光谱分析技术hu

紫外可见吸收光谱的形成
▪ 按照量子力学原理，分子能态按一定的规律 跳跃式地变化，物质在入射光的照射下，分 子吸收光时，其能量的增加是不连续的，物 质只能吸收一定能量的光，吸收光的频率和 两个能级间的能量差要符合下列关系：
▪ E＝E2- E1＝h
▪ E1、E2分别表示初能态和终能态的能量，初能态与终能态 之间的能量差愈大，则所吸收的光的频率愈高（即波长愈短
第一节 朗伯-比尔（Lambert-beer）
1.1 朗伯-比尔（Lambert-beer）光吸收定律：
Alg 1 lg I0
T
It
✓A：吸光度，又称光密度“OD”
✓T：透光度， T＝I / I0 ✓I0：照射到吸收池上的光强 ✓It：透过吸收池的光强。
1.2 吸光度、溶液浓度及液层厚度之间关系：
➢ 有色溶液对可见光线有选择性的吸收作用，有些无色溶
液，所含物质可以吸收特定波长的紫外线或红外线。
➢ 不同物质由于其分子结构不同，对不同波长光线的吸收能力
也不同，因此，每种物质都具有其特异的吸收光谱。
➢ 利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的吸收光谱， 利用此吸收光谱对物质进行定性定量分析和物质结构分析的
▪ ⑴曲线上“A”处称最大吸收峰，它所对应的波长称 最大吸收波长，以λmax表示。
▪ ⑵曲线上“B”处有一谷，称最小吸收，它所对应的 波长，所对应的波长，称最小吸收波长，以λmin 表 示。
▪ ⑶曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”，称肩峰 。
▪ ⑷在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上“D”处， 吸收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。
2.1.2 双光束分光光度计
➢ 双光束分光光度计是目前发展最快，应用最为普遍的一种。
既可直接读数，又可扫描图谱。
➢ 因为单色光能在很短的时间内交替通过空白和 样品溶液，所以可以减小因光源强度不稳带来 的误差。
➢ 双光束分光光度计在测量过程中不需移动吸收 池，可在随意改变波长的同时记录吸光度。其 操作简单，测量快速，自动化程度高。
常用的术语
▪ 紫外光谱中常用的术语有发色团、助色团、增色效应和减色 效应。
▪ 发色团：凡是与饱和碳氢化合物连接能引起n→π*、π→π* 、 n→σ* 等电子跃迁的基团称为发色团。例如：C＝C、C＝ O等发色团。
▪ 助色团：助色团是一些具有非共价键的基团（如OH、NH2 、SH等）。这些基团在波长＞200 nm处没有吸收，当它与 发色团相连接时，使发色团的吸收带向长波移动，称为红移 （或浅色效应），红移的同时吸收带的强度增加。若助色团 与发色团相连接，产生 n→π* 跃迁，使吸收波长向短波移 动，称为兰移（或深色效应）。
可作为追踪化学反应和反应动力学研究的重要工
具。
➢随着仪器的改进和计算机的应用，又出现 了许多新的测量技术，如1～4阶导数光谱 测量技术、三波长分光光度法、速率分析 或动力学分析等。
2.2 分光光度计基本结构
光源 单色器 吸收池 检测器 显示系统 2.2.1 电光源系统 2.2.2 样品室 2.2.3 单色器
▪ λmax是化合物中电子能级跃迁时吸收的特征 波长，不同物质有不同的最大吸收峰，所以 它对鉴定化合物极为重要。吸收光谱中， λmax、λmin、肩峰以及整个吸收光谱的形状 决定于物质的性质，其特征随物质的结构而 异，所以是物质定性的依据。
▪ 测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与已 知标准的紫外光谱图相对照，对照时须注意 测定的条件，如溶剂、浓度等。
▪ 增色效应（hyperchromic effect）:核酸变性或降 解，使得DNA或RNA溶液对紫外光的吸收明显增加 ，即 ε值（吸光系数或称消光系数）显著升高，此 现象称为增色效应。此效应是由于碱基之间电子相 互作用的改变所致，通常在260nm处测量。
▪ 减色效应（hypochromic effect）:在一定的条件 下，变性的核酸又可以复性，此时ε值又明显减少， 回复到原来的核酸分子ε值较低的水平，即此时 DNA或RNA溶液的紫外光吸收显著降低，此现象称 为减色效应，此效应也是由于碱基之间电子相互作 用的变化所引起的，通常在260nm条件下测量。
