miR-802靶向调控PI3K

·论著·miR-802靶向调控PI3K/Akt信号通路促进肝细胞癌血管新生的机制研究
刘文豪倪敏沈甫明金涌
【摘要】目的探究miR-802在肝细胞癌（HCC）细胞中的表达及其对肿瘤血
管新生的影响及作用机制。

方法通过转染miR-802 agomir、miR-802 antagomir上
调或抑制人HCC细胞系SMMC-7721中miR-802的表达水平。

将SMMC-7721细胞
分为NC组（正常培养细胞）、miR-802 agomir组（转染miR-802 agomir）和miR-802
antagomir组（转染miR-802 antagomir）。

采用小管形成实验和Transwell实验检测过
表达miR-802的SMMC-7721细胞上清液对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）成管能力
及迁移能力的影响。

采用蛋白质印迹法检测miR-802 agomir组中磷脂酰肌醇3激
酶（PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、血
管内皮生长因子（VEGF）的表达水平。

采用免疫荧光实验检测过表达miR-802对
VEGF生成的影响。

结果与NC组相比，miR-802 agomir组HUVEC细胞的成管能
力及迁移能力均显著增强，miR-802 antagomir组HUVEC细胞的成管能力及迁移能
力均显著降低，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

与NC组相比，miR-802 agomir
组SMMC-7721细胞中VEGF生成量增加，p-PI3K、p-Akt、Akt蛋白表达水平均显
著升高，差异均有统计学意义（P均＜0.05）。

结论 miR-802可通过调控PI3K/Akt
信号通路促进VEGF的释放，参与血管新生，从而促进HCC的发生和进展。

【关键词】肝细胞癌；miR-802；血管新生；PI3K/Akt信号通路
DOI: 10. 3969/j. issn. 1673-534X. 2024. 01. 009
Mechanism of miR-802 targeting PI3K/Akt signaling pathway in promoting angiogenesis
of hepatocellular carcinoma LIU Wenhao, JIN Yong. School of Pharmacy, Anhui Medical University,
Hefei 230032, China; NI Min, SHEN Fuming. Department of Pharmacy, Tenth People's Hospital of Tongji
University, Shanghai 200072, China
【Abstract】 Objective This paper attempts to investigate the expression of miR-802 in 
hepatocellular carcinoma cells and its effect on tumor angiogenesis and mechanism of action. Methods The
expression of miR-802 in human hepatocellular carcinoma cell line SMMC-7721 was up-regulated or 
inhibited by transfection of miR-802 agomir and miR-802 antagomir. SMMC-7721 cells were divided 
into the NC group (normal cultured cells), the miR-802 agomir group (transfected with miR-802 agomir), 
and the miR-802 antagomir group (transfected with miR-802 antagomir). The effects of SMMC-7721 
cell supernatant overexpressing miR-802 on the tube-forming and migratory abilities of human umbilical 
vein endothelial cells (HUVEC) were detected by using tubule formation assay and Transwell assay. The 
expression of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), phosphorylated PI3K (p-PI3K), protein kinase B (Akt), phosphorylated Akt (p-Akt), and vascular endothelial growth factor (VEGF) was detected by western blotting 
in the miR-802 agomir group. Immunofluorescence assay was used to detect the effect of overexpression 
基金项目：上海市崇明区“可持续发展科技创新行动计划”项目（CKY2022-24）
作者单位：230032 安徽合肥，安徽医科大学药学院（刘文豪、金涌）；200072 上海，同济大学附属第十人民医院临床药学部（倪敏、沈甫明）
通信作者：金涌，
of miR-802 on VEGF production. Results Compared with the NC group, the tube-forming and migratory abilities of HUVEC cells in the miR-802 agomir group are enhanced, and the tube-forming and migratory abilities of HUVEC cells in the miR-802 antagomir group are reduced, with statistically significant differences (P＜0.05). Compared with the NC group, the production of VEGF of SMMC-7721 cells in the miR-802 agomir group is increased, and the protein expression of p-PI3K, p-Akt, and Akt is elevated, with statistically significant differences (P＜0.05). Conclusion miR-802 can promote the release of VEGF through regulating the PI3K/Akt signaling pathway, and then participate in angiogenesis, thus promoting the occurrence and progression of hepatocellular carcinoma. 
【Key words】 Hepatocellular carcinoma; miR-802; Angiogenesis; PI3K/Akt signaling pathway
原发性肝癌是中国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因，包括肝细胞癌（HCC）、肝内胆管癌（ICC）和混合型肝细胞癌-胆管癌（cHCC-CCA）这3种不同病理类型，其中HCC患者占75%～85%[1-2]。

