病毒毒价的测定

1.病毒毒价的测定（微量法）
(1) 病毒的制备将病毒接种于单层细胞，37℃吸附1h后加入维持液，置温箱培养；逐日观察，待细胞病变（CPE）达75%以上，收获病毒悬液冻融或超声波处理，以3 000r/min离心10min，取上清液，定量分装成1ml小瓶置-70℃保存备用，选用的病毒必须是对细胞有较稳定的致病力。

(2) 病毒毒价测定取置-70℃冰箱保存的病毒一瓶，将病毒在96孔培养板上作10倍递进稀释即10-1，10-2，10-11……，每孔病毒悬液量为50μl，每个稀释度作8孔，每孔加入100细胞悬液，每块板的最后一行设8孔细胞对照，制备细胞悬液的浓度以使细胞在24h内长满单层为度。

把培养板置5%CO2温箱37℃培养，从48-14h逐日观察细胞病变，记录结果。

按Reed和Muench两氏法计算TCID50。

56%-50%
距离比例 = ────────
56%-33%
本例高于50%病毒稀释度的对数为－6，距离比例为0.26，稀释系数的对数为－1。

IgTCID50 = －6＋0.26×(－1)
= －6.3
则TCID50=10-6.3，50即病毒作10-6.3稀释，每孔接种50μl，可使半数组织细胞管发生病变。

2.中和试验
(1) 血清的处理动物血清中，含有多种蛋白质成分对抗体中和病毒有辅助作用，如补体、免疫球蛋白和抗补体抗体等。

为排除这些不耐热的非特异性反应
因素，用于中和试验的血清须经加热灭活处理。

各种不同来源的血清，须采用不同温度处理，猪、牛、猴、猫及小鼠血清为60℃；水牛、狗及地鼠血清为62℃；马兔血清为65℃；人和豚鼠血清为56℃。

加热时间为20-30min，60℃以上加热时，为防止蛋白质凝固，应先以生理盐水作适当稀释。

(2) 稀释血清取已灭活处理的血清，在96孔微量细胞培养板上，用稀释液作一系列倍比稀释，使其稀释度分别为原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64，每孔含量为50μl，每个稀释度作4孔。

(3) 病毒取－70℃冰箱保存的病毒液，按经测定的毒价作200TCID50稀释（与等量血清混合，其毒价为100TCID50）。

如本例病毒价为10-6.3，50μl。

所以应将病毒作2×10-4.3稀释。

(4) 感作每孔加入50μl病毒液，封好盖，置于37℃温箱中和1h。

病毒与血清混合，0℃下，不发生中反应，4℃以上中和反应即可发生。

常规采用37℃作用1h，一般病毒都可发生充分的中和反应。

但对易于灭活的病毒可置4℃冰箱感作，根据不同耐热性的病毒感作温度和时间应有所不同。

(5) 加入细胞悬液在制备细胞悬液时，其浓度以在24h内长满单层为度：血清病毒中和1h后取出，每孔加入100μl细胞悬液。

置5%CO2 37℃温箱培养，自培养48h开始逐日观察记录，14h终判。

由于各种病毒引起细胞病变时间不同，终判时间应根据病毒致细胞病变的快慢而定。

(6) 设立对照为保证试验结果的准确性，每次试验都必须设置下列对照，特别是在初次进行该种病毒的中和试验时，尤为重要。

阳性和阴性血清对照：阳性和阴性血清与待检血清进行平行试验，阳性血清对照应不出现细胞病变，而阴性血清对照应出现细胞病变。

病毒回归试验：每次试验每一块板上都设立病毒对照相馆，先将病毒作0.1、1、10、 100、1000 TCID50稀释，每个稀释度作4孔，每孔加50μl。

然后每孔100μl细胞悬液。

0.1TCID TCID50应不引起细胞病变，而且100TCID TCID50必须引起细胞病变，否则该试验不能成立。

血清毒性对照相：为检查被检血清本身对细胞有无任何毒性作用，设立被检血清毒性对照是必要的。

即在组织细胞中加入低倍稀释的待检血清（相当于中和试验中被检血清的最低稀释度）。

正常细胞对照相：即不接种病毒和待检血清的细胞悬液孔。

正常细胞对照应在整个中和试验中一直保持良好的形态和生活特征，为避免培养板本身引起试验误差，应在每块板上都设立这一对照。

(7) 结果判定和计算当病毒回归试验，阳性、阴性、正常细胞对照相，血清毒性对照全部成立时，才能进行判定，被检血清孔出现100%CPE判为阴性，50%以上细胞出现保护者为阳性；固定病毒稀释血清中和试验的结果计算，是计算出能保护50%细胞孔不产生细胞病变的血清稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。

用Reed和Muench两氏法（或Karber法）计算结果，如表2-26
80%－50%
距离比例＝──────＝0.5
80%－20%
Ig TCID50=高于50％血清稀释度的对数－距离比例×稀释系数的对数
Ig TCID50＝－1.5－0.5×（－0.3）＝－1.35
则TCID50＝10-1.36，50μl
因10-1.35=1/22，即1:22的血清可保护50％细胞不产生病变，1:22就是该份血清的中和抗体效价。

影响中和试验的因素：
(1) 病毒毒价的准确性是中和试验成败的关键，毒价过高易出现假阴性能，过低会出现假阳性。

在微量血清中和试验中，一般使用100-500 TCID50。

(2) 用于试验的阳性血清规戒律，必须是用标准病毒接种易感动物制备的。

(3) 细胞量度的多少与试验有密切关系，细胞量过大或过小易造成判断上的错误，一般以在24h，内形成单层为宜。

(4) 毒价测定的判定时间应与正式试验的判定时间相符。