莫特塞尼与EZH2_抑制剂GSK126_联合应用对肝癌Huh7_细胞增殖和凋亡的影响及其机制

第 49 卷第 4 期2023年 7 月吉林大学学报（医学版）
Journal of Jilin University（Medicine Edition）
Vol.49 No.4
Jul.2023
DOI：10.13481/j.1671‐587X.20230410
莫特塞尼与EZH2抑制剂GSK126联合应用对肝癌Huh7细胞增
殖和凋亡的影响及其机制
梁媛媛1,2, 赵颂1, 胡静1, 安妮1, 魏验芦1, 苏荣健1
（1. 锦州医科大学基础医学院细胞生物学教研室，辽宁锦州121000；2. 锦州医科大学附属第一医院
风湿免疫科，辽宁锦州121000）
［摘要］目的
目的：探讨多激酶抑制剂莫特塞尼联合果蝇zeste基因增强子的人类同源物2（EZH2）抑制剂GSK126对肝癌Huh7细胞体外增殖和凋亡的影响，初步阐明其相关机制。

方法
方法：不同浓度（0、
1、5、10、20、40和60 μmol·L－1）莫特塞尼处理Huh7细胞，采用CCK-8法检测各组Huh7细胞增殖
率，采用Western blotting法检测不同浓度（0、2.5、5.0、10.0和20.0 μmol·L－1）莫特塞尼组Huh7细胞中EZH2和磷酸化EZH2（p-EZH2）蛋白表达水平。

莫特塞尼和GSK126联合作用于Huh7细胞，采用CCK-8法和克隆形成实验确定后续实验合适的药物浓度。

Huh7细胞分为对照组、莫特塞尼（10 μmol·L－1）组、GSK126（5 μmol·L－1）组和联合组（莫特塞尼+GSK126），采用5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷（EdU）荧光染色法检测各组Huh7细胞增殖率，流式细胞术检测各组Huh7细胞凋亡率，Western blotting法检测各组Huh7细胞中细胞外信号调节激酶（ERK）、磷酸化ERK（p-ERK）、蛋白激酶B（AKT）和磷酸化AKT（p-AKT）蛋白表达水平。

结果
结果：CCK-8法检测，不同浓度莫特塞尼组Huh7细胞存活率随着药物浓度升高逐渐降低，与0 μmol·L－1莫特塞尼组比较，20、40和
60 μmol·L－1莫特塞尼组Huh7细胞增殖率明显降低（P<0.05或P<0.01）；Western blotting法检测，
与0 μmol·L－1莫特塞尼组比较，5.0、10.0和20.0 μmol·L－1莫特塞尼组Huh7细胞中EZH2和p-EZH2蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。

通过CCK-8法和克隆形成实验确定10 μmol·L－1莫特塞尼和
5 μmol·L－1 GSK126用于后续实验。

与对照组比较，莫特塞尼组、GSK126组和联合组Huh7细胞增殖
率明显降低（P<0.01），细胞凋亡率明显升高（P<0.05或P<0.01）；与莫特塞尼组和GSK126组比较，联合组Huh7细胞增殖率明显降低（P<0.01），细胞凋亡率明显升高（P<0.01）。

与对照组、莫特塞尼组和GSK126组比较，联合组Huh7细胞中p-AKT和p-ERK蛋白表达水平明显降低（P<0.05或P<0.01）。

结论：单独应用莫特塞尼抑制肝癌Huh7细胞增殖和促进凋亡效果不明显，可能与EZH2升高导致细胞耐药有关。

莫特塞尼与GSK126联合应用可通过抑制AKT和ERK信号通路，增强莫特塞尼对肝癌Huh7细胞的增殖抑制和促凋亡作用。

［关键词］莫特塞尼；肝肿瘤；细胞增殖；细胞凋亡；果蝇zeste基因增强子的人类同源物2；
GSK126
［中图分类号］R735.7［文献标志码］A
[文章编号] 1671‐587X(2023)04‐0896‐09
[收稿日期]2022‐06‐18
[基金项目]国家自然科学基金项目（81903109）；辽宁省教育厅自然科学基金项目（2020-MS-299）
[作者简介]梁媛媛（1990－），女，辽宁省凌海市人，在读硕士研究生，主要从事肝癌治疗及其分子机制方面的研究。

