昆明小鼠原位胃癌移植模型的建立实验具体步骤及说明

昆明小鼠原位胃癌移植模型的建立实验具体步骤及说明采用两种不同的肿瘤细胞株分别在昆明小鼠胃部原位建立胃癌模型。

造模后对原位移植瘤的生长速度进行观察，并对胃癌组织中v EG F 的表达及M v D 进行检测，结果显示模型的成瘤率均为100%。

昆明鼠胃部原位移植瘤的生长速度快，缩短了胃癌模型建立周期，为筛选抗胃癌药物提供了有效简单的模型。

一、昆明小鼠皮下移植瘤传代
S180 细胞注人小鼠腹腔内，进行体外培养，5 -7 d 可见小鼠腹部肿胀，有腹水，收集腹水，细胞计数，调整细胞密度在2 x 106- 2x 107注射到昆明小鼠的腋部皮下形成实体瘤。

待肿瘤生长至直径1.5 -2.0 cm 之间，处死小鼠，按上述方法反复传3 代后作为原位移植用瘤源。

二、原位移植模型的建立
1. 取一中传3 代后生长4 周左右处于对数生长期的昆明小鼠，常规消毒，从腋部皮下剥取肿瘤组织。

2. 剔除纤维包膜、血管，切开去除中间坏死的组织，选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状的瘤组织，剪成约1-2 mm ，小块备用。

3. 昆明小鼠术前禁食12 h，以0.5% 戊巴比妥钠腹腔内注射(50 mg/kg)麻醉，固定小鼠，常规消毒皮肤，用手术剪刀在小鼠沿左侧腹部正中旁线切开，切口约1.5 cm ，小心
暴露腹膜、胃壁，用一次性注射针头轻微损伤胃大弯中部浆膜层，以出血为度，用无齿镊将破损处向内推压，使局部胃壁形成凹完，植入1 块1-2 mm3瘤组织块，并在瘤表面滴1 滴OB生物胶，使其覆盖瘤组织表面，然后分层关腹。

4. 人胃癌组织块昆明小鼠原位种植后，逐日观察裸鼠全身状况，运动情况，腹部体征。

若实验过程中出现动物死亡，记录时间，并全面探查腹腔，观察胃肿瘤原位生长情况。

三、处死动物及移植瘤的观察
定时观察所有裸鼠全身状况、运动情况、腹部体征、移植后脱颈处死解剖，取原位瘤。

所取标本经10%甲醛固定、石蜡包埋、切片、HE染色，做组织病理学检查。

四、免疫组化染色
1. 采用EnVision免疫组织化学技术检测VEGF蛋白表达。

EnVision是一种两步法免疫组化新技术，具有简便、特
异和敏感等特点。

2. 操作步骤如下，选取薄(3-4 um)而平整的组织切片，浸二甲苯脱蜡，梯度酒精水化后微波修复抗原，室温冷却后PBS 洗涤5 min。

3. 切片放人H2O2液中封闭10 min，PBS 洗涤5 min，滴加1:100稀释的抗VEGF抗体
置于37 ℃恒温孵育60 min，PBS 洗涤5 min。

4. 滴加二抗置于37℃恒温孵育30 min，PBS 洗涤5 min。

5. DAB显色液显色，室温下染色时间约8-20 min，在显微镜下根据颜色的发展掌握染色时间。

6. 显色结束后放人PBS 洗涤5 min，苏木素复染，封片。

7. 以PBS 代替一抗为阴性对照。

8. VEGF阳性结果判断：随机取5 个高倍视野，以其阳性细胞百分比计，≤5 % 为阴性(+) ，6%-25 % 为弱阳性( + ) ，26%-50%为中等强度阳性( + + )，≥51 % 为强阳性( ++ + ) 。

五、移植瘤微血管密度的测定
1. 采用EnVision 法，方法同4 ，一抗为兔抗鼠CD31 抗体，稀释倍数为1：10 0 。

2. 用PBS 代替一抗作为阴性对照。

3. 移植瘤MvD 按照Weidner等的评判标准，计算肿瘤内着色的毛细血管和微小血
管，凡呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞群者均作为1 个血管计数，但肌层较厚及管腔面积大于8 个红细胞直径的血管不计数。

4. 首先在100x 镜下寻找血管数目最高的区域，然后在200x 镜下计数5个区域中的微血管数目，取均值代表。

六、统计学处理
移植瘤MVD资料用无士SD 表示，采用t 检验。

光镜下胃移植瘤细胞多呈椭圆形、核大、深染、病理性分裂相多见。

瘤细胞排列呈巢状或索状,无明显腺体结构存在,在胃壁中浸润性生长。

人胃癌裸鼠移植模型经历了细胞悬液皮下接种、细胞悬液胃壁处接种及完整组织块胃壁内移植3个代表性阶段。

肿瘤细胞悬液注射裸鼠胃壁形成的原位移植模型最易发生类似人类肿瘤的转移过程。