中国HCC患者约占全球HCC患者的50%，因此中国是HCC疾病负担较重的国家[3]。

早期HCC患者无明显症状，大部分HCC患者在确诊时疾病已进展至中晚期，导致其生存期短、预后差，因此尽早确诊HCC并及时治疗具有重要意义[4]。

miRNA可通过调控其靶基因的表达，从而影响相关蛋白的生成或降解，参与肿瘤的发生和进展。

多项研究表明，在HCC细胞和组织中可以检测到特异性miRNA的异常表达，miRNA可通过调节HCC的免疫微环境、炎症反应微环境、血管生成微环境等，对HCC细胞的发育、免疫反应、分化、增殖、凋亡、侵袭和转移等产生影响[5-6]。

研究显示，miR-802在肥胖小鼠肝脏组织中表达上调，影响肝脏葡萄糖代谢及胰岛素的释放[7]。

另有研究表明，miR-802在HCC细胞中表达水平较高[8-9]。

本课题组在前期研究中也发现，与癌旁组织相比，miR-802在HCC组织中的表达水平升高，上调miR-802表达可促进荷瘤小鼠的瘤体生长，体外转染miR-802 agomir可促进SMMC-7721细胞的增殖和迁移[10]。

本研究探究了miR-802在HCC发生、进展过程中的作用及其机制，以期为HCC的临床治疗提供参考依据。

1 材料与方法
1.1 材料
人HCC细胞系SMMC-7721和人脐静脉内皮细胞（HUVEC）均购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所细胞库。

miR-802 agomir、miR-802 antagomir及阴性对照物（NC）均购自广州锐博生物技术有限公司。

PCR引物和cDNA反转录试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司，抗磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、磷酸化PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）和血管内皮生长因子（VEGF）一抗均购自艾博抗（上海）贸易有限公司，GAPDH、羊抗兔及羊抗鼠二抗均购自上海西唐生物科技有限公司，TRIzol试剂盒购自上海碧云天生物技术股份有限公司，RIPA蛋白提取试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司，Transwell小室购自美国康宁公司。

1.2 细胞培养与转染
SMMC-7721细胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中孵育，置于5% CO2、37 ℃的培养箱中。

将SMMC-7721细胞分为NC组（正常培养细胞）、miR-802 agomir组（转染miR-802 agomir）和miR-802 antagomir组（转染miR-802 antagomir），细胞种板密度为2×105个/mL，转染时细胞融合度为50%～60%。

miR-802 agomir转染最终浓度为50 nmol/L，miR-802 antagomir转染最终浓度为100 nmol/L。

使用被红色荧光蛋白标记的miR-802 agomir（miR-802 agomir-RFP，50 nmol/L）转染SMMC-7721细胞，转染24 h后使用荧光显微镜拍照，鉴定转染效率。

1.3 SMMC-7721细胞中miR-802的表达水平检测
采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测SMMC-7721细胞中miR-802的表达水平。

使用TRIzol试剂提取SMMC-7721细胞中的总RNA，按照cDNA反转录试剂盒说明书在反转录引物作用下将RNA反转录为cDNA。

所得cDNA按照SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明书进行qRT-PCR反应。

反应条件：95 ℃预处理30 s；之后94 ℃变性30 s，60 ℃复性30 s，72 ℃延伸60 s，共30个循环。

以U6作为内参，采用2−ΔΔCt法计算miR-802的相对表达量。

引物序列见表1。

表1 引物序列引物名称序列
miR-802正向：5'-CAGTAACAAAGATTCATCCT-3'反向：5'-AACTGGTGTCGTGGAG-3'
U6正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'
反向：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'
1.4 HUVEC细胞成管能力检测
使用Matrigel基质胶检测HUVEC细胞成管能力。

NC组、miR-802 agomir组和miR-802 antagomir 组SMMC-7721细胞培养24 h后收集上清液，并用上清液分别培养HUVEC细胞24 h，随后分别收集各组HUVEC细胞进行计数。

96孔板每孔铺50 μL Matrigel基质胶，HUVEC细胞以1×104个/孔种入胶中，37 ℃、5% CO2环境中培养，6 h后于显微镜下观察并拍照，每组随机选取5个视野（×10），计算每个视野内的新生小管数量，取5个视野的平均值。