[通信作者]苏荣健，教授，硕士研究生导师（E-mail：*****************）
896
897梁媛媛，等. 莫特塞尼与EZH2抑制剂GSK126联合应用对肝癌Huh7细胞增殖和凋亡的影响及其机制
Effect of motesanib combined with EZH2 inhibitor GSK126 on proliferation and apoptosis of liver cancer Huh7 cells and
its mechanism
LIANG Yuanyuan1,2, ZHAO Song1, HU Jing1, AN Ni1, WEI Yanlu1, SU Rongjian1
（1. Department of Cell Biology， School of Basic Medical Sciences， Jinzhou Medical University，Jinzhou 121001，China；2. Department of Rheumatoid Immunity，First Affiliated Hospital，Jinzhou Medical
University， Jinzhou 121000，China）
ABSTRACT Objective：To discuss the effect of multi-kinase inhibitor motesanib combined with enhancer of zeste homolog 2（EZH2）inhibitor GSK126　on the proliferation and apoptosis of the liver cancer Huh7 cells in vitro，and to clarify its related mechanism.Methods：The Huh7 cells were treated with different concentrations （0，1，5，10，20，40，and 60 μmol·L－1）of motesanib.The proliferation rates of Huh7 cells in various groups were detected by CCK-8 assay；Western blotting method was used to detect the expression levels of EZH2 and phosphorylated EZH2（p-EZH2）proteins in the Huh7 cells in different concentrations （0，2.5，5.0，10.0，20.0 μmol·L－1） of motesanib groups.The Huh7 cells were treated with motesanib and GSK126 in various groups；the appropriate drug concentrations were selected by CCK-8 assay and colony formation assay.The Huh7 cells were divided into control group，motesanib（10 μmol·L－1） group， GSK126（5 μmol·L－1）group，and combination （motesanib+GSK126）group.The 5-ethynyl-2'-deoxyu ridine （EdU） fluorescence staining assay was used to detect the proliferation rates of Huh7 cells in various groups；the apoptotic rates of Huh7 cells in various groups were detected by flow cytometry；Western blotting method was used to detect the expression levels of extracellular regulated protein kinases（ERK），phosphorylated ERK （p-ERK），protein kinase B（AKT），and phosphorylated AKT（p-AKT） proteins in the Huh7 cells in various groups.Results：The CCK-8 assay results showed that proliferation rate of Huh7 cells in different concentrations of motesenib groups were decreased gradually with the increasing of drug concentrations； compared with motesenib （0 μmol·L－1） group， the proliferation rates of the Huh7 cells in 20，40，and 60 μmol·L－1motesenib groups were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）.The Western blotting results showed that compared with 0 μmol·L－1 motesanib group， the expression levels of EZH2 and p-EZH proteins in the Huh7 cells in 5，10， and 20 μmol·L－1 motesanib groups were increased （P<0.05 or P<0.01）.The CCK-8 results and colony formation experiment results showed that 10 μmol·L－1 motesanib and 5 μmol·L－1 GSK126 could be used for the following pared with control group，the proliferation rates of the Huh7 cells in motesanib group，GSK126 group，and combination group were significantly decreased（P<0.05 or P<0.01）；compared with motesanib group and GSK126 group， the proliferation rate of the cells in combination group was decreased （P<0.01），and the apoptotic rate was increased （P<0.01）.Compared with control group，motesanib group and GSK126 group ， the expression levels of p-AKT and p-ERK proteins in the Huh7 cells in combination group were significantly decreased （P<0.05 or P<0.01）.Conclusion：Motesanib alone has no significantly inhibitory effect on the proliferation and promoting effect on the apoptosis of the liver cancer Huh7 cells，which may be related to the increasing of EZH2 leading to the cell drug resistance.The combination of motesanib and GSK126 enhances the proliferation inhibition and pro-apoptotic effects of motesanib on the Huh7 cells by inhibiting AKT and ERK signaling pathways.
KEYWORDS Motesanib；Hepatocellular carcinoma；Cell proliferation；Apoptosis；Enhancer of zeste homolog 2；GSK126
第 49 卷第 4 期2023 年 7 月吉林大学学报（医学版）
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原发性肝癌最常见的类型，约占原发性肝癌患者总数的90%以上［1］，由于其恶性度高、侵袭快和起病隐匿［2-3］，一般化疗药物难以取得令人满意的效果［4］，且单药治疗易出现耐药，探索新的HCC 治疗药物和用药方式是目前临床上亟待解决的问题。

