高耐受性醋酸菌的筛选及发酵特性研究

高耐受性醋酸菌的筛选及发酵特性研究
陈洋;汪超;高冰;李冬生;徐宁;胡勇
【摘要】从工业醋醅中分离出5株耐乙醇、耐高温的产醋酸菌株,利用生理生化试验和16S rDNA同源序列分析,初步认定其为巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus).通过对其耐乙醇、耐高温发酵特性的研究,发现菌株FY4可耐受体积分数为12％的乙醇和43℃高温,在30℃和体积分数10％乙醇条件下产酸量达到最高,为61.2 g/L.在10L发酵罐试验中,菌株FY4的产酸量始终高于醋酸菌AS1.41,在37℃和体积分数10％乙醇条件下,菌株FY4产酸量达到42.2 g/L,而在此条件下工业菌株AS1.41几乎停止产酸.结果表明菌株FY4具有高耐受性,可产生大量的醋酸,在工业生产中具有潜在应用价值.
【期刊名称】《中国酿造》
【年(卷),期】2015(034)012
【总页数】6页(P28-33)
【关键词】巴氏醋杆菌;耐高温;耐乙醇;筛选;深层发酵
【作者】陈洋;汪超;高冰;李冬生;徐宁;胡勇
【作者单位】湖北工业大学食品与制药学院,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北省食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉430068;湖北工业大学食品与制药学院,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北省食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉430068;湖北工业大学食品与制药学院,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北省食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉430068;湖北工业大学食品与制药学院,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北省食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉430068;湖北工业大学食品
与制药学院,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北省食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉430068;湖北工业大学食品与制药学院,工业发酵湖北省协同创新中心,湖北省
食品发酵工程技术研究中心,湖北武汉430068
【正文语种】中文
【中图分类】TS264.2
醋酸杆菌属（Acetobacter）和葡萄糖氧化杆菌属（G1uconobocter）是较为常
用的醋酸菌属，前者主要将酒精氧化为醋酸，用于酿醋工业，后者主要将葡萄糖氧化为葡萄糖酸［1-3］。

醋酸菌不仅应用于生产葡萄糖酸、食醋、山梨酸，还是乙醇和糖类氧化的生化反应的最重要研究对象。

目前，醋酸菌在维生素C制造工业、食醋酿造工业上都发挥着重要作用［4-5］。

醋酸菌是酿醋工业的核心菌种。

在酿醋工业中，最常用的醋酸菌是醋杆菌属（Acetobacteer），如菌种AS1.41广泛用于中国工业醋酸发酵，其适合的发酵
温度为28～33℃。

现代酿醋工业多采用深层发酵工艺，在此过程中，初始乙醇含量和温度是发酵的关键因素。

乙醇是醋酸发酵的底物，并为醋酸菌生长代谢提供能量，当乙醇含量超过40 g/L时醋酸菌的生长会受到抑制［6］。

乙醇主要影响甚
至改变细胞膜的组织、通透性和质子流，导致细胞生长缓慢和产酸量低［7］。

另一方面，温度是影响醋酸菌生长和代谢的重要因素，是醋酸菌氧化酒精生成乙酸的必要条件。

因为发酵过程是一个热积累的过程，所以随着发酵的进行，培养温度会逐渐超过醋酸菌的最适生长温度（30℃），温度过高会使醋酸发酵的基本酶变性，细胞膜损伤，导致细胞分散［8］。

在深层发酵酿醋工艺中，初始乙醇体积分数一般＞6%，这对醋酸菌的耐乙醇性能
具有较大的考验；在夏季高温时，控制酿醋温度为30℃需要花费大量的冷却成本，要克服以上问题，就需要筛选同时能耐受高含量乙醇和高温的优良醋酸菌。

NDOYE B等［9］从撒哈拉以南非洲的热带产品中筛选出耐受42℃高温的醋酸菌，利用该菌种进行生产极大地降低了酿醋工业中的冷却成本问题；PERUMP ULI P
等［10］从斯里兰卡椰子汁醋中筛选出了一株耐40℃高温的巴氏醋杆菌，该菌种各项特性均适用于椰汁醋的酿造；孙文英等［11］用溴甲酚绿平板法从腐烂水果
中成功分离纯化出了一株耐体积分数9%乙醇、38℃高温的醋酸菌，该菌种有较好的应用价值。

