NF-κB信号通路热点问题大揭秘（1）：NF-κB信号通路的泛素化修饰研究

NF-κB信号通路热点问题大揭秘（1）：NF-κB信号通路的泛
素化修饰研究
「信号Pi」专栏
信号Pi，读曰「信号派」，是CST新推出关于信号通路研究中痛点和热点逐一击破类系列软文。

CST技术专家为您举办的通路派对，从心起航。

本期靶点：NF-κB。

期待不定期更新的日常。

一提到NF-κB，或者p65，估计小伙伴们都不陌生，它在免疫信号通路中的地位和研究频度，估计与肿瘤研究中p53不遑多让。

NF-κB上下游研究相对明晰，做来做去似乎就那几个关键蛋白，让研究人员觉得乏善可陈。

但，真的这样么？现在NF-κB信号通路的热点问题到底在哪儿？未来可以挖掘的新的研究方向还有哪些？我们怎么从数以万篇的文献当中找到自己研究的新思路呢？
本短文将通过梳理NF-κB信号通路近年来的的研究热点，以点带面部分解决您心中的困惑，希望能够为您的NF-κB相关研究带来一点灵感。

一、 NF-κB信号通路简介
NF-κB信号通路作为很多免疫细胞共有的核心信号通路，承接多种免疫相关受体传递的信号，通过NF-κB(NF-κB)/Rel蛋白家族成员
转位进入细胞核，并组合为转录因子复合物，调控多种下游基因的表达并介导多种生物学过程（如增殖、凋亡、炎症、血管生成、肿瘤细胞恶性转化、迁移等），在多种疾病中扮演着至关重要的角色。

NF-κB(NF-κB)/Rel蛋白家族包括NF-κB2 p52/p100，NF- κB1 p50/p105，c-Rel，RelA/p65和RelB几个亚类1-3。

这些蛋白均形成二聚体转录因子，它们控制的基因调控众多的生物学过程，如先天性和获得性免疫、炎症、应激反应、B细胞形成、淋巴器官的生成等。

在经典的通路中，NF-κB/Rel与IκB结合并被其抑制。

促炎症因子、LPS、生长因子和抗原受体激活IKK复合体(包含IKKβ、IKKα和NEMO)，后者磷酸化IκB蛋白，导致IκB 蛋白被泛素化和溶酶体降解，于是NF-κB被释放出来。

活化的NF-κB进一步被磷酸化激活并转移入核，NF-κB或单独或与其他转录因子如AP-1，Ets和Stat结合诱导靶基因的表达。

NF-κB替代途径中（如B细胞内），NF-κB2 p100/RelB复合体以未激活的状态停留在胞浆中。

一些受体的激活，如LTβR，CD40和BR3激活激酶NIK，激活的NIK而后又激活IKKα复合体，后者对NF- κB2 p100的羧基端氨基酸进行磷酸化。

磷酸化的NF-κB2 p100 被泛素化并被蛋白酶体降解为NF-κB2 p52。

最后形成具有完整转录活性的NF-κB2 p52/RelB复合体，转移进入细胞核并起始靶基因转录1-3。

CST NF-κB信号通路图中只列举了一部分已知的NF-κB的激动剂和靶基因。

相关产品信息，请点击以下链接，
/browse/NF-κB-
signaling?N=4294964832+4294959789+4294956287
以及学术资源下载中心，获得免疫相关信号通路的电子版资料
（图片来源：CST guide）
二、NF-κB信号通路的热点问题
1. NF-κB信号通路的蛋白翻译后修饰研究
翻译后修饰(Post-translational modification, PTM)是指对翻译后的蛋白质进行共价加工的过程。

它通过在一个或多个氨基酸残基加上修饰基团，可以改变蛋白质的物理、化学性质，进而影响蛋白质的空间构象和活性状态、亚细胞定位、折叠及其稳定性以及蛋白质-蛋白质相互作用4。

根据蛋白质翻译后修饰的专业数据库PhosphoSitePlus?（）统计结果显示，目前研究较多的蛋白翻译后修饰包括磷酸化、泛素化、乙酰化和甲基化四类修饰。

蛋白翻译后修饰是信号通路研究不可或缺的一个重要层面，也是蛋白功能研究的新领域，很多临床诊断
和药物开发的靶点也有很多与蛋白修饰有关。

因此，蛋白翻译后修饰近年来已经成为信号通路研究的热点问题。

1.1 NF-κB信号通路的泛素化研究
泛素是一种高度保守的76个氨基酸构成的短肽，在从酵母到人的所有真核生物中广泛表达。

泛素C末端的甘氨酸的羧基可以通过异肽键共价连接到某一个蛋白的赖氨酸的ε氨基上，这个过程被称为泛素化，是通过分步酶反应的三类酶催化——即泛素活化酶（E1）、泛素结合酶（E2）和泛素蛋白连接酶（E3）5（图1. 泛素连接酶体系）。