莫特塞尼作为一种酪氨酸激酶抑制剂，以血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血小板衍生生长因子（platelet derived growth factor，PDGF）和干细胞因子受体为靶点发挥作用［5］，在甲状腺癌、非小细胞肺癌、结直肠癌和乳腺癌模型中均表现出较强的抗肿瘤效果，单药治疗和联合化疗可导致肿瘤消退并抑制肿瘤血管形成和生长［6］，但对肝癌的治疗作用目前尚不清楚。

果蝇zeste基因增强子的人类同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）基因过表达发生在多种人类恶性肿瘤中，EZH2高表达可导致肿瘤细胞耐药［7］。

GSK126是一种有效的EZH2抑制剂，抑制EZH2甲基转移酶的活性可能是治疗高EZH2活性癌症的一个可行策略，进而发挥靶向抗癌作用［8］。

本研究通过观察莫特塞尼和GSK126联合应用对人肝癌Huh7细胞增殖和凋亡的影响，并初步阐明其相关机制，为临床肝癌患者的治疗和合理用药提供实验依据。

1 材料与方法
1.1　细胞、器
主要试剂和仪器 人肝癌Huh7细胞（中国科学院上海细胞库）。

DMEM培养基和胎牛血清（美国Gibco公司），苯甲基磺酰氟（benzenesulfonylfluoride，PMSF）（美国Sigma公司），胰酶消化液、RIPA裂解液和蛋白浓度测定试剂盒［碧云天生物科技（上海）有限公司］，莫特塞尼（美国Selleckchem公司），CCK-8试剂盒（美国GlpBio公司），5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine，EdU）试剂盒（广州锐博生物科技有限公司），一抗EZH2、磷酸化EZH2（phosphorylated EZH2，p-EZH2）、细胞外信号调节激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、磷酸化ERK（phosphorylated ERK，p-ERK）、蛋白激酶B（protein kinase B ，AKT）和磷酸化AKT（phosphorylated AKT，p-AKT）抗体及β-actin抗体和HRP标记的二抗（美国CST 公司）。

低速离心机购于美国Thermo公司。

1.2　组
细胞培养和分组 Huh7 细胞接种于含10%FBS和1%青-链霉素的DMEM培养基中，在37 ℃、5 %CO2条件下传代培养，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.3　CCK-8法检测不同浓度莫特塞尼组及莫特塞尼与GSK126联合应用后各组Huh7率
细胞增殖率 取状态良好的对数生长期Huh7细胞，计数后以每孔5×103 个细胞的密度均匀铺于96孔细胞培养板中，每组设5个复孔，置于37 ℃、5% CO₂孵箱中培养24 h后，分别加入0、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0和60.0 μmol·L－1莫特塞尼。

莫特塞尼按0、5.0和10.0 μmol·L－1浓度给药，GSK126按0、1.0、2.5和5.0 μmol·L－1浓度给药，即分别为对照组，1.0、2.5和5.0 μmol·L－1 GSK126组，5.0和10.0 μmol·L－1莫特塞尼组，不同浓度莫特塞尼+不同浓度GSK126组。

培养48 h，每孔加入10 μL CCK-8，再继续孵育0.5~1.0 h，每隔30 min低速震荡10 s，采用酶联免疫分析仪检测波长450 nm处每孔吸光度（A）值，计算各组细胞增殖率。

