正交试验优选槲皮素纳米脂质体冻干粉制备工艺

◇药学研究◇
正交试验优选槲皮素纳米脂质体冻干粉制备工艺
王
刚1，2，王
佳1，常明泉1，杜士明1，杨光义1，李发鹏1，蒋安蓉1，向俊伟1
，曾
南
2
（1．湖北医药学院附属太和医院药学部，湖北十堰442000；2．成都中医药大学，四川成都610075）
摘要：目的制备含有不同冻干保护剂的槲皮素纳米脂质体（QUE-NL ）冻干粉，筛选出最佳制备工艺。

方法采用正交试验
法，以纳米脂质体包封率和载药量等作为评价指标，采用多指标综合分析方法优选槲皮素纳米脂质体冻干粉冻干保护剂的最佳比例。

结果槲皮素纳米脂质体冻干粉的最佳制备工艺为水
∶油相比例为1．5∶1．0，冻干保护剂选用麦芽糖和甘露醇，5%甘露醇+5%麦芽糖（1∶1），以此制备工艺制得的纳米脂质体冻干粉包封率和载药量较为理想。

结论以优选工艺制备槲皮素纳
米脂质体冻干粉的方法简易、可行。

关键词：槲皮素；纳米脂质体冻干粉；制备工艺；正交试验
基金项目：湖北省教育厅优秀中青年基金（No Q20102110）
通讯作者：杜士明，男，博士，主任药师，研究方向：中药新制剂与新剂
型，E-
mail ：dsmch@126．com Optimization of preparation procedure for freeze-dried powder
of namo-liposomes of quercetin through orthogonal test
WANG Gang 1，2
，WANG Jia 1，CHANG Ming-quan 1，et al
（1．Department of Pharmacy ，Taihe Affiliated Hospital of Hubei Medical College ，Shiyan ，Hubei 442000；
2．Chengdu University of TCM ，Chendu ，Sichuan 610075）
Abstract ：Aim
To prepare freeze-dried powder of namo-liposomes of quercetin （QUE-LN ）containing different cryoprotectors for search-ing the optimal preparation technology and methods．Methods With orthogonal test ，the drug loading and encapsulation efficiency as e-valuation index ，comprehensive analysis of a multi-indicator approach was made to elect the best optimal proportion for freeze-dried pow-der of QUE-NL between different cryoprotectors．Results
The optimum proportion and composition of freeze －dried powder of QUE-NL
found were as follows ：the percentage of oil phase and aqueous phase was 1．5∶1．0；maltose and mannitol was chosen as the cryoprotecto-rs and the ratio between 5%maltose and 5%mannitol was 1∶1．Such freeze-dried powder of QUE-NL had high drug entrapment efficien-cy and drug loading．Conclusion
In this paper ，the method of preparing craft for freeze-dried powder of QUE-NL was easy and feasible．
Key words ：quercetin ；freeze-dried powder of namo-liposomes ；preparation procedure ；orthogonal test 槲皮素（quercetin ，QUE ）为一种天然的黄酮类化合物，研
究发现槲皮素抑瘤作用主要表现在：抑制多种肿瘤细胞的增殖，
促细胞分化诱导细胞凋亡；逆转肿瘤细胞的多药耐药性；与其他药物联合应用时增强其抗肿瘤作用等［1］。

由于槲皮素不溶于水、导致吸收受限、难以在脑组织中达到有效的治疗
浓度［2］
，限制了槲皮素抗脑肿瘤临床应用。

解决这个问题方法之一是通过剂型的改进达到目标，现有研究已证明纳米脂
质体可显著增加药物在脑部的转运量，
其包封药物后形成脂质膜，较单体药物分子易于透过血-脑屏障（BBB ）。