将HUVEC细胞生长形成闭合环状小管样结构的作为1个新生小管并进行计数。

1.5 HUVEC细胞迁移能力检测
采用Transwell实验检测细胞的迁移能力。

取1.4中各组HUVEC细胞进行计数，将HUVEC细胞（4 000个/孔）接种至Transwell小室的上室，然后在下室中加入600 μL含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，置于孵箱中继续孵育24 h。

孵育完成后，将小室取出并使用棉签轻轻擦净上室中的细胞，用4%多聚甲醛溶液固定细胞，使用DAPI对细胞核进行染色，染色15 min后，使用荧光显微镜拍照，每组随机选取5个视野（×10），计算迁移细胞数量，取5个视野的平均值。

1.6 PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt和VEGF蛋白表达水平检测
采用蛋白质印迹法检测SMMC-7721细胞中p-PI3K、p-Akt、Akt和VEGF蛋白表达水平。

NC组、miR-802 agomir组和miR-802 antagomir组SMMC-7721细胞培养24 h后，使用RIPA蛋白抽提裂解液提取各组细胞中的总蛋白并进行定量，定量后将蛋白充分变性。

按每泳道30～50 μg蛋白量进行上样，进行SDS-PAGE电泳；电泳完成后，将目的蛋白转至PDVF膜上；转膜完成后，用含5%脱脂牛奶的TBST缓冲液于室温中封闭1 h，分别加入抗PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、VEGF和GAPDH一抗，于4 ℃条件下孵育过夜，回收一抗，并洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的二抗在室温条件下作用1 h，最后使用ECL显影，并以GAPDH作为内参计算目的蛋白的相对表达量。

1.7 VEGF蛋白表达水平检测
采用免疫荧光实验检测VEGF蛋白表达水平。

NC组、miR-802 agomir组SMMC-7721细胞培养24 h 后收集上清液，将15 mm盖玻片提前放入12孔板底，将稀释后的上清液接种于盖玻片，使其覆盖盖玻片板底面积的20%～30%，培养箱内培养24 h 后，用冷PBS缓冲液洗1～2次，用4%多聚甲醛溶液固定细胞30 min，加入含5%脱脂牛奶的TBST缓冲液室温封闭30 min，使用VEGF荧光抗体及DAPI孵育细胞，将盖玻片置于载玻片上进行封片后，放入暗盒中于4 ℃静置至片剂凝固，在荧光显微镜下观察。

1.8 统计学方法
应用SPSS 19.0软件进行统计学分析。

计量资料以均数±标准差（x±s）表示，2组间比较采用t检验。

P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 miR-802 agomir转染鉴定
如图1所示，使用miR-802 agomir-RFP转染SMMC-7721细胞24 h后，荧光显微镜镜检结果提示，被RFP荧光标记的细胞为miR-802 agomir转染成功的细胞。

图1 miR-802 agomir转染SMMC-7721细胞鉴定图免疫荧光染色×
40
2.2 miR-802对HUVEC细胞成管能力及迁移能力的影响
如图2所示，与NC组（10.00±2.00）相比，miR-802 agomir组HUVEC细胞中新生小管数量（19.67± 4.16）显著增加，miR-802 antagomir组HUVEC细胞中新生小管数量（2.00±1.73）显著减少，差异均有
统计学意义（P均＜0.05），这提示miR-802可能可以增强HUVEC细胞的成管能力。

如图3所示，与NC组（196.33±52.52）相比，miR-802 agomir组HUVEC细胞迁移数量（334.67± 29.02）显著增加，miR-802 antagomir组HUVEC细胞迁移数量（137.33±14.64）显著减少，差异均有统计学意义（P均＜0.05），这提示miR-802可能可以增强HUVEC细胞的迁移能力。

注：*P＜0.05，**P＜0.01
图2 miR-802对各组HUVEC细胞成管能力的影响A NC组HUVEC细胞成管情况×10 B miR-802 agomir组HUVEC细胞成管情况×10 C miR-802 antagomir组HUVEC细胞成管情况×10 D各组HUVEC细胞中新生小管数量比较
注：*P＜0.05，**P＜0.01
图3 miR-802对各组HUVEC细胞迁移能力的影响A NC组HUVEC细胞迁移情况 DAPI染色×10 B miR-802 agomir组HUVEC细胞迁移情况 DAPI染色×10 C miR-802 antagomir组HUVEC细胞迁移情况 DAPI染色×10 D各组HUVEC细胞迁移数量比较
2.3 miR-802对SMMC-7721细胞中VEGF生成量的影响
如图4所示，与NC组相比，miR-802 agomir
组SMMC-7721细胞中VEGF生成量增加。

