分子生物学-根癌农杆菌介导柑橘愈伤组织遗传转化

根癌农杆菌介导柑橘愈伤组织遗传转化
1 柑桔材料的准备
不同品种的柑桔胚性愈伤组织保存于MT固体培养基上，每20-25d继代一次。

侵染前转入悬浮MT（附加100μM乙酰丁香酮）培养基中培养4天后用于侵染。

2 农杆菌侵染液的制备
1.农杆菌（保存在-70℃）在含有50 mg·L-卡那霉素的YEB选择培养基上划线
培养，28℃暗培养。

2.长出菌落后，挑取单菌落在新的选择培养基上涂皿。

3.取出培养24小时后的菌落群，再用不加卡那霉素的MT（附加100μM乙酰
丁香酮）液体培养基震荡培养2个小时。

4.用分光光度计测量菌液的OD600值，并用MT液体培养基调整到 OD600=0.5～
1.0进行侵染。

3侵染实验
1.将悬浮培养4d的愈伤组织转入稀释菌液中浸泡20-30 min。

2.用无菌滤纸吸干表面菌液，转到MT基本培养基上，19℃共培养2～3 d。

3.共培养后的愈伤组织在无菌水中轻轻漂洗数次，直至洗液变清为止，再加入
含有400 mg/L头孢霉素的无菌水浸泡20 min，倾去洗液。

4.将外植体置于无菌滤纸上吸干，转入筛选培养基（根据不同的质粒载体添加
不同浓度的筛选剂），28℃暗培养。

4抗性愈伤组织的选择培养和再生（以质粒载体pCAMBIA1303为例）
1.愈伤组织刚转移到筛选培养基上时，应该表现为对照逐渐褐化、死亡，转化
处理的愈伤组织中转化部分逐渐长出新的抗性愈伤组织。

2.将新形成的抗性愈伤组织转至新的筛选培养基上进行继代培养，当得到的抗
性胚性愈伤组织达到一定量时，将一部分转入MT+甘油2%+ Cef 50 mg·L-1的胚状体分化固体培养基上。

3.有球形胚状体开始出现后，将得到的胚状体转入MT+ME 1500 mg·L-1+ Cef
50 mg·L-1培养基上，使胚状体进一步长大，形成子叶型胚状体。

7-9周后，
将子叶型胚状体转入MT+Cef 50 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1 +BA 0.5
mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1培养基上再生芽，1个月后就可见再生芽长出。

当再生芽长到2 cm左右时，将其从基部切下转入1/2MT+Cef 50 mg·L-1+NAA 0.5 mg·L-1 +IBA 0.1 mg·L-1+活性炭0.5 g·L-1培养基上生根，也可以通过试管嫁接的办法（见相应方法说明）再生植株。

5 转化的柑桔材料的PCR鉴定（以gfp基因为例）
质粒DNA的小量制备采用碱裂解法。

采用CTAB法提取植株DNA。

gfp基因的检测：
根据gfp*5基因编码区设计：
５’端引物：（5-TGGCCAACACTTGTCACTAC-3）
３’端引物：（5-AGGACCATGTGGTCTCTCTT-3）。

PCR反应体系为25μl，其中模板0.3-0.5μg，0.2mmol dNTP，
，1XTaq DNA聚合酶Buffer，1U Taq DNA聚合酶。

1.5mmol ·L-1Mgcl
2
循环反应为94℃30s，55℃30s，72℃ 1 min，35个循环。

（其中的参数可以根据基因的不同进行适当的调整）
6 Southern 杂交分析：
酶切及转膜
1.取10μg转基因植株DNA，用限制性内切酶EcoRI（T-DNA内无切点）酶切
12h左右。

2.取1µl电泳检测酶切结果；若酶切完全后，用0.7%琼脂糖凝胶电泳，
0.8~1.0V/cm电泳18~24h。

3.将胶切成膜一样大小和形状；用0.2N HCl变性10min，置于转膜台上，用
0.4N NaOH作为转移缓冲液，将DNA片段转移到Hybond-N+ 尼龙膜上，转
移约24h。

4.转好的膜用2xSSC漂洗两次，各5min。

用滤纸垫夹，80℃真空烘膜2h以
上。

5.取出冷却，置于4℃冰箱保存备用。

分子杂交
1.先将尼龙膜用2xSSC漂洗，凉干后装入杂交炉。

2.加入10~20ml（视尼龙膜的数量而定）预热至65℃的预杂交液置于杂交炉
中。

3.65℃空气恒温摇床预杂交10小时以上。

4.探针标记：采用随机引物法。

依照不同的尼龙膜数量而采用不同的反应体系。

每张膜取100ng探针DNA，加ddH2O至8.0µl，100℃变性10min；取出迅速放入冰中冷却10min；然后加入3.0µl dNTP（dATP+dTTP+dGTP），引物及缓冲液5.0µl，Klenow Fragment酶（1u/µl）1.0µl；最后在分子杂交炉内加入1.0µl α-32P-dCTP，混匀后置于24℃保温3h以上。

5.杂交：在标好的探针中加入600µl预杂交液，敝开管盖，100℃干浴变性
10min；置于冰上冷却5min；一起加入杂交炉，平放65℃空气恒温摇床杂交6h以上。

6.洗膜：杂交完毕后，将膜从杂交筒中取出，用1xSSC（加有0.2%SDS）室
温漂洗1次；然后加预热至65℃的1xSSC洗膜液置于65℃恒温摇床洗1~2次；第一次洗15min，第二次洗的时间依据膜上信号强度而定；洗至膜信号强度为200~300cpm后，取出摆放到滤纸上晾干。

7.压片、放射自显影：膜晾干后，用保鲜膜包平，放入暗夹；然后在暗室中将
膜压在X光片上；扣紧暗夹，放在-70℃冰柜放射自显影4~7d。

8.冲片：放射自显影后，在暗室取出X光片，放入显影液中显影2~5min，置
红光灯下看到明显的杂交带，而背景没有变化为止；在水中迅速过一遍，然后放入定影液中定影20min以上。

7 GUS基因表达的检测
1.经过多代筛选后，取部分抗性愈伤组织或叶片，装入1.5ml Eppendoff管，
加入适量的GUS染色液（X-Gluc 45mg，Chloramphenicol 5mg，
0.1M NaH2PO4 25ml，Triton-100 0.5ml，10%Methanol 10ml；加水至50ml），
于37.0℃保温过夜。

2.75%的酒精洗涤2-3次。

3.然后对染色结果进行观察并拍照。

注意事项：
1.柑桔愈伤组织的准备不以绝对的时间为依据，而是以其所表现出的状态为标
准。

外观表现为松散，颗粒状的较好。

2.从个人的实验的经历来看，转化实验的重复性并不是很好，可能是由于中间
的步骤多，很多很细节的东西都会影响最终的结果，所以对于同一品种应该多重复几次。

其中以愈伤组织的状态和农杆菌生长的状态最为关键。

3.第一次的筛选培养应该有较长的时间（90d左右），这样可以使转化个体与
未转化个体之间有很明显的区别，筛选表现最好的个体继代。

4.筛选培养基应尽量的干燥（可以在超净台上多吹一会，同时培养基不能配的
太稀，这样影响很大），以防止菌的生长并有利于柑桔愈伤组织的生长和分化。

5.酶切转膜时应该选择T-DNA区不超过1个酶切位点的酶进行基因组DNA的
酶切。

6.总体上，嫁接嫁接苗的生长状况明显由于自根苗，因此，推荐使用嫁接的方
式进行成苗。