已有报道
提示槲皮素纳米脂质体能增加槲皮素溶解度，
更适于癌细胞的摄取，也适于体内动物实验［3］
，具有比槲皮素更广泛的用
途。

然而，
普通脂质体由于存在生物利用度较低，而纳米脂质体混悬液长期保存容易变质等不足之处，因此，研制出一种高效、稳定、低毒副作用的靶向药物载体，能有效提高生物利用度和药物浓度，
且具有稳定的物理特性和便于长期保存，为槲皮素进一步有效地用于抗大鼠C6脑胶质瘤实验研究奠定基础。

本实验为制备稳定的物理特性和便于长期保存的槲皮素纳米脂质体冻干粉，将槲皮素纳米脂质体冻干粉制备工艺优
化，现报道如下。

1材料及仪器
山嵛酸甘油酯（武汉祥和精细化工有限公司，批号100305）、大豆卵磷脂（武汉祥和精细化工有限公司，批号100310）、胆固醇（武汉祥和精细化工有限公司，批号100305）、聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（PEG2000-DSPE ，武汉祥和精细化工有限公司，批号100305）、吐温-80（聚山梨酯-80，上海化学试剂厂，批号20081006）、泊洛沙姆188（武汉祥和精细化工有限公司，批号100310）、甘露醇（上海化学试
剂厂，
批号20090519）、麦芽糖（中国医药上海化学试剂公司，批号20090227）、槲皮素（自制，批号20100714，纯度89．8%）、槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所，批号100081-200406）、甲醇为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯；DF-101S 集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义市英峪予华仪器厂）、
戴安3000型高效液相色谱仪、Zetasizer3000粒径测定仪（英国Malvem 公司）、TGL-16G 台式高速离心机（上海安亭科
学仪器厂）、
FD-1C-80冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）、JEM-2010透射电子显微镜（日本电子公司）、电子天平
（熊猫集团南京电子计量有限公司）。

2方法与结果
2．1槲皮素纳米脂质体冻干粉的制备2．1．1
水相溶液制备
称取适量的泊洛沙姆188和聚乙二
醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，加入适量吐温-80构成水相，水浴加热至（75ʃ5）ħ。

2．1．2油相溶液制备精确称取适量山嵛酸甘油酯和胆固醇，80ħ水浴熔融；精确称取适量槲皮素和大豆卵磷脂，共溶于丙酮∶乙醇（1∶1）溶剂中，混合后成油相。

2．1．3槲皮素纳米脂质体冻干粉制备采用乳化蒸发低温固化法制备［4，5］。

将水相置于75ħ水浴中，以500 800r·min－1转速搅拌0．5h，采用6号针头将油相注入水相中（注射速度2ml·min－1），进行包封、搅拌2h。

然后将搅拌的脂质体置于－4ħ冰水浴中进行低温固化，加5%甘露醇+5%麦芽糖溶液（12ml），搅拌1h，制得槲皮素纳米脂质体混悬液。

将槲皮素纳米脂质体混悬液按每瓶2ml分装于安瓿中，在－40ħ的超低温冰箱中预冻6h，然后迅速移入冷冻干燥机中干燥24h。

将备好的安瓿瓶放入冷冻干燥机，按照0．5ħ·min－1降温至－35ħ并维持24h，在冷凝器低温、干燥箱保持一定真空度条件下，按照0．07、0．04、0．07ħ·min－1三阶段升温至25ħ，保温10h左右，取出样品，氮气封口，制得槲皮素纳米脂质体冻干粉。

2．2槲皮素纳米脂质体冻干粉的制备工艺的考察影响槲皮素纳米脂质体冻干粉制备工艺的主要因素是：水相与油相体积比（A）、冻干保护剂与脂质体体积之间比例（B），冻干保护剂之间比例（甘露醇∶麦芽糖）（C）和乳化搅拌速度（D），以包封率和载药量等作为评价指标。

结合文献和预试验结果，以上述4个主要因素为考察因素，每个因素设立3个水平（表1），采用L
9
（34）正交设计，以包封率、载药量等作为评价指标为指标进行综合加权评分，按下列公式进行计算：综合加评分=包封率得分ˑ60%+载药量得分ˑ40%，其中以包封率和载药量最大值为100分，计算包封率和载药量得分，考察各因素对包封率和载药量的影响，优选槲皮素纳米脂质体冻干粉的制备工艺，试验安排及结果见表2。

