酵母双杂交系统技术介绍ppt课件

QDO/X/A
2266 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020•筛选: 传统细菌筛选培养
取1ml菌液按 照一定比例 用LB稀释， 150ul/板进 行涂板，过 夜培养。
提取质粒
刮取平板上的 菌落，提取质 粒。
转化酵母菌
将提取的质粒 转化Y187， 获得酵母 。Mating筛选将文库与诱饵 培养液混合， 进行Mating。 涂筛选板，挑 取阳性克隆子 。
AbA 抗性筛选
X-a-gal 蓝白筛选
Ade 营养筛选
His 营养筛选
M1
G1
1133 酵母双杂交系统技术介绍
G2
1/11/2020
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主要内容
1144 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
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Clontech 酵母双杂交系统: MM Series
1155 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
630467 Easy yeast Plasmid Isolation Kit
2299 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
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验证互作: 体内验证
630305
Mammalian Matchmaker TwoHybrid Assay Kit 2
SEAP
3300 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020•构建: Clontech MM构建方法
SMART合成cDNA 共转化，涂板 培养，收集菌液 分装，冻存1ml mating
SMART cDNA
两
小
时
聪明的酵母
构
自己
建
做克隆
Y187
文 库
同源重组
SD/Leu-
1199 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020•构建: Clontech MM构建方BD诱饵培养液
DDO/X/A QDO/X/A
2211 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020•筛选: Clontech MM筛选
630489 Matchmaker™ Gold Yeast Two-Hybrid System
BD vector：pGBKT7 AD vector: pGADT7
Y187 Y2H Gold
630489
630439 极大提高转化率 可以单独购买
2222 酵母双杂交系统技术介绍
三个载体 阳性对照， 阴性对照。
1/11/2020•筛选: Clontech MM 系统质粒
诱饵载体 In Y2H Gold
020
1
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主要内容
2 酵母双杂交系统技术介绍
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背景介绍: 关注蛋白质
33 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
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背景介绍: 为什么要研究蛋白互作？
44 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
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背景介绍: Clontech 酵母双系统的功能
55 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
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背景介绍: Clontech分子生物学工具
6. Duplicated C-class MADS-box genes reveal distinct roles in gynostemium development in Cymbidium ensifolium (Orchidaceae)
SY Wang, PF Lee, YI Lee, YY Hsiao… - Plant and Cell …, 2011 - Jpn Soc Plant Physiol•筛选: 诱饵载体构建及其自激活检测
Y2H Gold 诱饵载体
2244 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020•筛选: Mating方法筛选Y187
α型 AD
Mix Mating
二倍体
DDO筛选
QDO筛选
Y2H Gold
a 型 BD
Mating 接合反应 酵母的有性生殖过程，
Clontech利用这个过程，实现了筛选。Brook, Stony Brook 11794.
