪唑的TB bufferB 缓冲液的OD值接近为止，流出液取20ul 做SDS-PAGE检测；
（具体的洗脱梯度需根据实验自行调整）
5.柱的清洗与保存：
5.1用含1000mM咪唑的缓冲液B（PH7.6）以冲洗层析柱，共冲洗30ml；
5.2用浓度为1.5M的NaCl溶液冲洗层析柱，共冲洗30ml；
5.3用过滤去离子水冲洗50ml；
5.4用20%乙醇冲洗30ml后于4℃20%乙醇中保存。