2.4 miR-802对PI3K/Akt信号通路的影响
如图5所示，与NC组相比，miR-802 agomir
agomir组
agomir组
antagomir
组
antagomir
组
**
**
新
生
小
管
数
量
迁
移
细
胞
数
量
A
C
B
A
C
B
组SMMC-7721细胞中p-PI3K 、p-Akt 、Akt 和VEGF 蛋白表达水平均显著升高，差异均有统计学意义
（P 均＜0.05）。

注：Merge 为VEGF ＋DAPI 图片重叠后的合成图
图4 2组细胞中VEGF 生成量的免疫荧光检测图
注：*P ＜0.05，**P ＜0.01
图5 NC 组和miR-802 agomir 组中p-PI3K 、PI3K 、p-Akt 、Akt 和VEGF 蛋白表达水平比较 A p-PI3K 、PI3K 、p-Akt 、Akt 和VEGF 的蛋白电泳图 B p-PI3K 蛋白表达水平 C PI3K 蛋白表达水平 D p-Akt 蛋白表达水平 E Akt 蛋白表达水平 F VEGF 蛋白表达水平
3 讨论
研究表明，miR-802在HBV 相关的HCC 组织中表达上调，过表达miR-802可以通过调节SMARCE1表达促进HBV DNA 复制[8]。

另有研究
表明，过表达miR-802可以通过抑制HCC 细胞中锌指蛋白521（ZNF521）的表达，促进Runt 相关转录因子2（Runx2）转录，增强Akt 磷酸化途径，从而促进HCC 细胞增殖和迁移[9]。

本研究发现
VEGF
NC 组
miR-802 agomir 组
DAPI
Merge
NC 组miR-802 agomir 组
p -P I 3K 相对表达量
p -
A k t 相对表达量
p-PI3K
85 000
60 00060 00060 00046 00036 000110 000PI3K p-Akt Akt VEGF GAPDH
A k t 相对表达量
V E G F 相对表达量
P I 3K 相对表达量
miR-802可通过调控PI3K/Akt信号通路促进HCC 的发生和进展，这与上述研究结果相符。

血管新生是肿瘤生长、转移和扩散的必要条件[11]，而VEGF与其受体结合后可促进血管新生[12]。

研究表明，miRNA可能可以发挥促进血管新生的作用，如过表达miR-145-5p可下调IL-1β和诱导型一氧化氮合酶的表达，上调趋化因子配体17和精氨酸酶-1蛋白的表达，促进HUVEC细胞增殖、迁移和侵袭，从而促进血管新生[13]。

另有研究表明，miR-378可通过抑制SuFu和TUSC2以促进血管新生[14]，但目前关于miR-802与血管新生关联的报道较少。

本研究发现，过表达miR-802可显著增加SMMC-7721细胞中VEGF生成量；使用过表达miR-802的SMMC-7721细胞上清液处理HUVEC细胞24 h后，HUVEC细胞的成管能力及迁移能力均增强。

PI3K/Akt信号通路是参与血管新生的重要通路。

Feng等[15]的研究发现，上调miR-26b表达可显著抑制SMMC-7721细胞中PI3K、p-Akt、NF-κB、基质金属蛋白酶-9和VEGF蛋白表达水平，从而抑制HCC细胞增殖。

miR-21通过调控PI3K/Akt 信号通路促进血管新生，从而促进HCC细胞增殖和转移[16]。

Gao等[17]的研究发现，miR-802在骨肉瘤中的表达水平升高，过表达miR-802可通过调控PI3K/Akt信号通路促进骨肉瘤细胞的迁移、侵袭和上皮间充质转化。

过表达miR-802也可通过调控PI3K/Akt信号通路以抑制HCC细胞中ZNF521的表达，从而促进HCC细胞增殖和迁移[9]。

本研究结果显示，与NC组相比，miR-802 agomir组中p-PI3K、p-Akt、Akt和VEGF蛋白表达水平均显著升高，这提示miR-802可能可以通过上调PI3K/Akt 信号通路表达，从而促进HCC的发生和进展。

综上所述，miR-802通过调控PI3K/Akt信号通路促进VEGF的释放，参与血管新生，从而促进HCC的发生和进展。

由此推测，miR-802可能可以成为HCC的潜在治疗靶点。

今后本课题组将进一步开展临床研究以验证上述研究结果。

参 考 文 献
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（收稿日期：2023-04-27）
（本文编辑：严靖）。