试验方差分析见表3。

表1试验因素水平表
水平
因素
A B C D
1
2
3
1∶1
1．5∶1
2∶1
1∶1
1∶2
2∶1
1∶2
1∶1
2∶1
400r·min－1
600r·min－1
800r·min－1
表2L9（34）正交试验结果及综合评分
试验号A B C D包封率/%载药量/%综合得分1111158．053．4859．09 2122270．103．7766．35 3133327．812．7534．83 4212391．987．1599．99 5223169．264．0265．24 6231271．224．7466．73 7313240．861．6742．25 8321358．312．9857．18 9332151．372．5948．47Ⅰ160．27201．34183．0172．80
Ⅱ231．96188．77214．82175．33
Ⅲ147．90150．03142．32191．55
R84．0651．3172．5018．75
表3试验方差分析表
误差来源SS f MS F P A291．322147．1614．78＜0．01
B106．70254．855．51＜0．05
C218．012109．5110．99＜0．01
D13．9227．330．74＞0．05
由表3方差分析可知：因素A、B、C对槲皮素纳米脂质体冻干粉的制备工艺有显著性影响，通过方差比较可见影响槲皮素纳米脂质体冻干粉质量的主次因素依次是A＞C＞B，而因素D对制备工艺无显著性影响，可以得到A2B1C2为最优的组成及工艺，即采用：水相与油相体积比（1．5∶1）、冻干保护剂之间比例（1．0∶1．0），冻干保护剂采用甘露醇和麦芽糖（1∶1）为最佳制备工艺。

2．3槲皮素纳米脂质体冻干粉工艺验证及质量评价2．3．1形态及粒径观测所得槲皮素纳米脂质体冻干粉均为淡黄色、疏松块状物，表面光洁细腻，振摇后能整块脱落。

取分装好的槲皮素纳米脂质体冻干粉1支，加水3ml振摇，可形成均匀的淡黄色混悬溶液，表明制得的纳米脂质体冻干粉分散性良好。

加水稀释后，以5%葡萄搪溶液稀释，经2%磷钨酸染色于透射电镜下观察粒子形态（图1），于测量小杯中置激光粒度分析仪检测其粒径分布，用透射电镜观察（图2）。

由图可知，制备的槲皮素纳米脂质体冻干粉的平均粒径为182．8nm，粒径100 300nm。

图1槲皮素纳米脂质体冻干粉的粒子形态透射电镜照片（ˑ10000K）
图2槲皮素纳米脂质体冻干粉粒径及其分布
2．3．2冻干粉包封率的测定精密称取在105ħ减压干燥至恒重的槲皮素对照品10．0mg，加甲醇超声溶解，定容至50 ml的溶液，即得对照品溶液。

分别进样槲皮素对照品溶液0．1，2．0，4．0，6．0，8．0，10．0μl以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归，标准曲线方程为：A=0．9169C－1．0851（r=0．9998），Diamonsil-C
18
色谱柱（250mmˑ4．6mm，5
μm）；流动相：甲醇-4．3%乙酸溶液（55∶45）；流速为1．0ml
·min－1
；
检测波长为254nm；柱温30ħ［4］。

进样量20μl。

用高速离心法分离脂质体与游离药物。

精密吸取槲皮素纳米脂质体冻干粉混悬液1．0ml，置于塑料小管中，16000r ·min－1高速离心15min，取上清液进样测定，即得游离药物
（W
游
）。

精密量取槲皮素脂质体溶液1．0ml，置10ml棕色容量瓶中，加入10%Triton X-100乙醇溶液0．5ml破乳，甲醇溶液定容至刻度，摇匀，HPLC法测定1．0ml脂质体混悬液中总药物量（W总）（空白脂质体混悬液在同样条件下处理，在药物峰位处无干扰），包封药物量（W包封）=总药物量（W总）－游离药物（W游）。

