重组人干扰素α-2b在大肠杆菌中分泌表达

重组人干扰素α-2b在大肠杆菌中分泌表达
卢晨;赵辉;邹文艺;范清林;付永标;宋礼华
【摘要】Because of original human interferon α-2b ( huIFNα-2b) gene sequence in prokaryotic expression system always with low level of target protein, the code of huIFNα-2b gene was mutagenize according to usage in prokaryotic organism without changing the amino acid compsition. The mutated gene of huIFNα-2b was fused to the secretion signal coding sequence of Escherichia coli heat-stable enterotoxin Ⅱ ( ST Ⅱ ) . Primers was designed for introducing fitting restriction sites to the fusion gene, then cloned into vectors pCSE,pET-22b and pPAK4L. They have constitutive expression promoter, T7 promoter and phoA promoter individually. With fusion gene,pCSE expressed huIFNα-2b protein in low yield in different hosts , nearly 50％ of the protein can be secreted. Induced by IPTG, pET-22b gets high level expression of huIFNα-2b in E. coli BL21 , but the ST Ⅱ signal can not be cutted efficiently. In low-phosphate growth media. E. coli W3110 with vector pPAK4L which contains the target gene synthesized approximately 20μg huIFNα-2b/ml A550 unit of cells , and about 30％ of it can be secreted into periplasimic space.%人干扰素α-2b原始基因在重组原核工程菌中表达量偏低,所以我们在不改变干扰素原有氨基酸组成的前提下,根据大肠杆菌密码子偏爱性使用定向突变技术对huIFNα-2b基因进行点突变.将大肠杆菌STⅡ信号肽基因与突变后huIF Nα-2b基因融合并于信号肽5'端和huIFNα-2b基因3'端引入合适的酶切位点.融合基因克隆至载体pCSE,pET-22b和pPAK4L中,此3种载体分别含有组成型启动子、T7启动子和phoA启动子.融合基因在载体
pCSE中表达量很低,其中约有50%的目标蛋白能够成功实现分泌.在E.coli BL21中,pET-22b经过IPTG诱导可以实现huIFNα-2b的高表达,但STⅡ信号肽不能被有效切除.含有phoA启动子的载体pPAK4L其在E.coli W3110中可以实现huIFNα-2b较高水平的分泌表达,经过低磷诱导其表达量最高可至
20μ/g/mL(A550)菌液,约有30%的目标蛋白质信号肽能够被成功切除并分泌到胞间质中.
【期刊名称】《生物学杂志》
【年(卷),期】2011(028)003
【总页数】5页(P58-62)
【关键词】人干扰素α-2b;STⅡ信号肽;分泌;大肠杆菌 W3110
【作者】卢晨;赵辉;邹文艺;范清林;付永标;宋礼华
【作者单位】安徽大学生命科学学院,合肥,230039;安徽安科生物工程(集团)股份有限公司,合肥,230088;安徽安科生物工程(集团)股份有限公司,合肥,230088;安徽安科生物工程(集团)股份有限公司,合肥,230088;安徽安科生物工程(集团)股份有限公司,合肥,230088;安徽大学生命科学学院,合肥,230039;安徽安科生物工程(集团)股份有限公司,合肥,230088
【正文语种】中文
【中图分类】Q789
人干扰素α-2b(huIFNα-2b)成熟蛋白是一种由164个氨基酸构成的多肽,在一定诱导因素的作用下由人体白细胞产生,具有抗病毒、抗肿瘤、影响细胞生长分化和调
节机体免疫功能等活性[1],是发现最早、研究最多、第一个克隆化生产并应用于临床治疗的细胞因子。

人体内IFNα-2b的成熟蛋白具有糖基化位点,利用基因重组技术生产的huIFNα-2b虽不具有糖基化位点但依然具有很强的生物学活性。

目前国内外多家机构已经对重组huIFNα-2b蛋白成功地进行了原核表达,其中多为包涵体形式。

包涵体技术生产huIFNα-2b有如下劣势:1)肽链N端比人体内IFNα-2b成熟蛋白多一个Met,抗体产生的几率增加;2)目标蛋白需要经过变性和复性过程,二硫键错配率高,影响蛋白质活性;3)下游纯化过程复杂,生产成本高。

