MicroRNA作用于Oct4和Sox2基因时对于干细胞的调节作用

MicroRNA作用于Oct4和Sox2基因时对于干细胞的调节作用
摘要：MicroRNA是一系列高度保守的长度约为22个核苷酸的非编码小分子RNA。

大量研究证实，microRNAs广泛分布于真核生物，其在细胞的分化发育、生长代谢等各种活动中都起着重要的调节作用。

Oct4和Sox2转录因子在启动细胞重编程、维持胚胎干细胞多能性和决定其是否走向分化方面具有关键作用。

MicroRNA可通过与Oct4和Sox2及其基因相互作用，而对干细胞的分化产生调节作用。

关键词：MicroRNA；Oct4；Sox2；干细胞
Abstract：MicroRNAs are highly conserved and non-coding small RNAs mainly with 22-nucleotide in length.It has proven that microRNAs are widely expressed in eukaryotes and play an important role in the regulation of cell differentiation and development, growth metabolism, and many other cell activities.Oct4 and Sox2 transcription factors play an essential role in initiating cell reprogramming，maintaining sternness of pluripotent stem cell and deciding whether or not to differentiate.
Key words: MicroRNA; Oct4; Sox2; stem cell
1 MicroRNA的生成和作用方式
Lee等[1]发现在线虫体内存在一种RNA(lin-4),是一种不编码蛋白但可以生成一对小的RNA转录本(后来被命名为microRNAs, miRNAs)，每一个转录本能在翻译水平通过抑制一种核蛋白lin-14的表达而调节了线虫的幼虫发育进程。

后续大量的研究证实，microRNAs广泛分布于真核生物，其在细胞的分化发育、生长代谢等各种活动中都起着重要的调节作用，具有在翻译水平调控基因表达的功能。

MicroRNA相应的基因来源于染色体非编码区的一段，由RNA聚合酶II转录生成单顺反子或多顺反子初级转录物(Pri-miRNA)，Pri-miRNAs经Micro-processor复合体加工形成中间体Pre-miRNAs，在exportin5-Ran-GTP蛋白出核转运体的辅助下转至胞质。

