实验设计——绿色荧光蛋白的表达

分子生物学实验设计报告
绿色荧光蛋白的克隆表达
——闵霞（2013141241165）李彩云（2013141241095）
一、引言
基因标记技术是近年来发展起来的分子生物学技术。

荧光蛋白基因在标记基因方面由于具有独特的优点而广受科学家们的关注。

荧光蛋白是海洋生物体内的一类发光蛋白，分为绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。

当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。

它产生荧光无需底物或辅因子，发色团是其蛋白质一级序列固有的。

基因克隆技术包括把来自不同物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA，然后送入受体生物中去表达，从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。

采用重组DNA技术，将不同来源的DNA分子在体外进行特异性切割，重新连接，组装成一个新的杂合DNA 分子。

在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子。

本次实验中，分子克隆质粒载体所携带的外源基因是EGFP绿色荧光蛋白，实验的最终目的是将EGFP基因插入表达载体pET-28a中，组成重组子，并导入到大肠杆菌细胞中并诱导其表达，培养出绿色的大肠杆菌菌落。

为此，我们要利用碱变性法将大肠杆菌中的质粒DNA提取出来，并通过Bam HI和NotⅠ两种酶的双酶切作用，从而获得目的外源基因片段EGFP和表达载体pET-28a质粒的DNA，然后通过连接酶连接后形成重组子，并通过氯化钙法导入大肠杆菌感受态细胞中，让其在含有Amp和IPTG的LB琼脂平板上生长繁殖，最后通过观察大肠杆菌能否在含有Amp和IPTG的LB平板上长出绿色的菌落，来判断EGFP基因工程菌的构建效果
二、主要路线：
1、质粒DNA的提取
2、琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA
3、酶切连接重组质粒
4、重组质粒的扩增
5、菌落PCR法鉴定阳性克隆
6、目的荧光蛋白基因的表达
1、质粒DNA的提取
实验原理：
1）质粒是一种染色体外的遗传因子，大小在1kb~200kb之间，是具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。

质粒具有自主复制能力，，能使子代保持他们恒定的复制数，可表达它携带的遗传信息。

它可以独立游离于细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主细胞就不能复制，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞
2）从大肠杆菌中抽提质粒DNA的方法很多，可以在实验中根据不同的需要采用不同的方法。

碱变性法抽提质粒DNA的基本原理是根据染色体DNA和质粒DNA分子量的巨大差异而达到分离的。

3）。

十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性碱变性法因其抽提效果好，收得率高，获得的DNA可用于酶切、连接与转化，因而被各实验室广泛采用。

抽提过程中在加入溶液II后，碱性条件使DNA的氢键断裂，宿主染色体双螺旋结构解开而变性，而闭合环状的质粒DNA的两条链不会完全分离，当加入溶液III中和后，宿主DNA相对分子质量大，还没来得及复性，就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起而沉淀下来，而质粒DNA由于能够迅速配对恢复原来的构型而溶解在TE溶液或ddH2O中。

●实验目的
掌握碱法抽提质粒DNA的原理和方法
●实验仪器、材料、试剂
1、仪器
恒温摇床，高压灭菌锅，超净工作台，10、100、1000μL取液器各一支，
台式高速离心机，制冰机，漩涡器。

2、材料：
含有质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a的大肠杆菌DH5α
1.5ml塑料离心管
EP管架
微量取液器和取液器吸头
常用玻璃器皿（如三角瓶、量筒、试剂瓶等）
⏹LB培养液:胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5 g，NaCl 5g，
琼脂（固体培养基）15g，用1N NaOH调pH 7.5。

⏹溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ
⏹氨苄青霉素(50mg/mL)
⏹抽提液（饱和酚：氯仿：异戊醇=25：24：1 ）
作用：氯仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离。

平衡酚密度大，可是DNA 在上清中。

异戊醇防止抽提液起泡。

⏹无水乙醇作用：除去DNA水化层，使DNA沉淀。

⏹70%乙醇作用：纯化质粒DNA。

⏹TE缓冲液或ddH2O 作用：溶解DNA
●详细步骤
1.1质粒扩增
在含有质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a的大肠杆菌DH5α平板菌落上挑取单菌落，分别接种于液体培养基中（加氨苄青霉素40μg/mL），180 r/min振荡培养过夜。