本研究从传统发酵工艺的醋醅中筛选出同时具有耐高乙醇、耐高温和高产酸特性的醋酸菌，利用生理生化试验和16S rDNA同源序列分析，对其进行鉴定和发酵特
性研究。

同时，比较该菌种与工业菌种AS1.41在深层发酵中的发酵特性。

为醋酸菌的筛选提供较好的参考价值，为醋酸菌耐受性机理的研究做好铺垫工作。

1.1 材料与试剂
1.1.1 原料与试剂
发酵5～7 d的醋醅：凤阳醋厂醋醅和丹阳醋厂醋醅；醋酸菌AS1.41：中国典型
微生物保藏中心；无水乙醇、氢氧化钠（NaOH）、碳酸钙、酚酞、葡萄糖、琼脂、琼脂糖等（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；脱氧核糖核酸（deoxyribonuc1eic acid，DNA）提取试剂盒和胶回收试剂盒：上海生工生物工程技术服务有限公司。

1.1.2 培养基
耐乙醇筛选培养基：葡萄糖1%，酵母膏1%，MgSO40.01%，CaCO32%，琼脂2%，乙醇10%，pH自然。

富集培养基：葡萄糖1%，酵母膏1%，MgSO40.01%，pH自然。

液体培养基：葡萄糖2%，酵母粉2%，MgSO40.01%，乙醇4%。

碳酸钙平板培养基：葡萄糖1%，酵母膏1%，CaCO32%，琼脂2%。

1.2 仪器与设备
SW-CJ净化工作台：苏州净化设备有限公司；I8双光束紫外可见分光光度计：济
南海能仪器有限公司；DYY-7C电泳仪：北京市六一仪器厂；FY50高压蒸汽灭菌锅：上海三申医疗器械有限公司；D3024R台式高速冷冻微量离心机、TC-XP基
因扩增仪：杭州博日科技有限公司；FR-200A型凝胶成像仪：上海实验仪器厂有
限公司；SY-3010发酵罐：上海世远生物设备工程有限公司。

1.3 实验方法
1.3.1 菌株的富集培养
取醋醅各1g，加入100mL蒸馏水中，30℃培养3～5 d，取自然发酵液5 mL，
装入含有100 mL富集培养基的三角瓶中，30℃、180 r/min培养2 d，即可得到菌株的富集培养液。

1.3.2 菌株的定性试验
取含有菌体的富集培养液20 mL，以10 000 r/min的转速离心3 min，离心除去醋酸菌发酵液中的菌体，取上清液5 mL，用2.5 mo1/L的NaOH溶液中和至
pH 7.0，加入质量浓度50 g/L的氯化铁溶液4～6滴摇匀，观察溶液是否变成黄
褐色，再加热至沸腾，如出现红褐色沉淀则菌种确定为产醋酸菌［12］。

1.3.3 耐高乙醇、耐高温醋酸菌的初步筛选
取含有醋酸菌的富集培养液1 mL，用生理盐水依次稀释到10-6，分别取200 μL 10-5和10-6的稀释液涂布于含有体积分数10%乙醇的碳酸钙平板培养基上，30℃培养72 h，挑出产生透明圈的单个菌落，即可得到耐体积分数10%乙醇的菌株。

对筛选出的耐乙醇菌株进行耐高温研究。

1.3.4 生理生化试验
醋酸菌的生理生化试验参照伯杰士细菌鉴定手册（第八版）。

1.3.5 高耐受性菌株的鉴定
按照上海生工生物工程技术服务有限公司的SK1201-UNIQ-10柱式细菌基因组
DNA抽提试剂盒说明书提取5株高耐受性菌株的基因组DNA，作为模板。

进行
聚合酶链反应（po1ymerase chain reaction，PCR）扩增的16S rDNA引物为：27 f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCAG-3′）和1492 r（5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′）［13］。

电泳确定成功后，委托生工生物工程（上海）有限公司进行16S rDNA基因扩增序列测序。

测序后得到菌种的16S rRNA序列，将得到的16S rRNA序列通过BLAST程序提交，在美国国家生物技
术信息中心（nationa1 center of biotechno1ogy information，NCBI）在线数据库中进行同源序列检索。

将目标菌株和通过基于局部比对算法的搜索工具（basic 1oca1 a1ignment search too1，BLAST）检索到的与之具有较高的同源性菌株的16S rDNA序列作最大同源性比较分析，同时利用MEGA 5.0软件采用
相邻法（neighbor-joining，NJ）［14］构建系统发育树。