在胞质中，由Dicer剪切加工形成成熟的
MicroRNAs[2]。

成熟的MicroRNAs通过完全或不完全配对结合到mRNA的3' UTR，抑制靶基因的翻译。

这一作用是通过形成RNA诱导沉默复合物RISC(主要包括Argonaute家族)来完成的[3]。

MicroRNA的5’端约有2~8个核苷酸的种子序列可与mRNA的3'UTR识别。

这种MicroRNA和靶点序列的不完全互补，可使一个MicroRNA调节多个基因[4]。

3' UTR成为MicroRNA发挥作用的主要“收件人”，接受信息、引起翻译抑制或基因沉默[5]。

这是目前研究发现MicroRNA发挥调节作用的主要机制。

MicroRNA还可以通过与RNA结合蛋白竞争结合mRNA靶位点，调节基因的表达；与mRNA的CDS区结合，调节其翻译过程等发挥作用[6]。

2 Oct4、Sox2与干细胞
2.1 Oct4基因与功能
Oct4是POU转录因子家族中的一员，人的Oct4基因位于６号染色体上（6p21.31），长度为16.40kb，具有多个转录起始位点，转录不同的mRNA亚型，从而翻译成多种蛋白质。

目前已发现Oct4基因共有11种亚型Isoform 1~11，翻译7种蛋白质。

Isoform 1,2,3,4,5和Isoform 11各翻译一种蛋白质，Isoform 6 ~10转录的mRNA不同但其翻译的蛋白质相同。

在胚胎发育的不同阶段，Oct4的表达具有严格的时间顺序性，从2细胞到8细胞，直至桑甚胚致密化之前，Oct4在胚胎细胞中均高表达，此后表达逐渐下调，直至消失。

Oct4基因敲除的小鼠只能发育到类似囊胚的阶段，然而该囊胚内细胞团中的细胞不具有发育全能性，只能形成滋养外胚层。

ES的多能性对Oct4的表达水平相当敏感，Oct4的过表达也能导致胚胎向中内胚层分化[7]。

2.2 Sox2基因与功能
Sox2是一种与SRY蛋白相关的含HMU box的转录因子。

Sox2的cDNA全长约2.40 kb，编码319个氨基酸。

Stevanovic M等首次克隆出人的Sox2基因，位于第3号染色体的长臂q26.3~27位置。

Sox2的HMU box以高度亲和力结合特异的DNA靶序列(A/T)(A/T)CAA(A/T)G，其表达蛋白的C’末端是其转录激活区域，包含了一段富含丝氨酸的序列。

在脊椎动物Sox2 mRNA 3’非翻译区(3' un-translated region, 3' UTR)中存在4段非常保守的富含AU的区域，Sox2的3'
UTR可能参与了其转录后调控。

YuanB等从胚胎癌细胞(embryonic cancer cell, ECC)的cDNA文库中克隆了小鼠Sox2的全长cDNA，他们发现Sox2基因主要是协同Oct4基因发挥调控作用。

Sox2是脊椎动物早期发育中最早表达的神经系统特异性基因之一，同时在干细胞的维持中也起着关键作用，并常被作为一种多能性细胞谱系的分子标记。

Sox2基因在成人组织细胞中表达并具有广泛的调节作用，特别是在保持组织稳态性方而具有重要功能。

因此，Sox2基因可以作为一个共同的干性基因，调节不同类型干细胞和组织的自我更新。

2.3干细胞与Oct4、Sox2
干细胞（stem cell , SC）是具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体。

根据其来源可分为成体干细胞、胎儿干细胞、胚胎干细胞(Embryonic stem cell, ES)、核移植干细胞和诱导多能干细胞（Induced pluripotent stem cell, iPS）。

人的胚胎干细胞在再生医学、组织工程和药物发现与评价等领域极具应用价值。

ES和iPS都依赖于基本的转录框架，该框架都被通常的一套核心特异性干细胞转录因子所支配[8]。

反过来这些转录因子又与特异性细胞调控因子一起调节复杂的基因表达程序，这些表达程序在驱使谱系特异化发育程序的同时，还赋予干细胞独特的能力来维持其干性。

在ES和iPS中有成千上万的细胞因子表达，而Oct4和Sox2却发挥着关键的调节作用。

两种转录因子并不是孤立的发挥作用，二者之间相互影响，相互作用。

Sox-2可以同Oct-4结合为异二聚体，这种复合体和细胞转录因子FoxD3分别结合Nanog基因转录起点-180bp和-270bp处，激活其转录。

Oct4-Sox2复合物除结合Nanog及自身启动子外，还经常共同结合于Nanog的靶基因(如FUF4、UTFl、Fbx15等)的启动子区，协同作用，形成调控网络，这些靶基因多数都参与了ESC 多能性的维持。

如果选择性的下调其中任一因子表达将导致胚胎干细胞分化，失去多能干细胞的特性，而过表达Oct-4和Sox-2的成体细胞能够恢复多能干细胞的特性。

3 MicroRNA在Es细胞中的表达调控作用
3.1 MicroRNA参与ES细胞独特的细胞周期调控
ES细胞的细胞周期缺乏G1/S限制点，能快速越过G1期进入S期是ES细胞可以无限分裂和快速自我更新的重要原因。

MicroRNA在这种独特的细胞结构中发挥关键作用。

某些MicroRNA通过抑制G1/S转换的抑制因子的表达，加快细胞周期进程。

在细胞分化时，这些MicroRNA表达下调又会使G1期延长。

Oct4和Sox2是早期胚胎发育和维持细胞干性的关键转录因子。

Oct4和Sox2结合到miR-302簇保守的启动子区，上调miR-302a的表达。

研究结果表明，miR-302a 的表达依赖于Oct4及Sox2，并且两者在胚胎发育中同一时期同一组织并行伴随出现[9]。

Fig.1 MicroRNA could regulate cell cycle of stem cells
3.2 MicroRNA与ES细胞的核心转录调控环路
ES细胞的自我更新和分化是外源信号、表观遗传、基因转录和转录后调节等动态相互作用的结果。