细胞增殖率=（实验组A值－空白组A值）／（对照组A值－空白组A值）×100%。

实验重复3次。

1.4　Western blotting法检测各组Huh7细胞中EZH2和p-EZH2蛋白表达水平
蛋白表达水平 Huh7细胞分为0、2.5、5.0、10.0和20.0 μmol·L－1莫特塞尼组。

采用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液提取各组细胞总蛋白，使用BCA工作液对提取的蛋白进行定量分析。

10%SDS-PAGE电泳分离等量蛋白质将其电转移至PVDF 膜上，2% BSA 室温封闭2 h，随后加入EZH2和p-EZH2抗体，4 ℃过夜孵育，次白TBST洗膜后加入HRP标记二抗，室温孵育2 h，ECL化学发光法成像，采用Image J软件分析各蛋白条带灰度值。

目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin蛋白条带灰度值×100%。

实验重复3次。

1.5　克隆形成实验检测各组Huh7细胞克隆形成情况
情况 对数生长期Huh7细胞经消化、离心和重悬后计数，均匀接种于12孔细胞培养板中，每孔500个细胞，置于37 ℃、5 %CO2培养箱中培养。

待细胞贴壁后，分别加入0、5.0和10.0 μmol·L－1莫特塞尼，每组4孔，然后将不同浓度（0、1.0、2.5和5.0 μmol·L－1） GSK126分别加入至不同浓度莫特塞尼组中，即分别为对照组，1.0、2.5和5.0 μmol·L－1 GSK126组，5.0和10.0 μmol·L－1莫特塞尼组，不同浓度莫特塞尼+不同浓度GSK126
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梁媛媛，等. 莫特塞尼与EZH2抑制剂GSK126联合应用对肝癌Huh7细胞增殖和凋亡的影响及其机制
组。

继续培养14 d，弃去上清后PBS缓冲液洗涤2次，加入4%多聚甲醛固定，室温固定30 min，结晶紫染色30 min，最后PBS缓冲液洗涤3次，观察并计数结晶紫染色后的克隆形成数，将12孔细胞培养板倒置拍照。

1.6　EdU荧光染色法检测各组Huh7率
细胞增殖率 取对数生长期Huh7细胞，用胰酶消化、重悬后，按照每孔（3~4）×104 个细胞密度均匀接种于共聚焦培养皿中，并放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养。

待细胞贴壁后分为对照组、莫特塞尼（10.0 μmol·L－1）组、GSK126（5.0 μmol·L－1）组和联合组（10.0 μmol·L－1莫特塞尼+5.0 μmol·L－1 GSK126），按照分组方法分别加入不同浓度莫特塞尼和GSK126，对照组加入等体积二甲亚砜。

按照说明书进行EdU 标记、细胞固定和染色，染色完成后采用共聚焦显微镜获取图像。

采用Image J 软件分析荧光强度，计算各组细胞增殖率。

细胞增殖率=EdU 荧光强度/DAPI 荧光强度×100%。

实验重复3次。

1.7　流式细胞术检测各组Huh7率
细胞凋亡率 将Huh7细胞接种于培养皿中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培养24 h，分组方法见“1.6”。

培养48 h后收集各组细胞，采用不含EDTA的胰酶消化，离心后加入100 μL结合缓冲液轻柔吹打，在避光条件下用5 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL 7-AAD标记，震荡混匀，室温孵育20 min后加入400 μL结合缓冲液吹打混匀，采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。

实验重复3次。

1.8　Western blotting法检测各组Huh7细胞中ERK、p-ERK、AKT和p-AKT蛋白表达水平
蛋白表达水平 细胞分组方法见“1.6”。

用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液提取各组细胞总蛋白，采用BCA工作液对提取的蛋白进行定量分析。

10%SDS-PAGE电泳分离等量蛋白质将其电转移至PVDF 膜上，2% BSA 室温封闭2 h，随后加入AKT、p-AKT、ERK和p-ERK抗体，4 ℃过夜孵育，次日TBST洗膜后加入HRP标记二抗，室温孵育2 h，ECL化学发光法成像，采用Image J 软件分析各目的蛋白条带灰度值，计算目的蛋白表达水平。