1.3.6 菌株发酵性能的测定
耐高温性能测定：对筛选出的所有单菌落富集培养，取对数期菌液4 mL加入含有96 mL液体培养基的500 mL锥形瓶中，每种单菌落分别在30℃、33℃、35℃、37℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃的摇床中培养，摇床转速180 r/min，每隔24 h测量菌种的生长量OD600nm值及产酸量。

耐乙醇性能测定：分别取对数期菌液4 mL加入含有96 mL液体培养基（分别含
有体积分数为2%、4%、6%、8%、10%、11%、12%、13%的乙醇）的500
mL锥形瓶中，30℃、180r/min的摇床中培养，每隔24h测量菌种的生长量
OD600nm值和产酸量。

1.3.7 发酵罐发酵
在10 L发酵罐中，比较菌株FY4与菌株AS1.41的发酵性能，温度设为30℃或37℃，初始乙醇浓度为4%、6%、8%、10%。

搅拌速度120 r/min，溶解氧浓度维持在22%。

每隔24 h测定产酸量。

1.3.8 菌株生物量及产酸量的测定
菌体密度：使用分光光度计在波长600 nm处测定吸光度值，用OD600nm值表
示菌体生物量。

产酸量测定：取1 mL菌株发酵液于250 mL三角瓶中，再加入50 mL蒸馏水，
加入2滴0.5%的酚酞作指示剂，然后用标定的0.1 mo1/L NaOH溶液滴定至浅
粉色，30 s不变色，即达到滴定终点，产酸量计算公式如下（以醋酸计）：
式中：V为发酵液样品滴定所有的NaOH溶液的体积，mL；V0为以空白培养基
为对照滴定所用NaOH溶液的体积，mL；CNaOH为NaOH溶液的物质量浓度，mo1/L；V样为样品的体积，mL；60为醋酸的分子质量，g/mo1。

2.1 高耐受性菌株的初步筛选
经过醋酸菌的定性试验，找出含有醋酸菌的富集培养液，将稀释后的富集培养液涂在含有体积分数10%乙醇的碳酸钙平板培养基上，30℃培养3 d，结果如图1所示。

由图1可知，有大量的单菌落产生了透明圈，这表明这些菌株在体积分数为10%
的乙醇培养基中仍然能生长及产酸。

透明圈越大表明菌株对乙醇的耐受能力越强。

因此，挑出透明圈上的菌种进行平板划线纯化，最终共筛出14株耐体积分数10%乙醇的菌株。

对筛选出的14株耐乙醇菌株进行耐高温筛选，结果如表1所示。

由表1可知，共筛出5株耐体积分数10%乙醇、耐37℃高温的菌株，分别命名为菌株FY1、FY2、FY3、FY4和FY5。

培养温度为30℃时，FY3和FY4可以在含有12%乙醇的培养基上正常生长，菌株FY1和FY5可在含有11%乙醇的培养基上正常生长。

培养温度为37℃时，FY4在含有体积分数12%乙醇的培养基上可微弱生长，菌株FY3和FY4在含有体积分数11%乙醇的培养基上可以正常生长，菌株
FY1和FY5在含有体积分数11%乙醇的培养基上几乎停止生长，菌株FY2仅可以
耐受体积分数为10%的乙醇。

因此，5株菌种中，菌株FY4的耐受性最强，它可以同时耐受体积分数11%的乙醇和37℃高温。

2.2 生理生化试验
为了初步确定5株菌种的种属关系，根据伯杰士细菌鉴定手册（第八版）中醋酸菌的生理生化特征的描述，对5株菌种的生理生化特征进行了测试，结果如表2所示。

由表2可知，5株菌种均为革兰氏阴性菌种，参照伯杰士细菌鉴定手册（第八版）对醋酸菌的分类，以巴氏醋杆菌AS1.41作参照菌株，由表2可以看出，5株菌种所测试的生理生化特征几乎均与巴氏醋杆菌AS1.41相同。

因此，初步认定5株菌种均为巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）。

2.3 菌株的鉴定结果
以提取的5株菌的DNA作为模板，采用引物：27 f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCAG-3′）和1492 r（5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图2所示。

由图2可知，通过PCR扩增后，可发现产物大小约为1 500 bp。

5株菌种的PCR产物经上海生工进行测序，全长为1 452 bp。

NCBI对比结果表明所有筛选的菌株均与巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）序列的相似性＞99%。