1100 酵母双杂交系统技术介绍
28000次引用
1/11/2020
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基本原理: GAL4转录因子的结构
DNA-BD

AD 激活结构域
1111 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
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基本原理: GAL4转录因子的分子机理
2277 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020•筛选: 验证阳性克隆子（PCR确认）
630497 Matchmaker™ Insert Check PCR Mix2
25ul 2×mix
30 PCR cycles 25ul H2O
2288 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020•筛选: 酵母质粒提取3311 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
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验证互作: 体外Co-IP验证实验流程
PL检测
32
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验证互作: FRET分析
632466 pDsRed -Monomer-C1 Vector
632470 pAcGFP1 -C1-Vector
3333 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
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Clontech Matchmaker系统产品选择指南
T Kiyomitsu, H Murakami… - Molecular and Cellular …, 2011 - Am Soc Microbiol
3355 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
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AAAAAAAAA
共转化，涂板 培养，GGG CCC
GGG CCC
1188 酵母双杂交系统技术介绍
AAAAAAAAA TTTTTTTT
AAAAAAAAA TTTTTTTT
LD-PCR
AAAAAAAA TTTTTTTT
1/11/2020
H Nara, T Onoda, M Rahman, A Araki… - Cellular …, 2011 – Elsevier
4. FHL1 interacts with oestrogen receptors and regulates breast cancer cell growth
L Ding, C Niu, Y Zheng, Z Xiong… - Journal of Cellular …, 2011 - Wiley Online Library
： 630495 插入片段检测： 630497 酵母质粒提取： 630467
体内验证： 630489 630305 体外Co-IP验证： 630458 630459 631723 631604
1177 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020•构建: Clontech MM构建方法
SMART合成cDNA
SMART合成cDNA 1ml mating
2200 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020•构建: Clontech MM自制筛选
SMART合成cDNA 共转化，涂板 培养，收集菌液 分装，冻存1ml mating
1/11/2020
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Clontech MM系统: 蛋白互作基本流程
Clont802 （传统型） 预制酵母菌： 630480 （均一化，通用型）
酵母双杂交系统： 630489 酵母菌转化试剂盒： 630439 酵母培养基（套装）
Clontech
Matchmaker™
66 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
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背景介绍: Matchmaker Gold 系统
77 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
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背景介绍: Matchmaker Gold系统原理
Reporter Gene
Reporter Gene
Reporter Gene
2255 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020•筛选: 均一化通用筛选Normalized Universal Pr量 大大降低假阳性 更高的基因代表性Y187，AD 混合DDO/X/A
Y2H Gold， BD诱饵培养液
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Clontech MM系统的优点
异常 简便
SMART方法与同源重组技术结合构建 ，聪明的酵母自己做克隆。抗性 筛选
AbA抗性筛选的添加，有效抑制背景 生长，大续与a型菌株Y2H Gold进行mating 直接筛选。
1166 酵母双杂交系统技术介绍
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验证互作: 体外Co-IP验证
Matchmaker Chemiluminescent Co-IP Vector Set（630458） Matchmaker Chemiluminescent Co-IP Kit（630459） Prolabel Chemiluminescent Detection Kit （631723）
7. Protein Interaction Domain Mapping of Human Kinetochore Protein Blinkin Reveals a Consensus Motif for Binding of Spindle Assembly Checkpoint Proteins Bub1 and BubR1
K Choi, J Kim, HJ Hwang, S Kim… - The Plant Cell …, 2011 - Am Soc Plant Biol
2. Extracellular signal-regulated kinase 8 (Erk8) controls estrogen-related receptor α (ERRα) cellular localization and inhibits its transcriptional activity
M Rossi, D Colecchia, C Iavarone, A Strambi… - Journal of Biological …, 2011 – ASBMB
3. WSB-1, a novel IL-21 receptor binding molecule, enhances the maturation of IL-21 receptor
正常情况在酵母细胞内
GAL UAS
Promoter
Transcription gal metabolic gene
在GAL4 based双杂交系统中:
GAL4 AD
1122 酵母双杂交系统技术介绍
Reporter Gene
1/11/2020
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基本原理: 三个启动子，四个报告基因
获得阳性克隆子
报告基因表达
88 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
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主要内容
99 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
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基本原理: 酵母双杂交参考文献
• Nature. 1989 Jul 20;340(6230):245-6.
• A novel genetic system to detect protein-protein interactions. • Fields S, Song O. • Department of Microbiology, State University of New York at Stony
5. Rab4 interacts with the human P‐glycoprotein and modulates its surface expression in multidrug resistant K562 cells
C Ferrándiz‐Huertas… - … Journal of Cancer, 2011 - Wiley Online Library
3344 酵母双杂交系统技术介绍
1/11/2020
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Clontech Matchmaker系统近期参考文献
1. The FRIGIDA Complex Activates Transcription of FLC, a Strong Flowering Repressor in Arabidopsis, by Recruiting Chromatin Modification Factors