目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/β-actin 蛋白条带灰度值×100%。

实验重复 3 次。

1.9　统计学分析
统计学分析 采用SPSS 23.0 统计软件进行统计学分析。

各组细胞增殖率、凋亡率及各组细胞
中EZH2、p-EZH2、AKT、p-AKT、ERK和p-ERK蛋白表达水平均符合正态分布，以x±s表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用SNK-q检验。

以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1　不同浓度莫特塞尼组Huh7率
细胞增殖率 随着莫特塞尼浓度升高，各组Huh7细胞增殖率逐渐降低，与0 μmol·L－1莫特塞尼组比较，20.0、40.0和60.0 μmol·L－1莫特塞尼组Huh7细胞增殖率明显降低（P<0.05或P<0.01），20.0 μmol·L－1莫特塞尼组Huh7细胞增殖率为（50.15±3.56）%。

为减少药物用量和不良反应，选择5.0和10.0 μmol·L－1莫特塞尼进行后续实验。

见表1。

2.2　不同浓度莫
不同浓度莫特特塞尼组Huh7细胞中EZH2和p-EZH2蛋白表达水平
蛋白表达水平 与0 μmol·L－1莫特塞尼组比较，5.0、10.0和20.0 μmol·L－1莫特塞尼组Huh7细胞中EZH2蛋白表达水平明显升高（P< 0.01），2.5、5.0、10.0和20.0 μmol·L－1莫特塞尼组Huh7细胞中p-EZH2的蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。

见图1。

2.3　莫特塞尼与GSK126联合应用后各组Huh7细胞增殖率
胞增殖率 与对照组比较，其余各组Huh7细胞增殖率均明显降低（P<0.05）；与5.0 μmol·L－1莫特塞尼组比较，5.0 μmol·L－1莫特塞尼+不同浓度GSK126组细胞增殖率均明显降低（P<0.05）；与10.0 μmol·L－1莫特塞尼组比较，10.0 μmol·L－1莫特塞尼+不同浓度GSK126组细胞增殖率明显降低（P<0.05）。

见表2。

表1　不同浓度莫特塞尼组Huh7细胞增殖率
Tab
Tab..1　Huh
Proliferation rates of Huh77differen
cells in different t concentrations of motesanib groups (n=3，x±s，η/%）Group
Motesanib[c B/(μmol·L－1)]
1.0
5.0
10.0
20.0
40.0
60.0
Proliferation rate
100.00±0.01
93.74±3.73
84.88±2.74
73.37±3.46
50.15±3.56*
16.07±0.70**
17.47±0.45**
*P<0.05，**P<0.01 vs 0 μmol·L－1 motesanib group.
899
第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月
吉林大学学报 （医学版） 2.4　莫特塞尼与GSK126联合应用后各组Huh7细胞克隆形成情况　与对照组（0 μmol ·L －1莫特塞尼+ 0 μmol ·L －1 GSK126组）和单一用药组比较，不同浓度莫特塞尼+不同浓度GSK126组Huh7克隆形成数明显减少，且随着联合用药浓度的增加进一步减少。

结合“2.3”中的结果，选用10.0 μmol ·L －1莫特塞尼和5.0 μmol ·L －1 GSK126进行后续实验。

见图2。

2.5　EdU 荧光染色法检测各组Huh7 细胞增殖率　共聚焦显微镜下观察各组Huh7细胞增殖情况见图3。

与对照组（5
3.67%±3.28%）比较，莫特塞尼组（31.00%±2.31%）、GSK126组（29.33%±2.60%）和联合组Huh7 细胞增殖率（11.00%±1.53%）明显降低（P <0.05或P <0.01）；与莫特塞尼组和GSK126组比较，联合组Huh7 细胞增殖率明显降低（P <0.01）。