），反之则所吸收的光的频率愈低（即波长愈长）。由于吸
收是不连续的，因此在光的一定部位出现一系列吸收暗带。
因为分子转动、振动及电子能级跃迁的能量差别较大，因此
，它们的吸收光谱出现在不同的光谱区域。分子转动能级级 差小，△E＜0.05电子伏特（ev），分子转动光谱的吸收出 现在远红外或微波区。振动能级纵间的差别较大， E＝0.05 ～1.0 ev，振动光谱出现在中红外区。电子能级的级差更大 ， E＝1～20 ev，所以由电子跃迁得到的光谱出现在可见、 紫外或波长更短的光谱区。
✓原子吸收光谱仪的光源 主要采用空心阴极灯。 空心阴极灯的结构如左 图所示。
1－紫外玻璃窗口； 2－石英窗口，3－密封 4－玻璃套，5－云母屏蔽； 6－阳极；7－阴极； 8－支架；9－管座， 10－连接管脚
2.2.2 样品室 ➢紫外-可见分光光度计和荧光分光光度计的
样品室内装有比色皿，可以是玻璃或石英 比色皿。
✓ 硅碳棒是由碳化硅烧结而成的实心捧，工作温度 达1200～1500℃。对于长波，其辐射效率高于能 斯特灯，其使用波长范围比能斯特灯宽，发光面 大，操作方便、廉价。
岛津荧光分光光度计 RF-5301PC
荧光分光光度计在越来越多的领域发挥着巨大的作用，比如生命科学中 的定性定量分析，化学中的光化学反应的研究，食品中的残留农药检测 和环境中大气、水质、土壤的污染评估。相比于吸光度法，荧光法的灵 敏度更高，选择性也更好，把激发光、荧光波长相结合，可以测定混合 物。RF-5301PC作为新一代的荧光分光光度计具有高水平的性价比和功 能强大的软件，从日常分析到科学研究都发挥了极大的作用
33单色器单色器211211单光束分光光度计单光束分光光度计212212双光束分光光度计双光束分光光度计213213双波长分光光度计双波长分光光度计214214光多道二极管阵列检浏分光光度计光多道二极管阵列检浏分光光度计211211单光束分光光度计单光束分光光度计早期的分光光度计都是单光束的例如751型75lg型有些仍为手动操作即固定在某一波长固定在某一波长分别测量比较样品空白或参比液的透光率或吸光度操作比较费时要求光源和检测器的供电电压稳定性高用于绘制吸收光谱图时很不方便但其光路简单能量损失小适用于物质的定量分析
▪ 可见光、紫外光吸收光谱，是由于分子中联 系较松散的价电子被激发产生跃迁从而吸收 光辐射能量形成的，即分子由基态变为激发 态，电子由一个低能级的轨道（即成键轨道 ），吸收了光能量跃迁到高能级轨道（称为 反键轨道）。
▪ 若逐渐改变照射某物质的入射光的波长，并 测定物质对各种波长光的吸收程度（吸光度 “A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光 度“T”），以波长λ作横坐标，“A”或 “T”为纵座标，画出连续的“A~λ”或 “T~λ”曲线，即为该物质的吸收光谱曲线。
2.1.1 单光束分光光度计
➢ 早期的分光光度计都是单光束的，例如751型、75lG型，有些仍为手
动操作，即固定在某一波长，分别测量比较样品、空白或参比
液的透光率或吸光度，操作比较费时，要求光源和检测器的供电电压 稳定性高，用于绘制吸收光谱图时很不方便，但其光路简单，能量损 失小，适用于物质的定量分析。
▪ 常用标准的紫处吸收光谱是萨德勒研究实验 公司编制的“Sadtler”紫外标准图谱集，到 七十年代末为止已收集28585个化合物紫外
光谱图，此外还有药物和非极性溶剂紫外光 谱图2000多幅。
▪ 由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很 宽，不象红外光谱是许多指纹峰，所以在用 紫外吸收光谱进行化合物定性鉴定时，应注 意：化合物相同，其紫外光谱应完全相同； 但是紫外光谱相同不一定化合物就相同，可 能仅是存在某些相同的发色团或基团，因此 在鉴定时应与红外光谱相结合。
来的误差，主要用于存在干扰组分的样品、浑浊 样品和多组分混合样品的测定。但仪器价格昂 贵，体积较大。
2.1.4 光多道二极管阵列检浏分光光度计
➢ 光多道二极管阵列检测分光光度计是一种具有全新光路系
统的仪器。具有光谱响应宽、数字化扫描准确、 性能比较稳定等优点。
➢ 由于全部波长同时被检测，而且光二极管的响应很快，一 般可在0.1s的极短时间内获得190～820nm范围的全光光谱，
光谱线半宽度要窄，以利于提高仪器的灵敏度。
