13种呼吸道病原体多重检测试剂的性能验证

ＤＯＩ：１０．１３６０２／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｃｌｓ．２０２０．０６．２０·质量管理研究·
１３种呼吸道病原体多重检测试剂的性能验证
吕园，邬兰，张秀梅，徐秋爽，张健，李萍，王海鹏，俞杨（南京市第一医院南京医科大学附属南京医院核医学科实验诊断部，南京２１０００６）
摘要：目的　对１３种呼吸道病原体多重检测试剂盒（ＰＣＲ毛细管电泳片段分析法）进行性能验证。

方法　参照ＣＮＡＳ ＧＬ０３９：
２０１９《分子诊断检验程序性能验证指南》和厂商性能确认方法，用包含１３种病原体（经参比方法测序法确认）的临床咽拭子样本进行方法符合率验证，用国家参考品、慢病毒载体和质粒混合样本（包含所有１３种病原体）进行检出限验证，用包含其他７
种病原体的临床咽拭子样本进行交叉反应验证，用分别添加终浓度为５％的全血、１．２ｍｇ／ｍＬ的硫酸沙丁胺醇的临床咽拭子样本进行抗干扰能力验证，以试剂盒说明书的性能指标作为结果判断标准。

结果　包含１３种病原体的临床咽拭子样本经本试剂盒检测，各自出现所检测病原体的特征峰，满足方法符合率的验证要求；以国家参考品、慢病毒载体和质粒混合后的样品重复检测２０次，对应的１３种病原体均为阳性，满足检出限的验证要求；包含其他７种病原体的临床咽拭子样本均未出现本试剂盒所检测的病原体特征峰，满足交叉反应的验证要求；分别添加终浓度为５％的全血、１．２ｍｇ／ｍＬ的硫酸沙丁胺醇的临床咽拭子样本检测结果与未添加干扰物质的对照组检测结果相同，满足抗干扰能力的验证要求。

结论　１３种呼吸道病原体多重检测试剂盒各项性能验证参数与厂商声明的标准一致，可正式应用于临床检测。

关键词：十三种呼吸道病原体；聚合酶链反应；毛细管电泳；性能验证
中图分类号：Ｒ４４６．５ 文献标志码：Ａ
性能验证指使用某特定检测试剂或系统的实验
室按照所提供的试剂盒或检测系统说明书使用时，
能复现生产厂家所宣称的检测性能。

中国合格评定
国家认可委员会（ＣＮＡＳ）２０１９年２月１５日发布并
实施ＣＮＡＳ ＧＬ０３９：２０１９《分子诊断检验程序性能验
证指南》［１］。

本研究参照其要求，以１３种呼吸道病
原体多重检测试剂盒（ＰＣＲ毛细电泳片段分析法）
说明书中的性能指标作为验证结果的判断标准，进
行方法符合率、检出限、交叉反应和抗干扰能力４个
方面的性能验证。

１　对象与方法
１．１　对象　（１）方法符合率样本：经测序确认的分
别包含１３种病原体（甲型流感病毒、腺病毒、博卡
病毒、鼻病毒、甲型流感病毒Ｈ１Ｎ１、副流感病毒、衣
原体、偏肺病毒、乙型流感病毒、肺炎支原体、季节性
Ｈ
３Ｎ
２病毒、
冠状病毒、呼吸道合胞病毒）的临床咽拭
子样本。

（２）检出限样本：定值标准物质样本［参考品，由国家参考品（中国食品药品检定研究院）、慢病毒载体和质粒混合而成，包含所有１３种病原体］。

（３）交叉反应样本：经测序确认的、包含７种病原体（包括表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、解脲支原体、巨细胞病毒、ＥＢ病毒），但不包含待测试剂盒１３种病原体的临床咽拭子样本。