目标蛋白分泌表达,可以有效避免重组蛋白首位Met的问题,其在转运过程中二硫键形成具有生物学活性的正确构象无需复性[2]。

信号肽被有效切除,目标蛋白分泌至细胞膜和细胞壁的周质又称胞间质[3],可以通过简单的渗透休克法(osmotic shock)对所表达的外源蛋白进行提取纯化[4]。

因此,huIFNα-2b原核分泌表达技术的研究具有积极意义。

我们采用安科生物工程 (集团)股份有限公司自主构建质粒 pCSE,pPAK4L以及购自Promaga公司的pET-22b作为载体。

pCSE载体具有组成型表达启动子,其启动过程无需诱导伴随菌体生长目标蛋白能够实现组成性表达,由于其启动强度不高且外源蛋白易被大肠杆菌蛋白质水解酶分解致使总体表达量偏低; pET-22b载体的 T7启动子属于强启动子在诱导剂IPTG的作用下目标蛋白可以达到快速高通量表达,最适条件下可占菌体总蛋白量 40%,但是此类型启动子强度难以控制不利于目标蛋白质的分泌表达;pPAK4L载体具有启动子 PphoA,它的特点是伴随着培养基中磷元素的消耗逐渐启动,强度适中可控有利于蛋白质分泌表达[5]。

人干扰素α-2b原始基因在重组原核工程菌中表达量偏低,所以我们在不改变干扰素原有氨基酸组成的前提下,根据大肠杆菌密码子偏爱性原则将上游前7个密码子中的其中 3个改造成宿主菌中丰度较高tRNA的密码子类型[6]。

运用基因融合技术将大肠杆菌STⅡ信号肽基因和改造后huIFNα-2b基因进行拼接[7]。

设计引物
于信号肽5′端和huIFNα-2b基因3′端引入酶切位点。

将融合基因片段分别克隆至 pCSE, pET-22b和 pPAK4L中完成huIFNα-2b分泌表达载体构建,见图1使用PCR、双酶切以及碱基测序等鉴定方法均显示分泌表达载体与预计设计目标一致。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、细胞株、病毒株E.coliDH5α(Tiangen公
司);E.coliBL21(DE3)(Solarbio公司);E.coli W3110(ATCC美国标准菌种收藏所)W ISH细胞株(本实验保存);VSV水泡性口腔炎病毒(本实验保存)。

1.1.2 载体 pGEM7zf(-)(Promaga公司);pGEMIFN(本实验室保存);pBR322-
STⅡ(本实验室保存); pCSE、pET-22b、pPAK4L(本实验室保存)。

1.1.3 酶及主要生化试剂BamHⅠ、SalⅠ、NsiⅠ、X hoⅠ、NdeⅠ、HindⅢ以及T4 DNA Ligase(Fermentas公司);质粒抽提试剂盒(Bio Basic公司);胶回收试剂盒(上海华舜生物);PCR产物回收试剂盒 (Bio Basic公司);PCR试剂 (Bio Basic公司);Yeast extract、Typtone(OXOI D公司);N-Z-CASE(SIG MA公司);鼠抗huIFNα-2b单抗(本实验室制备);HRP标记的羊抗鼠lgG(SIG MA公司);DNA Marker-D、蛋白质Marker(上海生工);其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.1.4 培养基
LB培养基:Typtone 10g/L,Yeast extract 5g/L, NaCl 10g/L.调 pH值至 7.4。

Ap5培养基:Typtone 0.6g/L,N-Z-case 11g/L, NaCl 1.2g/L,KCl 3.73g/L,NH4Cl 1.07g/L,MgSO4· 7H2O 0.19g/L,Triethanolamine 0.12mol/L,1.5g/L, Glucose 1.5g/L.调 pH值至 8.0。