1.2碱裂解法提取质粒
1）取各培养菌液1.5mL置Eppendorf小管中，10000rpm×2min，弃上清液。

2）加入100μL溶液I，漩涡器上充分混匀，在室温下放置10 min。

3）加入200μL新配制的溶液Ⅱ，轻轻翻转2~3次，使之混匀，冰上放置5 min。

4）加入150μL冰冷的溶液Ⅲ，盖紧后，温和颠倒3-5次使混匀，产生白色絮状物，冰上放置15 min。

5）10000rpm×5 min，取上清液于另一干净的离心管中。

6）向上清液中加入等体积（约400μL）酚：氯仿/异戊醇（25：24：1，v/v），振荡混匀，10000rpm ×10 min，将上清液转移至新的离心管中。

7）加入等体积（约370μL）氯仿/异戊醇（24:1），混匀，10000rpm ×2min ,取上清液于新离心管中。

8）向上清液加入2倍体积无水乙醇，混匀，-20℃放置1h。

9）12000rpm ×5 min，倒去上清液，吸干液体。

10）加800μL70%乙醇，离心12000rpm ×1 min，倒尽上清液，吸水纸吸干液体，室温自然干燥30min，直至变得透明无乙醇味。

11）加20μL ddH2O（二次蒸馏水），混匀使DNA溶解完全，取5μL做电泳检测，剩余的溶液放置-20℃保存备用。

实验结果预测：加入溶液1浑浊；加入溶液2变澄清；加入溶液3出现白色絮状沉淀；加入氯仿抽提溶液分层
若成功提取，需琼脂糖凝胶电泳检测之后才能观察出结果。

2、琼脂糖凝胶电泳检测质粒DNA
●实验原理
质粒DNA在细胞内有三种构象：①共价闭环DNA，常以超螺旋形式存在；②如果两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成开环DNA；③线状DNA，双链DNA断开成线状。

电泳时，三种构象中，共价闭环DNA迁移率最大，其次是线状DNA和开环DNA。

因此在本实验中，质粒在电泳中呈现2~3条区带。

●实验目的
检验是否获得所需的质粒
●实验用品
1、仪器
电泳仪，电泳槽，样品槽模板（梳子），有机玻璃内槽，水平仪，取液器，微波炉，凝胶成像系统。

2、材料：
提取的质粒，琼脂糖，锥形瓶，一次性手套，胶铲，封口膜，剪刀，取液器吸头。

3、试剂：
Gold view（DNA染料）
1×TAE缓冲液
上样缓冲液（6×）
●详细步骤
2.1琼脂糖凝胶板制备
1）称取0.3g琼脂糖，置于锥形瓶中，加入30mL1×TAE缓冲液，微波炉加热直至琼脂糖溶解。

2）待胶液冷却到65℃（不烫手为宜），加入1μL Gold view混匀，搅拌器上搅拌排除气泡，
（如右图）缓慢倒入事先准备的制胶有机玻璃槽（插入样品槽模板梳子）内。

静置30min 左右，轻轻晃动拔出梳子。

2.2加样
胶板放入电泳槽中（样品孔位于负极），注入1×TAE缓冲液淹没过胶板5mm，用取液器将提取的质粒DNA5μL与1μL上样缓冲液（6×）混匀，加入胶板的样品小槽内。

2.3电泳
将电泳槽与电泳仪接通，调节电压为100V左右，直至缓冲液的蓝色指示剂移动到距离胶板边沿约1~2cm处，停止电泳。

2.4观察和拍照
将胶板小心取出，放入凝胶成像系统中，调节位置居中，波长为254nm的紫外灯下，观察凝胶中DNA存在处显示出荧光条带。

2.5注意事项
1.凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。

倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。

2.用移液枪将样品加至点样孔，吸取每一个样品时，操作要稳当且细心。

3.电泳一般是在追踪染料泳动到胶的80%部位时停止。

注意电泳期间，电泳槽盖要安全盖好，以防止液体蒸发，又可以降低电击的可能性。

3、酶切连接重组质粒
实验原理
1）生物体内能识别并切割特意的双链DNA序列的一种内切核酸酶。

由于这种切割作用是在分子内部进行的，故名限制性内切酶
2）Bam HⅠ切割识别序列后产生的粘性末端：
5'⋯G↓GATCC⋯3'→5'⋯G GATCC⋯⋯3'
3'⋯CCTAG↑G⋯5→3'⋯CCTAG G⋯⋯5'
Not I切割识别序列后产生的粘性末端：
5'⋯GC↓GGCCGC⋯3'→5'⋯GC GGCCGC⋯3'
3'⋯CGCCGG↑CG⋯5'→3'⋯CGCCGG CG⋯⋯5
3）双酶切重组质粒
●实验试剂
1 材料：实验一提取的质粒pEGFP- N3和pET--28a，0.2ml管，取液器吸头，一次性手套
2 试剂：Not I, Bam HI, ddH2O，10×buffer，引物、琼脂糖，Gold view
3 设备：移液器，台式高速离心机，凝胶电泳系统，凝胶成像系统，恒温培养箱
●实验步骤
3.1分别取两支0.2mlEP管做上标记：如①②
3.3 将两只EP管混匀后瞬时离心，放入恒温培养箱37℃酶切1h。