（４）抗干扰能力验证样本：经测序确认的弱阳性临床咽拭子样本２例（副流感病毒ＨＰＩＶ和冠状病毒ＨＣＯＶ）。

测序工作委托上海生工生物公司完成，使用Ｓａｎｇｅｒ测序方法。

测序仪器为ＡＢＩ３７３０ｘＬ；测序试剂为赛默飞ＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１
ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ；测序使用３７３０默认的测序参数（ＳｔａｎｄａｒｄｒｅａｄＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＰＯＰ７分离胶、
３６ｃｍ毛细管）；将测序结果在ＮＣＢＩ网站上作ＢＬＡＳＴ对比分析。

１．２　试剂和仪器　核酸提取或纯化试剂（宁波海尔施公司）；１３种呼吸道病原体多重检测试剂盒（ＰＣＲ
毛细电泳片段分析法，宁波海尔施公司）；参考品［批号１０４１９０１０７００１，由国家参考品（中国食品药品检定研究院，３７００００６ ２０１５０１）、慢病毒载体和质粒混合而成，宁波海尔施公司］；ＳＬＡ ３２全自动核酸提取仪（台湾圆点奈米技术公司），Ａ３００ＰＣＲ扩增仪（杭州朗基公司），ＡＢＩ３５００Ｄｘ基因分析仪（英潍捷基公司）。

１．３　临床咽拭子样本采集及核酸提取　使用专用的咽拭子取样后迅速放入装有３ｍＬ采样液的采样
管中，旋紧管盖。

采样液中包含蛋白质稳定剂、阻止细菌和真菌生长的抗生素、缓冲液。

将采样管置于
基金项目：南京医科大学科技发展基金重点项目（２０１６ＮＪＭＵＺＤ０４４）。

作者简介：吕园，１９８７年生，女，主管技师，博士，主要从事分子诊断工作。

通信作者：俞杨，副主任技师，博士，Ｅ ｍａｉｌ：ｂｏｈｅｍｉａ０００＠１６３．ｃｏｍ。

涡旋混匀仪上充分涡旋１０ｓ，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的细胞等。

根据核酸提取试剂的要求，吸取３００μＬ样本并加入ＲＴ ＰＣＲ内参，用ＳＬＡ ３２核酸提取仪进行核酸提取和纯化。

１．４　ＰＣＲ扩增　ＰＣＲ扩增体系共２０μＬ，包括１４μＬＰＣＲ反应液，１μＬＰＣＲ酶液，５μＬ核酸。

在Ａ３００ＰＣＲ扩增仪上进行ＰＣＲ扩增，反应条件：２５℃５ｍｉｎ；５０℃１５ｍｉｎ；９５℃２ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，
６５℃３０ｓ，７２℃６０ｓ（６５℃开始，以１℃梯度降落退火，６个循环）；９４℃３０ｓ，６０℃３０ｓ，７２℃６０ｓ
（２９个循环）；７２℃１０ｍｉｎ。

１．５　ＰＣＲ产物的毛细管电泳分离　使用标准品（厂家提供）测量毛细管电泳平台中所有毛细管的荧光
信号强度。

毛细管电泳体系为９μＬＡＢＭａｓｔｅｒＭｉｘ＋
１μＬＰＣＲ产物，用ＡＢＩ３５００Ｄｘ基因分析仪，选择“Ｆｒａｇｍｅｎｔ”电泳方法，进行ＰＣＲ产物毛细管电泳分
离。

病原体特征峰为阳性时，检测结果判定为该病原体阳性。

未出现病原体特征峰或病原体特征峰为阴性时，如果出现人ＤＮＡ内参峰、人ＲＮＡ内参峰和
ＲＴ ＰＣＲ内参峰且３个内参峰高于毛细管标准品高峰（ＰｏｓＳ）时，则检测结果判定为阴性；如果未出现人ＤＮＡ内参峰和／或人ＲＮＡ内参峰或峰高低于
ＰｏｓＳ峰高时，则考虑样本取样或保存不当，应重新取样进行提取检测；如果未出现ＲＴ ＰＣＲ内参峰或
峰高低于ＰｏｓＳ峰高时，则考虑检测失败，应重新对样本进行提取检测。

