印迹转移技术

印迹转移电泳
• 进行印迹转移电泳时，要注意缓冲液的离子强 进行印迹转移电泳时，要注意缓冲液的离子强 度要低，pH要远离pI 使蛋白质带有较多电荷， pI， 度要低，pH要远离pI，使蛋白质带有较多电荷， Tris一般用稳定性较好的Tris 缓冲体系。 一般用稳定性较好的Tris-缓冲体系。 • 还要注意凝胶与支持膜之间不能有气泡。适当 还要注意凝胶与支持膜之间不能有气泡 气泡。 提高电压或电流可以提高转移速度，但亦会增 提高电压或电流可以提高转移速度， 电压或电流可以提高转移速度 加热效应，故电压或电流不可过高。 加热效应，故电压或电流不可过高。
印迹转移电泳
印迹转移电泳
• 目前国内外有多种核酸、蛋白质印迹转移的电泳装 目前国内外有多种核酸、 置出售，使印迹转移速度快、效率高、重复性好， 置出售，使印迹转移速度快、效率高、重复性好， 应用更加广泛，仪器的使用方法可参照厂家说明书。 应用更加广泛，仪器的使用方法可参照厂家说明书。 • 聚丙烯酰胺凝胶也可用于印迹转移电泳，但转移蛋 聚丙烯酰胺凝胶也可用于印迹转移电泳， 白质时，凝胶中不可含有SDS、尿素等变性剂 不可含有SDS 等变性剂。 白质时，凝胶中不可含有SDS、尿素等变性剂。 • 用于转移电泳的支持膜亦有多种选择，近些年用尼 用于转移电泳的支持膜亦有多种选择，近些年用尼 龙膜较多 因为尼龙膜机械性能好，烘烤不变脆， 较多， 龙膜较多，因为尼龙膜机械性能好，烘烤不变脆， 硝酸纤维素膜更方便 使用时比硝酸纤维素膜更方便。 使用时比硝酸纤维素膜更方便。
印迹法基本概念原理 印迹法基本概念原理 基本
• (3)淬灭：用一种与待测物不反应的物质(如蛋白质、核 淬灭：用一种与待测物不反应的物质 如蛋白质 如蛋白质、 淬灭 吐温20和聚乙烯吡咯烷酮等 和聚乙烯吡咯烷酮等)封闭载体印迹区域以 酸、吐温 和聚乙烯吡咯烷酮等 封闭载体印迹区域以 外的剩余吸附位点，使探针仅与印迹物反应， 外的剩余吸附位点，使探针仅与印迹物反应，且不吸附 到载体上，结果是背景干净，印迹的斑点或谱带清晰。 到载体上，结果是背景干净，印迹的斑点或谱带清晰。 • (4)印迹：把经凝胶电泳后的组分，通过吸附或电泳方 印迹： 印迹 把经凝胶电泳后的组分， 法转移或者直接吸附到固相载体上；此过程称为印迹。 法转移或者直接吸附到固相载体上；此过程称为印迹。 • (5)放射自显影术：将含放射性同位素的复合物置 感光 放射自显影术： 放射自显影术 将含放射性同位素的复合物置X感光 胶片上，当放射性同位素电离辐射时， 胶片上，当放射性同位素电离辐射时，胶片上会发生化 感光”作用，随后经显影、定， 学“感光”作用，随后经显影、定影，即可呈现出斑点 或谱带，此法较灵敏。 或谱带，此法较灵敏。
1979年towbin等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装置将蛋白质转移到膜上再与相应的抗体等配体反应被戏称为western印迹这种装置将膜和凝胶滤纸等制成夹心饼干状用低电压高电流电泳完成转移
三、印迹转移电泳
• 生物化学与分子生物学的研究工作经常需要对电泳分离后的DNA进行 生物化学与分子生物学的研究工作经常需要对电泳分离后的DNA进行 DNA 分子杂交，但琼脂糖不适合于进行杂交操作。 分子杂交，但琼脂糖不适合于进行杂交操作。 • 1975年，Southern创造了将DNA区带原位转移到硝酸基纤维素膜(NC 1975年 Southern创造了将DNA区带原位转移到硝酸基纤维素膜(NC 创造了将DNA区带原位转移到硝酸基纤维素膜 再进行杂交的方法，被称为Southern印迹法； Southern印迹法 膜)上，再进行杂交的方法，被称为Southern印迹法； • 随后，Alwine等将类似方法用于RNA印迹，被戏称为Northern印迹； 随后，Alwine等将类似方法用于RNA印迹 被戏称为Northern印迹； 等将类似方法用于RNA印迹， Northern印迹 • 1979年Towbin等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装置， 1979年Towbin等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装置 等设计了将蛋白质从凝胶转移到硝酸纤维素膜的装置， 蛋白质转移到膜上 再与相应的抗体等配体反应， 到膜上， 将蛋白质转移到膜上，再与相应的抗体等配体反应，被戏称为 Western印迹 这种装置将膜和凝胶、滤纸等制成夹心饼干状， 印迹， Western印迹，这种装置将膜和凝胶、滤纸等制成夹心饼干状，用低 电压高电流电泳完成转移。 电压高电流电泳完成转移。 • 1982年Reinhart等用电转移法将等电聚焦后的蛋白质区带从凝胶转 1982年Reinhart等用电转移法将等电聚焦后的蛋白质区带从凝胶转 Eastern印迹 印迹。 移到特定膜上，双向蛋白质印迹法 移到特定膜上，双向蛋白质印迹法，称Eastern印迹。
印迹法基本概念原理 印迹法基本概念原理 基本
• (6)原理 原理
• 生命大分子物质 如核酸或蛋白质)印迹到固相载体上， 生命大分子物质(如核酸或蛋白质 印迹到固相载体 如核酸或蛋白质 印迹到固相载体上 淬灭试剂处理后 可与相应的探针反应 处理后， 探针反应， 经淬灭试剂处理后，可与相应的探针反应，接着用适当 的溶液漂洗 置含底物的溶液中培育，即可显出谱带 漂洗， 谱带。 的溶液漂洗，置含底物的溶液中培育，即可显出谱带。 如所用探针是放射性同位素标记物 放射性同位素标记物时 如所用探针是放射性同位素标记物时，则应将漂洗后的 载体进行放射自显影 即可检测出样品中特异的成分。 放射自显影， 载体进行放射自显影，即可检测出样品中特异的成分。
印迹法基本概念原理 印迹法基本概念原理 基本
• (1)探针：用化学方法将有识别能力的物质 如抗原、 探针： 如抗原、 探针 用化学方法将有识别能力的物质(如抗原
激素、核酸等 和酶 如辣根过氧化物酶)或同位素 和酶(如辣根过氧化物酶 或同位素(如 激素、核酸等)和酶 如辣根过氧化物酶 或同位素 如。 3H、35S、32P)，或荧光物质 如异硫氰荧光素、地高辛 如异硫氰荧光素、 、 、 ，或荧光物质(如异硫氰荧光素 结合成的复合物称作探针。 等)结合成的复合物称作探针。 结合成的复合物称作探针 • (2)固相载体：即用于吸附生命大分子物质的固体材料。 固相载体： 固相载体 即用于吸附生命大分子物质的固体材料。 这类材料有NC(Nitrocellulose)纸、 这类材料有 纸 DBM(Diazobenzy-loxymethyl)纸和 纸和 DPT(Diazophenylthiaether)纸等。最常用的是孔径 纸等。 纸等 为o．45µm的NC纸。因为它成本低廉，背景较清晰 ． 的 纸 因为它成本低廉，