1.2 方法
1.2.1 基因操作参考《分子克隆实验指南》(美)J.萨姆布鲁克 D.W.拉塞尔[8]。

1.2.2 琼脂糖凝胶电泳 SDS-PAGE,Western-blot, CaCl2感受态细胞制备,X-gal和
IPTG筛选细菌菌落,生物大分子活性鉴定等。

图1 分泌型重组质粒的构建Fig 1 Construction of plas mid
2 结果
2.1 huIFNα-2b基因改造
1)设计引物。

5′端引物:
2)PCR反应条件。

以 pGEM-IFN为模板,P1a和P2为上下游引物。

预变性:96℃,5min;变性:94℃,1min;退火: 64℃,1min;延伸:72℃,50sec;循环数:32次。

以上一个反应 PCR产物为模板,P1b和 P2为上下游引物。

反应条件不变。

将此PCR产物克隆至pGEM7zf(-)中,送样测序。

得到结果与预期相同, huIFNα-2b基
因上游 3个密码子成功实现点突变。

2.2 STⅡ信号肽基因与突变huIFNα-2b基因融合
1)设计引物。

2)PCR反应条件。

由 pBR322-STⅡ中扩增出STⅡ信号肽基因,将等摩尔数的STⅡ信号肽基因片段和突变后huIFNα-2b基因片段作为模板,加入相应引物P2s和 P3i。

预变性:96℃,5min;变性:94℃,1min;退火:50℃,1min延伸:72℃,1min;循环数:5次。

再加入引物 P1s和 P4i。

预变性:96℃,5min;变性:94℃, 1min;退火:60℃,1min;延伸:72℃,1min;循环数:25次。

PCR产物克隆至 pGEM7zf(-)测序鉴定,结果显示STⅡ信号肽片段与突变huIFNα-2b片段实现基因融合且无非预期突变。

2.3 分泌表达载体的构建
将含有STⅡ信号肽和突变huIFNα-2b基因序列以及酶切位点的重组载体 pGEM-
STIFN转入E.coli DH5α扩增培养,提取质粒进行BamHⅠ、SalⅠ双酶切,电泳回收570bp基因片段。

BamHⅠ、SalⅠ双酶切载体pPAK4L,回收线性化大片段。

使用 T4 DNA连接酶对融合基因片段和载体定向连接,完成分泌表达载体pPSIFN-4L的构建。

再以融合基因为模板设计引物:
将 P5与 P6一组,P7与 P8一组分别作为上下游引物引入酶切位点NsiⅠ与
XhoⅠ;NdeⅠ与HindⅢ。

预变性:96℃,5min;变性:94℃,1min;退火:62℃, 1min;延伸:72℃,1min;循环数:30次。

分别回收 PCR产物连入 pGEM7zf(-)送样测序鉴定,结果证实酶切位点正确引入且融合基因的碱基未发生非预期突变。

NsiⅠ、XhoⅠ双酶切含有目标基因的重组质粒 pGEM7zf(-)和原始质粒 pCSE,回收570bp基因片段和 pCSE线性化大片段,使用 T4 DNA连接酶将基因片段和线性化载体 pCSE连接完成分泌表达重组质粒pCSIFN的构建。

同样方法处理含有酶切位点NdeⅠ、HindⅢ以及融合基因片段的重组质粒pGEM7zf(-)与原始质粒 pET-22b,成功构建另一分泌型表达质粒pESIFN-22b。

重组载体分别转化E.coliDH5α,随机挑取若干克隆提取质粒分别进行 PCR鉴定,鉴定结果见图 2。

设计引物并将阳性克隆送样测序。

图2 重组质粒pPSIFN4L、pCSIFN和pESIFN-22b的 PCR鉴定电泳图谱Fig 2 Assay of plas mids like pPSIFN4L,pCSIFN and pESIFN-226 by PCR
2.4 huIFNα-2b在大肠杆菌中分泌表达与鉴定
2.4.1 表达
将序列分析正确的重组载体 pCSIFN转入 E.coli W3110;重组质粒 pESIFN-22b转
入 E.coliBL21; pPSIFN-4L分别转入 E.coliBL21和 E.coliW3110。

分别挑取单克隆接入到LB培养基(含有Amp 50μg/mL)中37℃、200r/min培养。

pCSIFN_E.coliW3110过夜培养;pESIFN-22b_ E.coliBL21培养 3h后加入 IPTG 诱导培养 10h; pPSIFN-4L_E.coliBL21、pPSIFN-4L_E.coliW3110培养10h后,按1∶10的体积比将 LB菌液接种到低磷培养基Ap5(含有Amp30μg/mL)中,30℃、150r/min诱导16h。

2.4.2 鉴定
1)SDS-PAGE。

以干扰素α-2b标准品为阳性对照,分别取不同载体于不同宿主菌以及诱导前后的菌体沉淀物处理后上样,通过 SDS-PAGE分析比较目标蛋白表达情况,结果如图 3。

从上述 SDS-PAGE电泳图谱中可以看出 pCSIFN表达量很低;pESIFN-22b诱导前几乎没有本底表达, IPTG诱导后表达量很高但信号肽难以有效切除; pPSIFN-4L于E.coliBL21中 phoA启动子在诱导前后没有严密调控关系,诱导后表达量稍
高;pPSIFN-4L于E.coliW3110中 phoA启动子处于严密调控状态,经过低磷诱导培养后目标蛋白大量表达,约有 30%的目标蛋白信号肽成功切除。