3.4 取5uL①②EP管的酶切反应液，同时取5uL原质粒溶液作对照，进行电泳检测酶切结果。

3.5 按照回收试剂盒（OMEGA）步骤切胶回收所需酶切产物片段。

1）需进行回收的凝胶，必须在新鲜的TAE缓冲液中进行电泳
2）取一个灭菌1.5mlEP管称重记录其重量
3）电泳结束后，凝胶成像系统中观察目的条带所在位置，用干净锋利的解剖刀切割所需回收的DNA条带（尽量不要切到多余的凝胶），放入已称重EP管后再次称重，计算得到凝胶重量。

4）按照1g凝胶加入1ml Binging Buffer（XP2）计算，若是0.3g则加入0.3ml Binging Buffer
（XP2），总体积最好不要超过700ul。

5）装有凝胶的EP管置于55-60℃水浴锅温浴10min，期间不时摇晃直至凝胶完全溶解。

6）取一个HiBind DNA column 放置于2ml collection tube中，把已溶解的胶液添加到HiBind DNA column 中，室温下10000×g离心1min。

若胶液超过700ul，请分成同等的两份，分别加入两个HiBind DNA column。

7）将collection tube中的液体倒掉，仍然将HiBind DNA column 放回刚才的collection tube 中。

再加入300ul Binging Buffer（XP2），室温下1000×g离心1min，以便清洗HiBind DNA column，再次将中的液体倒掉。

8）加入700ul SPW Wash Buffer冲洗，室温下10000×g离心1min。

弃掉collection tube中的液体。

将HiBind DNA column放回collection tube中。

9）重复一次第8步骤。

10）弃掉collection tube中的液体，将HiBind DNA column放回collection tube中，室温下13000×g离心20min，甩干HiBind DNA column中的膜。

11）将HiBind DNA column置于干净无菌的1.5mlEP管中，置于离心管架上，向HiBind DNA column的膜上加入30-50ul Elution Buffer（可根据凝胶中的DNA预计产量进行调整），室温下放置1min。

12）室温下13000×g离心1min，洗脱DNA，1.5mlEP管中的液体即为回收的目的DNA片段。

13）取50ul进行电泳，检测DNA含量。

3.6在EP管中分别配制下列的体系
X:Y=1:10-30，总体积25ul
4重组质粒的扩增
●实验原理
细菌处于容易吸收外源DNA的生理状态叫感受态。

转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组DNA分子导入细菌的过程。

其原理是细菌处于0℃，在有CaCl2存在的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。

转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。

●实验目的
扩增重组质粒
●实验步骤
4.1取出感受态细胞DH5a让其在冰上自然解冻，每200ul解冻的感受态细胞加入整管连接
产物，混匀后冰浴30min。

4.2 42℃热冲击1min，立即置于冰浴5min。

4.3再在感受态细胞混合物中加入0.8ml的LB培养基，于37℃摇床中培养1h。

4.4 1h后，6000r/min离心3min，去掉上清液（约留200ul的培养液），摇匀菌块。

4.5 用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含Kana的LB固定培养基上，正置培养皿半小时后，37℃培养箱中倒置培养皿过夜。

4.6 第二天早上观察结果。

5.菌落PCR法鉴定阳性克隆
T7启动子正向引物：5’-taa tac gac tca cta tag gg-3
T7启动子反向引物：5’-tgc tag tta ttg ctc agc gg-3
5.1在
5.2用灭菌枪头挑单菌落接触EP管内，混匀瞬时离心
5.3放入PCR仪中，设置反应程序：
1）94℃预变性5min
2）94℃变性30S
3）55℃退火30S
4）72℃延伸1min
5）重复步骤2-4 30次
6）72℃延伸10min
5.4取9ul反应液加1ul 10×loading Buffer做电泳检测，分析所得目的片段的大小，检测是否与理论目的基因大小相符。

6.目的荧光蛋白基因的表达
6.1取出感受态细胞BL21让其在冰上自然解冻，每200ul解冻的感受态细胞加入5ul pET-28a-EGPF质粒，混匀后冰浴30min。

6.2 42℃热冲击90S，立即置于冰浴5min。

6.3再将感受态细胞混合物转入0.8ml的LB培养基，于37℃摇床中培养1h。

期间将200ul 的24mg/ml IPTG涂布在含Kana的LB培养基上，待用。

6.4 1h后，6000r/min离心5min，去掉上清液（约留200ul的培养液），摇匀菌块。

6.5用玻璃涂布器将溶液均匀涂布在含IPTG和Kana的LB固体培养基上，正置培养皿半小时后，37℃培养箱中倒置培养皿过夜。

6.6第二天早上观察结果。