采用相邻法构建系统发育树，分析醋酸菌的分类位置。

结果如图3所示。

由图3可知，5株筛选所得的醋酸菌均显示与巴氏醋杆菌具有最亲近的关系。

5株筛选所得的醋酸菌与巴氏醋杆菌AS1.41的序列相似性＞99%（菌株FY1、FY2、FY3、FY4 和FY5与巴氏醋杆菌AS1.41的相似性分别为99.18%、99.23%、99.36%、99.32%和99.33%）。

因此，菌株FY1、FY2、FY3、FY4和FY5应归属于巴氏醋杆菌（Acetobacter pasteurianus）。

2.4 菌株生产性能测定
2.4.1 耐高温性能
考察温度对5株菌种的生长量OD600 nm和产酸量的影响，结果见图4。

由图4可知，随着温度从30℃升至43℃，菌株FY1的生长量OD600 nm值呈下降趋势，产酸量逐渐降低；当温度＜37℃，温度对菌株FY2、FY3、FY4和FY5
的生长量OD600 nm值和产酸量影响较小，当温度升至40℃时，菌株FY3和
FY4依然保持较高的生长及产酸性能，且在42℃时，菌株FY4依然保持较高的产酸量（33.5 g/L）；在44℃时，所有菌株几乎不生长，且无产酸量性能。

结果表明，FY4对温度的耐受性最强，其最高可耐受43℃的高温。

2.4.2 耐乙醇性能
考察不同体积分数的乙醇对5株菌的生长量OD600nm值和产酸量的影响，结果
见图5。

由图5可知，随着乙醇体积分数的增加，菌株生长量OD600nm值呈下降趋势，
菌种生长受到的抑制作用逐渐增强。

当乙醇体积分数为12%时，菌株FY1和FY2
停止生长，菌株FY3、FY4和FY5依然能够生长及产酸；菌株FY4的产酸量最大，在乙醇体积分数为10%时可达61.2 g/L。

综合图4和图5，结果表明，FY4是耐
高温和耐乙醇最强、产酸量最高的菌株，其可以耐受体积分数12%的乙醇，43℃
的高温。

2.5 发酵罐发酵
在工业发酵的过程中，初始乙醇体积分数通常低于10%，发酵的温度通常不超过37℃，因此，为了探究在复合条件下菌株FY4的发酵特性，本研究选取的温度为30℃和37℃，初始乙醇体积分数为4%、6%、8%、10%，在该条件下，对菌株FY4和菌株AS1.41在10 L发酵罐中的产酸性能进行比较，结果如图6所示。

由图6可知，菌株FY4的产酸量始终大于同一条件下菌株AS1.41的产酸量。

在30℃、10%乙醇的条件下，菌株FY4的产酸量是菌株AS1.41的2.86倍，菌株
FY4的产酸量达到最高为62.9 g/L；在37℃、体积分数10%的乙醇条件下，菌株FY4的产酸量虽然有所降低，但是仍然达到42.2 g/L，而菌株AS1.41几乎停止产酸。

结果表明，菌株FY4可以同时耐受高乙醇和高温，并产生大量的醋酸，该菌株在工业生产上有潜在的应用价值：即可以降低初始乙醇对菌种的抑制作用，还能减少高温季节酿醋时的冷却费用。

考虑到中国传统醋醅中蕴含着丰富的醋酸菌资源，运用高乙醇碳酸钙平板从醋醅中定向筛选耐乙醇醋酸菌，进一步研究其对温度的耐受性，初步筛选出具有耐乙醇、耐高温、高产醋特性的酸菌株。

对其进行生理生化试验及16SrDNA测序分析，初步认定其为巴氏醋杆菌（Acetobac ter pasteurianus）。

结果发现菌株FY4可耐受体积分数12%的乙醇、43℃高温，且在乙醇体积分数为10%，温度为30℃条件下产酸量达到最高，为61.2 g/L。

将菌株FY4的发酵特性与工业菌株AS1.41进行了对比，在10 L发酵罐试验中，菌株FY4的产酸量始终高于菌株AS1.41，在37℃，体积分数10%乙醇的条件下，菌株FY4产酸量达到42.2 g/L，而工业菌株AS1.41在此条件下几乎停止产酸。

这表明菌株FY4具有高的耐受性，可产生大量的醋酸，在工业生产中有潜在应用价值，对高耐受性醋酸菌的筛选具有重要的参考价值，对酿醋工艺的提升有一定的指导意义。

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