小麦萌发前后淀粉酶活力的比较

小麦萌发前后淀粉酶活力的比较及电泳法测定蛋白
一.实验目的
1.掌握利用光照培养箱培养小麦的方法；
2.了解酶的制备及活力测左的一般原理与方法；
3.掌握淀粉酶的活力测左技术，了解小麦萌发前后淀粉酶活力的变化：
4.巩固对721或722S型分光光度计和离心机的熟练使用；
5.灵活运用3, 5-二硝基水杨酸比色法测泄样品中还原糖含量的原理和方法；
6.掌握SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳法；
二.实验原理
种子中的碳水化合物主要是以淀粉的形式存在。

淀粉酶是一种水解酶，它能使淀粉水解为麦芽糖，催化反应为：
2 （C«HioOj） +n HaO n CiaHaaOu
麦芽糖具有还原性，与3, 5-二硝基水杨酸在供热的条件下生成棕色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一泄范囤内，棕色物质颜色的深注程度与还原糖的量成正比，因此可利用比色法测定还原糖的量。

休眠种子的淀粉酶活力很弱，种子吸胀萌发后，酶活力逐渐增强，并随着发芽天数的增长而增加。

三.实验步骤
1.种子发芽
小麦种子浸泡2. 5h后，放入25°C恒温箱内发芽。

2.酶液提取
取发芽第三天或者第四天的幼苗8株，放入研钵中，加入石英砂少许，加入PH6.8磷酸盐缓冲液10ml,研磨至匀浆状。

在室温下静置20min,搅拌几次。

提取液1500rpm离心7min o 上淸倒入虽:筒，测立酶提取液总体积，并将酶液稀释10倍。

取干燥种子或者浸泡2. 5h后的种子8粒作为对照，步骤同上。

3.SDS-PAGE聚丙烯酰胺电泳法测定蛋白条带。

4.酶活力的测左
（1）取大试管6支，按照下表加入各试剂
（1）取大试管6支，按照下表加入各试剂
将各试管摇匀，放入37水浴锅中保温3min,立即向各试管中加入D\S试剂2ml。

（2）取出各管，放入沸水浴中加热5min,流水冷却至室温，加水稀释至25mL,充分混匀后1:1稀释。

用空白管做对照，在520nm处测泄各管0D值，并对3和4、5和6管分别取平均值作为萌发前和萌发后的0D值。

四.计算
根据溶液的浓度与光吸收值成正比的关系，即
A 未站二C册/C耒如可推导岀C娥液二A炖液/A怜那X C MI
8粒的总活力二JXn够XV傅
A为光吸收值：C萨酶液管的麦芽糖浓度;n沪酶液稀释倍数;V沪提取酶液总体积。

五.蛋白质浓度测立一考马斯亮蓝G250染色法
六、实验结果
（1）酶活力的测左
F
M
1、萌发前：A 碗二0・201, V w=9. 0ml
C 蹿FA翊ft/A 1,41 xc 201/0. 248X0. 001%
8粒的总活力二C傅X n他X V萨0. 0729
2、萌发后:A m»=0. 641> V iw, =8. 0ml>
C二A 碗/A M»XC^=0. 641/0. 248X0. 001%
8粒的总活力二C以叶X V沪0・207
（2）蛋白质浓度的测定
小麦萌发前：
A *白低=0・113
由标准曲线,Y=0. 0081X —0. 0515, R2=0. 9842可知，x为20. 3086,由于酶液被稀释了10 倍，所以,蛋白质浓度为203. 086 u g/ mlo
小麦萌发后：
A SHR FO. 096
由标准曲线,Y=0. 0081X — 0. 0515, R2二0・9842可知,x为18. 2099,由于酶液被稀释了10倍，所以，蛋白质浓度为182. 099 ug/ ml。

七、讨论
由实验数据结果可以看岀小麦萌芽后淀粉酶的活力会比萌芽前明显增强，小麦种子在萌发过程中淀粉酶活力升高，淀粉被大量水解为小分子糖，那么就可以提供较多的能虽:供应萌发时候的细胞分裂以及细胞生长使用，同时还能够为细胞的生命活动提供原料，能够更快地将储存的有机物中的能量释放出来，保证萌发过程能量供应充足。

八、实验注意事项
1、种子研磨应均匀，以助于酶液的提取。

2、在测左蛋白质浓度及酶液时，应快速测量，以防止反应试剂的分解，提高测左的正确性。

3、实验过程中注意安全。

如有侵权请联系告知删除，感谢你们的配合!。