2.6　各组Huh7细胞凋亡率细胞凋亡率 与对照组（7.30%± 0.45%）比较，莫特塞尼组（11.53%±1.08%）、GSK126组（18.44%±1.92%）和联合组Huh7细胞凋亡率（51.38%±2.57%）明显升高（P <0.05或P <0.01）；分别与莫特塞尼组和GSK126组比较，联合组Huh7细胞凋亡率明显升高（P <0.01）。

见图4。

2.7　各组Huh7细胞中AKT 、p -AKT 、ERK 和p -ERK 平蛋白表达水平 与对照组、莫特塞尼组和GSK126组比较，联合组Huh7细胞中p -AKT 和p -ERK 蛋白表达水平明显降低（P <0.05或P <0.01），AKT 和ERK 蛋白表达水平差异无统计学意义（P >0.05）。

见图5。

3 讨 论
原发性肝癌是全球第三大常见癌症死亡原因［9］，由于其起病隐匿且易发生转移，多数患者一经发现便已处于晚期，由于传统化疗药物的不良反应很大且易发生耐药，患者难以坚持治疗，且治疗效果不佳［10］。

近年来，随着分子靶向药物的不断出现和新型抗癌药物的问世，多药联合应用可提高抑制肝癌的作用并可减少药物不良反应［11］。

Lane 1—5：0，2.5，5.0，10.0，and 20.0 μmol·L -1 motesanib groups.*P <0.01 vs 0 μmol·L -1 motesanib group.
图1　Western blotting 法检测各组Huh7细胞中EZH2和p -EZH2蛋白表达电泳图（A ）和直条图（B ）
Fig. 1　Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of EZH2 and p -EZH2 proteins in Huh7 cells in various groups detected by Western blotting method
表2　莫特塞尼与GSK126联合应用后各组Huh7细胞增殖率
Tab Tab..2　Prolife Proliferation Huh ration rates of Huh77gr cells in various groups oups after treated with motesnib combined with GSK after treated with motesnib combined with GSK126126
(n =3，x ±s ，η/%）
Group Control
GSK126(μmol ·L －1) 1.0 2.5 5.0
Motesanib(μmol ·L －1) 5.0 10.0
Motesanib(μmol ·L －1)+GSK126(μmol ·L －1) 5.0±1.0 5.0±2.5 5.0±5.0 10.0±1.0 10.0±2.5 10.0±5.0
Proliferation rate 100.00±0.0287.20±0.43*85.14±1.78*73.50±0.71*87.49±1.81*74.74±1.68
*
81.79±0.84*△73.67±0.20*△46.26±1.33*△63.97±1.12*#52.07±2.83*#35.12±0.58*#
*
P <0.05 vs control group ；△
P <0.05 vs 5.0 μmol ·L
－1
motesanib
group ；#
P <0.05 vs 10.0 μmol ·L －1
motesanib group.
900
梁媛媛， 等. 莫特塞尼与EZH2抑制剂GSK126联合应用对肝癌Huh7
细胞增殖和凋亡的影响及其机制
图2　莫特塞尼与GSK126联合应用后各组Huh7细胞克隆形成情况
Fig. 2　
Clone formations of Huh7 cells in various groups after treated with motesanib combined with GSK126
图3　共聚焦显微镜下观察各组Huh7细胞EdU 荧光染色情况 (Bar= 50 μm)
Fig. 3　EdU fluorescence staining of Huh7 cells in various groups observed under confocal microscope (Bar=50 μm)
901
第 49 卷 第 4 期 2023 年 7 月
吉林大学学报 （医学版） 莫特塞尼在实体瘤的1期/2期研究中也表现出抗癌活性，包括卵巢癌、输卵管癌、转移性乳腺癌、甲状腺癌和非鳞状非小细胞肺癌［12］，但是对肝癌的作用少有报道。

靶向药在治疗上具有单一性而癌症又多有突变性，疗效往往不能达到预期［13］，而且治疗的中后期患者可出现耐药，尤其是接受酪氨酸激酶抑制剂治疗的患者［14］，因而限制了该类药物的广泛应用。