病原体特征峰为灰区时，需从样本提取开始重新检测；灰区样本重新检测结果若位于灰区或阳性，则判定为该病原体阳性；重复检测结果若为阴性，则判定为该病原体阴性。

２　结果
２．１　方法符合率　参比方法（测序）确认的２０例临床咽拭子样本（阳性样本１５例，阴性样本５例），按
照样本检测程序，用候选方法（待测试剂盒）和参比方法（测序）平行检测。

结果显示，２种方法总符合率为１００％，见表１。

表１　候选方法和参比方法结果比对
样品编号候选方法参比方法
１肺炎支原体ＭＰ肺炎支原体ＭＰ
２甲型流感病毒Ｈ１Ｎ１甲型流感病毒Ｈ１Ｎ１
３季节性Ｈ３Ｎ２病毒季节性Ｈ３Ｎ２病毒
４腺病毒ＨＡＤＶ腺病毒ＨＡＤＶ
５博卡病毒Ｂｏｃａ博卡病毒Ｂｏｃａ
６鼻病毒ＨＲＶ鼻病毒ＨＲＶ
７副流感病毒ＨＰＩＶ副流感病毒ＨＰＩＶ（１型）
８副流感病毒ＨＰＩＶ副流感病毒ＨＰＩＶ（２型）
９衣原体Ｃｈ衣原体Ｃｈ
１０偏肺病毒ＨＭＰＶ偏肺病毒ＨＭＰＶ
１１乙型流感病毒ＩｎｆＢ乙型流感病毒ＩｎｆＢ
１２冠状病毒ＨＣＯＶ冠状病毒ＨＣＯＶ（ＯＣ４３、ＨＫＵ１）
１３冠状病毒ＨＣＯＶ冠状病毒ＨＣＯＶ（２２９Ｅ、ＮＬ６３）
１４呼吸道合胞病毒ＨＲＳＶ呼吸道合胞病毒ＨＲＳＶ（Ａ组）
１５呼吸道合胞病毒ＨＲＳＶ呼吸道合胞病毒ＨＲＳＶ（Ｂ组）
１６阴性阴性
１７阴性阴性
１８阴性阴性
１９阴性阴性
２０阴性阴性
注：２号样本甲型流感病毒Ｈ１Ｎ１包含甲型流感病毒通用型靶点和甲型流感病毒Ｈ１Ｎ１亚型靶点。

３号样本季节性Ｈ３Ｎ２病毒包含甲型流感病毒通用型靶点和季节性Ｈ３Ｎ２亚型靶点。

７～８号、１２～１３号、１４～１５号样本分别为不同亚型的副流感病毒、冠状病毒和呼吸道合胞病毒，
但本试剂盒无法区分具体亚型。

２．２　检出限　定值标准物质样本由国家参考品（中国食品药品检定研究院）、慢病毒载体和质粒混合
而成，包含所有１３种病原体，见表２。

在不同批内对该浓度样本进行２０次重复测定（测定５ｄ，每天测定４份样本）。

待测试剂盒检测结果阳性率为１００％，故试剂盒能够达到说明书声称的最低检出限。

表２　检出限
病原体
说明书规定的检出限
甲型流感病毒
０．０９８ＴＣＩＤ５０／ｍＬ甲型流感病毒Ｈ１
Ｎ１
（
２００９）０．０９８ＴＣＩＤ５０／ｍＬ季节性Ｈ３
Ｎ２
病毒
０．１ＴＣＩＤ５０／ｍＬ乙型流感病毒（
Ｖｉｃｔｏｒｉａ和Ｙａｍａｇａｔａ）２．０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ呼吸道合胞病毒（Ａ组和Ｂ组）０．４ＴＣＩＤ５０／ｍＬ副流感病毒（１型、２型、３型和４型）０．４ＴＣＩＤ５０／ｍＬ冠状病毒（ＯＣ４３、ＨＫＵ１、ＮＬ６３、２２９Ｅ）０．３ＴＣＩＤ５０／ｍＬ鼻病毒０．１５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ偏肺病毒０．３５ＴＣＩＤ５０／ｍＬ博卡病毒５０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ腺病毒２０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ或１ＴＣＩＤ
５０
／ｍＬ
衣原体５０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ肺炎支原体
３０００ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ
２．３　交叉反应　经测序确认的包含其他７种病原体（包括表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、解脲支原体、巨细胞病毒、ＥＢ病毒）但不包含待测１３种病原体的临床咽拭子样本，用待测试剂盒检测５次，检测结果阴性率为１００％，故试剂盒交叉反应验证合格。