此外，泛素C末端可串联结合到另一个泛素的七个可能位置的赖氨酸——K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63，形成不同连接的多聚泛素链。

此外，泛素C末端可直接连接到另一个泛素蛋白N端甲硫氨酸形成线性多聚泛素链。

不同位点连接的多聚泛素影响着泛素化修饰的底物蛋白的不同命运，为泛素化修饰增加了一层复杂性。

例如，K11和K48-泛素化通常是参与指导蛋白质的蛋白酶依赖的降解，而K63有非蛋白降解的多重调节功能，如DNA损伤修复、染色质重塑、囊泡转运和蛋白激酶激活6。

其中，泛素蛋白连接酶（E3）及复合物决定靶蛋白的特异性识别，在泛素途径中具有重要的作用7。

泛素连接酶E3通过调控蛋白的泛素化过程参与细胞内的多种生理过程，所有的E3都具有连接靶蛋白和特定E2的能力7。

蛋白质特定的翻译后修饰（如磷酸化修饰介导的泛素化过程）经常作为其相应的泛素连接酶E3识别的标志8。

人类约有500-1000 种E3连接酶，并分四个亚家族：HECT、RING-finger、Ubox和PHD-finger。

想查看已知泛素连接酶E3的全面信息？请点击下面链接
图1. 泛素连接酶体系（图片来源：CST guide）
在NF-κB信号通路中，K11、K48、K63和线性化多聚泛素链均有涉及，而多聚化泛素链的类型是由不同的泛素结合酶（E2）及RING类型的泛素连接酶（E3）共同介导形成的，并发挥着不同功能。

例如，泛素结合酶（E2）UBC13，与E2变体UEV1以及TRAF的RING结构域协同作用，促进K63多聚泛素链的形成。

然而，泛素结合酶（E2）UBC5连同SCFβTrcp连接酶复合体的ROC1/RBX1蛋白，促进K48多聚泛素链的形成9。

LUBAC 连接酶复合体介导IL-1β诱导的NF-κB信号通路传递过程中的蛋白线性化多聚泛素链的形成10。

另一方面，泛素化修饰是可逆的，可以通过去泛素化酶将某些蛋白的泛素化修饰去除。

目前，约有100种不同的去泛素化酶是由人类基因组编码，并分为5个大类：其中有四类属于木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶（泛素C端水解酶，UCH；泛素特异蛋白酶，USP；卵巢肿瘤结构域蛋白酶，OTU；Machado-Joseph病蛋白酶，MJD），第五种是一
种金属蛋白酶JAMM。

其中在NF-κB信号通路研究的最为深入的两个DUB是A20和CYLD11。

而且，A20还具有泛素连接酶的功能，是一个具有双重功能的蛋白。

在NF-κB信号通路的调节中，不同的泛素蛋白连接酶（E3）和去泛素化酶发挥着重要作用，具体的底物蛋白、功能、及研究产品见下表1和表2：
表1:参与NF-κB相关信号通路调节的多种泛素化酶和去泛素化酶一览表，引用自I.E. Wertz and V.M. Dixit Cold Spring Harb Perspect Biol 2010;2:a003350
表2:参与NF-κB相关信号通路调节的多种泛素化酶和去泛素化酶经典底物、功能及CST相关研究产品一览表
目前，NF-κB信号通路的泛素化调节仍然有一些问题需要进一步研究，比如一些新型泛素化连接酶和去泛素化酶的功能鉴定、已知泛素化连接酶和去泛素化酶新的底物分析、在一些新的细胞类型（如神经元）中探索NF-κB信号通路的泛素化调节等。

其中，经常伴随泛素化调节的一个核心问题就是对泛素化酶或去泛素化酶的底物进行鉴定和分析，那么我们应该用什么方法呢?
Cell Signaling Technology （CST）提供一种方法PTMScan
（工作流程见图2），利用特异性抗体识别泛素化修饰蛋白对应肽段在胰蛋白酶处理后留下的二甘氨酸残基K-ε-GG，就可以实现对泛素化肽段的富集，进而将这些肽段纯化后通过质谱分析获得肽段序列信息及对应蛋白质信息。

此方法不仅可以定性分析泛素化位点，还经常利用泛素连接酶（去泛素化酶）的敲除动物模型，比较敲除组和野生型组之间的泛素化肽段差异，用来鉴定泛素连接酶（去泛素化酶）的底物。

相关研究产品、服务及研究案例等信息，请访问CST官网，也可以访问资源下载中心下载《简易蛋白组学》手册了解详情。

图2: CST PTMScan
图2: CST PTMScan专利技术工作流程（图片来源：《简易蛋白组学》手册）。