图3 表达产物SDS-PAGE图谱Fig 3 Result of expressed products by SDS-PAGE
2)Western-Blot。

将 SDS-PAGE电泳后的凝胶条带转至 PVDF膜上,4℃封闭过夜,洗膜后加入鼠抗huIFNα-2b单抗于37℃温育 2h,洗膜后加 HRP-羊抗鼠IgG于37℃温育 2h,洗去二抗后用 DAB加 H2O2显色如图4。

3)抗病毒活性。

离心菌液弃去上清,沉淀物置于-80℃冷冻 24h再常温解冻,反复此操作 2次。

后将菌体溶解于 Tris-HCl(pH值 8.0)搅拌 1h,离心取上清测定抗病毒活性,实验结果表明相对于阴性对照菌体浸出液具有明显抗病毒活性[9]。

图4 Western blot分析Fig 4 Western blot analysis
3 讨论
目前已有多篇文献报道称成功实现大肠杆菌分泌表达体系的构建,如2001年中国科学院上海生物化学研究所,甘人宝等人成功实现胰高血糖素在大肠杆菌中分泌表达[10]。

针对大肠杆菌分泌表达的研究主要集中在50～200个氨基酸左右的外源蛋白上,其分子量适中可以顺利穿过大肠杆菌细胞膜分泌至周质空间,通过简单的渗透压休克法实现下游纯化。

蛋白质在大肠杆菌中转运、二硫键折叠以及分泌机制都相当复杂,现实中并不是每种符合上述条件的外源蛋白都可以实现胞间质分泌表达。

目标蛋白的N端氨基酸构成、启动子和信号肽的选择、宿主菌的种类以及培养过程中各项指标的控制都会对重组蛋白质的分泌产生很大影响。

常用解决方案有如下几种:
1)启动子的选择。

一般挑选负向调控启动子,如PphoA和 Pbio,或是对强启动子实施部分启动。

蛋白质分泌表达的过程需要经历信号肽识别、跨膜转运、二硫键折叠以及信号肽切除等步骤,降低启动子启动强度有利于分泌过程的实现。

2)信号肽的选择。

通常只有大肠杆菌本身分泌蛋白和膜结合蛋白的信号肽才会被细胞膜上相应位点识别,也有文献报道称少数真核蛋白信号肽亦会被大肠杆菌识别但效率较低。

每种信号肽对于不同的外源蛋白来说表达量和分泌效率都是不同的。

理论上,信号肽 C端氨基酸与外源蛋白N端 3～5个氨基酸的构成对信号肽切割效率有重要影响,实验中可以尝试各种信号肽与目标蛋白质基因融合,比较各种信号肽的优劣。

3)宿主菌的选择。

重组质粒在不同基因型的宿主菌中对目标蛋白的表达和分泌效率也有很大区别,可能是由于启动子的调控与宿主细菌基因型有关;细菌的转运体系、二硫键形成酶和信号肽切割酶也会对蛋白分泌效率造成影响。

采用分子伴侣
PDI(蛋白质二硫键异构酶)与目标蛋白共表达方式或是提高细胞膜上二硫键形成酶DsbA和 DsbB的表达量都已被证实在一定程度上可以提高外源蛋白的分泌效率
[11-12]。

4)培养过程优化。

不同的表达体系选择怎样的培养条件可以达到最理想的产率不能一概而论,通常来说维持较低温度(30℃左右)、低剪切力、较高 pH值(8.0左右)以及高溶氧相对有利于蛋白质分泌表达。

我们对于huIFNα-2b分泌表达的研究取得了一定的进展,也暴露出很多问题。

如强度较弱的组成型启动子对于信号肽和目标蛋白的切割来说较为有利,但表达量太低不具备应用价值;强启动子 T7和 PphoA尽管可以实现高表达,其信号肽切割效率相对低下。

时间限制本实验仅使用了一种信号肽针对不同启动子以及不同宿主细菌对h uIFNα-2b的分泌表达进行了探索,相信对于信号肽、启动子、宿主细菌或是对培养条件进行优化可能会进一步提高huIFNα-2b分泌量,随着研究的深入也一定会有越来越多具有应用价值的医用蛋白可以实现大肠杆菌分泌表达。

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