２．４　抗干扰能力　经测序确认的弱阳性临床咽拭子样本２例（副流感病毒ＨＰＩＶ和冠状病毒
ＨＣＯＶ），分别加入２组干扰物质溶液（５％的全血和１．２ｍｇ／ｍＬ硫酸沙丁胺醇；终浓度为厂家声明的最高抗干扰浓度），对照组加入等量的溶剂。

全血处理组、药物处理组和对照组分别用待测试剂盒检测３次，结果符合率达到１００％，故试剂盒抗干扰能力验证合格。

３　讨论
２０１９
版指南用“检出限”代替旧版“测定下限”的概念。

检出限一般指标本中一种分析物可被检出的最低含量，这一分析物含量可能不是量化的具体浓度［２
］。

本试剂盒规定的检出限样本的滴度：甲型流感病毒Ｈ１
Ｎ１
为０．０９８ＴＣＩＤ５０
／ｍＬ，由国家参考品
Ｓ５稀释１００００倍得到；
季节性Ｈ３
Ｎ２
病毒为０．１ＴＣＩＤ５０
／ｍＬ，
由国家参考品Ｓ４稀释１００００倍得到；乙型流感病毒为２．０ＴＣＩＤ５０
／ｍＬ，
由国家参考品Ｓ２稀释１０００倍得到；呼吸道合胞病毒、副流感病毒、冠状病毒、鼻病毒和偏肺病毒检测片段分别构建成慢病毒后，参照国家参考品进行ＴＣＩＤ５０
标化定量，并稀释至各自检出限的滴度；博卡病毒、腺病毒、支原体和衣原体检出限样本为质粒稀释至各自检出限的
滴度。

２０１９版指南用“交叉反应”代替旧版“特异性”的概念，明确了交叉反应应验证与检测对象可能存在交叉反应的核酸物质对检测的影响。

对于病原体核酸检测来说，干扰现象主要指与检测对象核酸序列具有同源性、易引起相同或相似临床症状的病原体核酸。

在本次性能验证过程中，我们根据说明书选取表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌、解脲支原体、巨细胞病毒、ＥＢ病毒作为干扰病原体，这些病原体与待测病原体或具有同源性（如肺炎支原体和解脲支原体）、或引起相同或相似临床症状（呼吸道症状）。

２０１９版指南延用旧版“
抗干扰能力”的概念。

抗干扰能力是指临床样本中可能存在的干扰物质对检测结果不产生影响的能力。

本次性能验证过程中，我们选择１．２ｍｇ／ｍＬ硫酸沙丁胺醇和５％的血液作为干扰物质，因为硫酸沙丁胺醇是临床呼吸道疾病常见药物，而临床咽拭子样本中经常会掺杂一些血液，我们在实验室模拟了临床常见情况，结果证实试剂盒抗干扰能力合格。

４　参考文献
［１］中国合格评定国家认可委员会（ＣＮＡＳ）．ＣＮＡＳ ＧＬ０３９分子诊断
检验程序性能验证指南［
Ｓ］．北京：ＣＮＡＳ，２０１９．［２］
国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会等．药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南［Ｓ］．北京：国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会，２０１５．
（收稿日期：
２０２０ ０３ ２５
）（本文编辑：
刘群）。