HPLC法测定药物浓度，计算包封率，包封率计算方法如下：包封率=（每毫升脂质体混悬液中含被包封的槲皮素的克数/每毫升脂质体混悬液中含槲皮素总克数）ˑ100%。

A．槲皮素对照品B．槲皮素纳米脂质体冻干粉C．空白纳米脂质体冻干粉图1槲皮素对照品和槲皮素纳米脂质体冻干粉的HPLC图（保留时间：11．51min）
2．3．3载药量的测定用高速离心法分离脂质体与游离药
物。

精密吸取槲皮素纳米脂质体冻干粉混悬液1．0ml，置于
塑料小管中，16000r·min－1高速离心15min，取上清液进样
测定，即得游离药物（W游）。

精密量取槲皮素纳米脂质体冻
干粉溶液1．0ml，置10ml棕色容量瓶中，加入10%Triton X
－100乙醇溶液0．5ml破乳，甲醇溶液定容至刻度，摇匀，
HPLC法测定1．0ml纳米脂质体冻干粉混悬液中总药物量
（W
总），包封药物量（W
包封
）=总药物量（W
总
）－游离药物
（W
游
）。

载药量计算方法如下：载药量=（每毫升脂质体混悬液中含被包封的槲皮素的克数/每毫升脂质体混悬液中含大豆卵磷脂的总克数）ˑ100%。

2．4最佳工艺验证结果包封率和载药量测定：按上述最佳组合进行实验，设计了三组实验，其结果见表4。

表4最佳工艺验证结果
序号123
包封率/%载药量/%81．37
6．32
82．54
7．02
81．49
6．46
3讨论
纳米脂质体能提高药物的疗效和减少不良反应，而且能选择性地趋向肿瘤组织并保持较高的药物浓度［3］。

国外学者研究报道使用吐温-80包裹的纳米脂质体可显著增加药物在脑部的转运量，其包封药物后形成纳米脂质体，较单体药物分子易于透过血-脑屏障（BBB）［6］；而纳米脂质体混悬液以水分散系形式贮存时，由于其成膜材料易氧化导致性质不稳定，如导致粒径增大、存在多分散体系等，防止纳米脂质体混悬液的氧化可用氧化剂，而其水解是难以避免的。

理论上制成冻干粉避免水解能够提高纳米脂质体稳定性，冻干粉中的冻干保护剂可以保持脂质体膜结构的稳定性，显著降低药物和脂质体的水解和氧化速度。

在槲皮素纳米脂质体混悬液基础上制备冻干粉是一种有效地提高制剂贮存稳定性的方法。

本研究采用乳化蒸发低温固化法和冷冻干燥法制备槲皮素纳米脂质体冻干粉，结果表明冻干保护剂采用甘露醇和麦芽糖（1∶1）为最佳制备工艺，采用冷冻干燥法制备冻干粉是利用一定真空条件下缓缓将槲皮素纳米脂质体从－35 －25ħ，－25 －10ħ，－10 5ħ升温，共计约35h，此阶段大约能除去95%的水分，实验中解吸干燥温度为10 30ħ，再干燥5、6h即可。

此外，制备脂质体时溶解脂质膜材经常使用的有机溶剂会严重影响脂质体的使用安全性，本实验在制备脂质体冻干粉的过程中采用真空干燥方法挥干有机溶剂，研究表明真空干燥法能有效除去有机溶剂丙酮和乙醇［7］，但是有待于进一步检验脂质体冻干粉中的有机溶剂残留量。

研究表明槲皮素水溶性与脂溶性均较差［8，9］，实验结果表明以乳化蒸发低温固化法和冷冻干燥法制备的槲皮素纳米脂质体冻干粉在增加槲皮素溶解度的同时具有较为理想的包封率和载药量。

综上，本研究通过采用乳化蒸发低温固化制备槲皮素纳米脂质体冻干粉，对影响最终产物包封率和粒径的工艺条件进行较为深入的研究并对制备处方及工艺进行了优化。

为进一步探讨其对C6脑胶质瘤的体内作用，有助于
精油对全麻大鼠促醒效应的实验研究
方文恒，徐金勇，任振华，李光武
（安徽医科大学神经生物研究所，安徽合肥230032）
摘要：目的研究精油对全麻的促醒效果。