✓ 能斯特灯是由铈、锆、钍和钇等氧化物烧结而成 的长约2cm、直径约1mm的实心或空心棒组成， 工作温度可达1300～1700℃，其发射的波长范围 约为1～30μm，它的寿命较长、稳定性好。对短 波范围辐射效率优于硅碳棒，但价格较贵，操作 不如硅碳棒方便。
➢可见光范围用玻璃比色皿。 ➢紫外光范围用石英比色皿。 ➢原子吸收光谱仪的样品室为原子化器，常
用的原子化器有火焰和石墨炉。
2.2.3 单色器
➢凡能把复合光分解为按波长顺序排列的单 色光，并能通过出射狭缝分离出某一波长 单色光的仪器，称为单色器。
➢分光光度计中所用的单色器有两种类型： 棱镜单色器和光栅单色器。
✓ 出光狭缝是单色光的出口。它只让光谱带中额定波 长的光从狭缝含量时，为准确起见，仍宜用固定波长测量方式。
2.1.3 双波长分光光度计
➢ 双波长分光光度计是将光源发出的光分成两束，分 别进人各自的单色器，获得两束波长可任意调节的单 色光，然后交替照射到同一个吸收池，到达同一检 测器，测得在两个波长处的吸光度差值△A， △A与被测组分的量成正比。
➢ 此法可消除参比和样品溶液组成不一致及比色池不匹配带
➢ 单色器主要部分都是由入光狭缝、出光狭缝、色散 元件、准直镜以及附属机械装置所组成。
✓ 入光狭缝起着限制复合光进入单色器的作用；
✓ 色散元件起着把复合光分解为单色光的作用；
✓ 准直镜的作用一是把来自入光狭缝的光转变为平行 光，投射到色散元件上，作用二是把来自色散元件 的平行光束聚焦于出光狭缝上，形成光谱像；
光谱分析技术hu
▪ 光是电磁波，可用波长“λ”表示，电磁波谱是由不 同性质的连续波长的光谱所组成，对于生物化学来 说，最重要的波长区域是可见光和紫外光。
▪ 光的波长是二个相邻的波峰之间的距离。
▪ 光的传播是由相互垂直的电场分量“E”和磁场分量 “H”所构成。
▪ λ＝C/ν
▪ λ——波长 C——光速 ν——频率，单位时间通过 一个定点的波数。
方法，称为分光光度法或分光光度技术，使用的仪器称 为分光光度计。
➢ 分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广。
第二章 光谱分析技术
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节
朗伯-比尔（Lambert-beer）光吸收定律 分光光度计基本结构 光度法的误差 分光光度法的应用 原子吸收分光光度法 荧光分析法 散射光谱分析法
A =εbC
✓ ε：摩尔吸光系数或克分子吸光系数，L·mol-1·cm-1 ✓ b：样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收地。 ✓ C：样品浓度，mol·L-1 ✓ 摩尔吸光系数ε是物质对某波长的光的吸收能力的量度。ε越大，吸收光
的能力越强，相应的分光度法测定的灵敏度就越高。ε值越大，
说明电子跃迁的几率大，通常 ε＝10～105：一般认为ε＞ 104为强吸收；ε ＝103～104 为较强吸收；ε＜ 102 为弱吸收，此时分光光度法不灵敏。
2.2.1 电光源系统
➢ 可见光源：钨/卤钨灯(320-2500nm)，卤钨灯更好。 ➢ 紫外光源：氢灯和氘灯发光二极管，氘灯(160-
375nm)，氘灯产生的光谱强度比氢灯大3～5倍，而 且寿命也比氢灯长。
➢ 红外光源：碘钨灯(近红外)、能斯持灯(中红外)、汞 灯(远红外)。
➢ 线光源：空心阴极灯/金属(汞/钠)蒸汽灯 ➢ 激光光源：固体/气体/染料激光器 ➢ 荧光分光光度计多用球形氙灯 ➢ 原子吸收光谱仪多用原子光谱灯，要求辐射的原子
1.3 应用朗伯-比耳定律的条件：
✓ 入射光波长应为λmax，且单色性好； ✓ 被测溶液具有均匀性、非散射性(不浑浊，也不呈胶体)； ✓ 被测物质的浓度应在一定范围内； ✓ 朗伯-比耳定律不仅适用于可见光，也适用于红外光和紫外光； ✓ 朗伯-比耳定律不仅适用于均匀非散射的液体，也适用于固体
和气体。 ✓ 因此，它是各类吸光光度法定量的依据，用途很广。
第二节 分光光度计基本结构
2.1 常见的分光光度计类型 2.2 分光光度计基本结构
2.2.1 电光源系统 2.2.2 样品室 2.2.3 单色器
2.1 常见的分光光度计类型
2.1.1 单光束分光光度计 2.1.2 双光束分光光度计 2.1.3 双波长分光光度计 2.1.4 光多道二极管阵列检浏分光光度计