耐药也是影响晚期肝癌患者疗效的主要因素，在采用莫特塞尼治疗阶段，肝癌患者同样面临耐药后肝癌进展的风险［15］。

研究［7，16］表明：EZH2基因过表达发生在多种人类恶性肿瘤中，EZH2高表达可导致肿瘤细胞耐药。

本研究采用不同浓度莫特塞尼处理人肝癌Huh7细胞，随着药物浓度的增加，细胞增殖率逐渐降低，20.0 μmol ·L －1时达到半数抑制量，且随着莫特塞尼浓度的增加，EZH2蛋白表达水平也逐渐升高，推测单独使用莫特塞尼对Huh7细胞抑制效果并不理想，可能与EZH2蛋白表达水平升高导致肝癌细
胞出现耐药有关。

GSK126是一种新型的选择性酶活性抑制剂，可通过抑制EZH2组蛋白甲基转移酶的功能，降低细胞中组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化（rimethylated histone H3 at lysine 27，H3K27me3）水平，从而发挥其靶向EZH2的抗肿瘤作用［17］。

为取得更好的抑癌效果而非无限增大用药剂量，本研究将莫特塞尼和GSK126联合应用于Huh7细胞，结果显示：与对照组和单一用药组比较，较小浓度莫特塞尼和GSK126联合应用可有效抑制细胞增殖，且具有协同作用，EdU 荧光染色实验结果也得出相同结论，同时莫特塞尼和GSK126联合应用可明显促进Huh7细胞凋亡，提示联合用药组在抑制Huh7细胞增殖和促进细胞凋亡方面更为有效。

AKT 是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol -3 kinase ，PI3K ）的直接下游效应者，其各种亚型参与体细胞过表达和突变［18］，磷酸化是AKT 激活的主要机制，
AKT
A ： Control group ；
B ： Motesanib group ；
C ： GSK126 group ；
D ： Combination group.
图4　流式细胞术检测各组Huh7细胞凋亡率
Fig. 4　
Apoptotic rates of Huh7 cells in various groups detected by flow cytometry
Lane 1：Control group ； Lane 2：Motesanib group ； Lane 3：GSK126 group ； Lane 4：Combination group.*P <0.01 vs control group ；△
P <0.01 vs motesanib group ；#P <0.05，##P <0.01 vs GSK126 group.
图5　Western blotting 法检测各组Huh7细胞中AKT 、p -AKT 、ERK 和p -ERK 蛋白表达电泳图（A ）和直条图（B ）Fig. 5　Electrophoregram (A) and histogram (B) of expressions of AKT,p -AKT,ERK,and p -ERK proteins in Huh7 cells in various groups detected by Western blotting method
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梁媛媛，等. 莫特塞尼与EZH2抑制剂GSK126联合应用对肝癌Huh7细胞增殖和凋亡的影响及其机制
信号通路参与细胞凋亡和分化等一系列细胞生理活动［19］。

细胞外信号调节激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）位于丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK）信号通路下游，在受到外部刺激时，ERK1/2通路也会部分参与调控细胞增殖、分化和凋亡等［20-21］。

PI3K/AKT通路可以被EZH2激活，加速肿瘤细胞DNA复制，反之抑制EZH2可以促进细胞凋亡［22-23］。

研究［24］显示：EZH2过表达是由激活ERK1/2通路引起的。

本研究结果显示：与对照组和单一用药组比较，莫特塞尼和GSK126联合组Huh7细胞中p-AKT和p-ERK蛋白表达水平明显降低，而AKT和ERK蛋白表达水平无明显变化，表明联合用药可能抑制AKT和ERK 通路的磷酸化，进而抑制肝癌细胞增殖，促进细胞凋亡。

综上所述，莫特塞尼联合GSK126可同时抑制AKT和ERK通路，增强莫特塞尼诱导肝癌细胞凋亡的作用，提高莫特塞尼的效能，二者具有协同作用。

本研究结果为莫特塞尼和GSK126联合应用抗HCC作用机制的研究提供了理论依据，莫特塞尼联合GSK126是否可以通过调节其他途径抑制HCC仍需要进一步研究。

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