方法该研究选用了PM、迷迭香、薰衣草精油及三种全麻药戊巴比妥钠、丙泊酚和氯胺酮，通过吸嗅器械分别观察了：吸嗅PM、迷迭香（RM）、薰衣草（LA）精油对戊巴比妥钠全麻大鼠睡眠时间的影响；不同吸嗅浓度的薰衣草精油是否改变戊巴比妥钠（PTB）全麻大鼠的睡眠时间以及吸嗅PM精油分别对丙泊酚（PRO）和氯胺酮（KET）全麻大鼠睡眠时间的影响。

结果PM精油可明显降低戊巴比妥钠和丙泊酚诱导的睡眠时间，而对氯胺酮则无明显效果；薰衣草精油在给定吸嗅浓度下也存在促醒效果。

结论吸嗅PM精油和特定浓度的薰衣草精油对全麻大鼠具有促醒效应。

关键词：全麻促醒；精油；吸嗅；嗅觉通路；LORR time
Effects of essential oils on wake-promoting of general anesthesia in rats
FANG Wen-heng，XU Jin-yong，REN Zhen-hua，LI Guang-wu
（Institute of Neurobiology of Anhui Medical University，Hefei230032）
Abstract：Aim To research the effects of essential oils on wake-promoting of general anesthesia．Methods Three kinds of essential oil PM，rosemary，lavender oil and three kinds of anesthetics pentobarbital（PTB），propofol（PRO），ketamine（KET）were used in our study．We investigated the effects of PM，rosemary，lavender oil on PTB-induced general anesthesia，whether various concentrations of lavender oil affected PTB-induced general anesthesia and the effects of PM oil on PRO，KET-induced general anesthesia．Results It in-dicated that PM oil reduced PTB and PRO-induced general anesthesia duration significantly while the anesthesitic KET had no significant effect．In addition，lavender oil had wake-promoting effect in given concentration．Conclusion It could have wake-promoting effect of general anesthesia in rats by inhalation of PM oil and lavender oil in given concentration．
Key words：wake-promoting of general anesthesia；essential oils；inhalation；olfactory pathway；LORR time
全麻完成后，如何让病人尽早从麻醉状态恢复，或减少麻醉时间，降低麻醉风险是引人关注的问题。

麻醉终止，但病人受麻醉的影响并未消除，在此时期病人的保护性反射都不足，其潜在的危险性并不亚于麻醉诱导时［1，2］。

许多全麻药物都存在或多或少的副作用，如认知功能障碍：短时记忆、长时记忆障碍及顺行性、逆行性遗忘等。

有报道丙泊酚同时具有顺
基金项目：国家自然科学基金（No81000589）；安徽省自然科学基金（No090413145）
通讯作者：李光武，男，博士，副教授，研究方向：嗅觉通路与芳香疗法，E-mail：guangwuli@sina．com 行性遗忘和逆行性遗忘作用；而咪达唑仑可产生呼吸抑制及顺行性遗忘。

另外，麻醉时间较长易引起低氧血症，苏醒期过程较长，容易出现躁动、苏醒延迟等并发症［3］。

已有研究表明芳香物质或精油具有促醒效果［4］。

吸嗅精油的促醒效应可能机制为精油组分产生的效应即通过嗅觉通路作用于脑部特定区域［5］。

神经行为学研究提示精油或芳香物质对动物具有兴奋或镇静效应。

通过小鼠自发活动来测试一系列精油和芳香物质通过吸嗅方法诱导的镇静［6］，小鼠腹腔注射PM精油增加了促进跑动效应［7］，而薰衣草精油或其主要组成成分芳樟醇和
中药有效成分槲皮素应用于治疗脑胶质瘤的新制剂、新途径的探讨，具有重要的学术与应用价值。

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（收稿日期：2011－05－11）。