ES细胞核心转录因子Oct4, Nanog和Sox2等通常结合在ES细胞中优先表达的MicroRNA启动子区调控MicroRNA的表达，反过来MicroRNA可以在翻译水平上调控上述转录因子的表达[10]。

这些MicroRNA又与Ploycomb group proteins作用，共同形成了调节网络，调控ES细胞增殖分化或早期胚胎发育。

对人类ES细胞分化过程中MicroRNA进行表达谱分析发现，miR-145在干细胞中几乎不表达，在分化的细胞中miR-145的表达量随分化程度的不同而改变。

在分化细胞中，miR-145可以结合Oct4, Sox2和Klf4的3'UTR区抑制它们的表达，同时miR-145又可以被Oct4反馈抑制。

增加miR-145的表达量抑制干细胞的自
我更新，抑制干性相关基因的表达，诱导特定谱系的定向分化。

miR-145如同一个分子开关结合Oct4调节ES细胞的自我更新和分化。

这种作用一旦决定，则不再可逆。

Fig. 2 MicroRNA-145 is a molecular switch of stem cells differentiation
3.3 Dicer酶与Oct4基因的表达
研究证实，合成miRNAs过程中所需的Dicer酶具有调控胚胎干细胞(ES)自我更新、分化以及细胞世系确定等作用。

另据Cui等[11]报道，当小鼠胚胎中的下调Dicer表达后，可使Oct4等多能基因表达水平下降。

Dicer敲除实验证实[12]，当敲除Dicer基因后，不仅在Dicer缺失的胚胎无法检测到表达ES细胞标记性基因Oct4，而且，可导致小鼠胚胎在发育的早期阶段死亡。

4 microRNA在诱导多能干细胞中的作用
2006年，Yamanaka小组通过逆转录病毒将Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc四个转录因子转入小鼠的成纤维细胞，重编程形成iPS细胞[13]。

2007年11~12月，Yamanaka小组和Thomson小组先后将人的体细胞重编程为iPS细胞。

MicroRNA 在iPS重编程中也发挥了作用。

Pei等[14]在利用Oct4, Sox2和Klf4等诱导小鼠成纤维细胞为iPS过程中，通过逆转录病毒载体在诱导细胞中过表达miR-302/367,结果表明过表达的miR302/367通过降解TgfβR2的mRNA、促进E钙粘蛋白的表达加速间充质与上皮间的转换(Mesenchymal-to-epithelial transition, MET)进而加速体细胞重编程的进程，从而显著提高iPS诱导效率。

Judson[15]研究发现，表达小鼠ES细胞特异的miRNA(miR-291-3p, miR-294和miR-295)能提高KIf4、Oct4和Sox2的重编程效率。

抑制组织特异性MicroRNA如let-7 miRNAs能增加小鼠胚胎成纤维细胞再程序化效率。

5 结语
干细胞和microRNA是目前生物研究领域中的两个前沿，具有重要意义，一个代表基本的生物学问题，另一个则提供机制[16]。

Oct4和Sox2作为维持干细胞多潜能性和自我更新的两个关键核心调控因子，它们不但可以调控多个维持多能性、自我更新、多向分化相关基因的表达，还参与到信号转导、表观遗传调控等多个过程。

microRNA在植物和动物体内参与调控干细胞特性，在多能干细胞的预编程和体细胞的重编程过程中尚有广阔的未知领域，此方面的研究将有助于了解不同类型多能干细胞的分化趋向性差异的机制及不同体细胞的表观遗传学状态对重编程过程的影响。

将MicroRNA与Oct4、Sox2这两个关键性细胞因子的相互作用机制深入了解，有助于细胞重编程分子机制的进一步阐明，为干细胞的相关研究奠定基础。

参考文献：
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