高效液相色谱同时检测不同类型烟叶中的多种生物碱含量
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生物碱的组成和含量是影响烟叶质量的重要
基金项目：吉林烟草工业有限责任公司科技项目（JSZX-2019-03）
作者简介：林雨晟（1996-），女，在读研究生，主要从事烟草栽培与生理生化研究。E-mail：linyuchenfei523@
Simultaneous Determination of Alkaloids in Different Types of Tobacco by
HPLC
LIN Yucheng1, JIN Hongshi2, ZHANG Haonan1, JIN Jianghua2, GUO Wei2, LI Yu’e2, ZHAO Mingqin1, LIU Pengfei1*
色谱条件：岛津 Shim pack GIST C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm），流动相 A（90%水+10%甲醇， pH 6.8，0.15%醋酸钠），流动相 B（90%甲醇+10% 水，pH 3.8），柱温：35 ℃；进样量：20 μL。
梯度洗脱程序为：0 min (0% B)-8.0 min (0% B)-15.0 min (4% B)-23.0 min (26% B)-34.0 min (35% B)-38.2 min (36% B)-39.0 min (40% B)-41.5 min (40% B)- 44.6 min (0% B)。 1.2.3 提取溶剂的筛选 分别配制 2%、4%、6%的 盐酸溶液、氢氧化钠溶液和氨水溶液以及 0%、5%、 10%的甲醇水溶液。称取各烟叶样品 100 mg，分别 放入锥形瓶中，加入溶液 20 mL，振荡提取 30 min， 过滤至 50 mL 容量瓶中，定容后取 10 mL 移至 100 mL 容量瓶中用对应溶液稀释定容，用磷酸或氢氧 化钠溶液调节至 pH：5（使用甲醇的处理不需要调 节 pH 值），待检测。 1.2.4 提取时间的影响 称取 100 mg 烟叶样品， 放入锥形瓶中，加入 5%甲醇水溶液 20 mL，分别 提取 10、15、20、25、30 min，过滤至 50 mL 容量 瓶中，定容后取 10 mL 移至 100 mL 容量瓶中，用 5%甲醇水溶液稀释定容，待检测。 1.2.5 提取温度的影响 称取 100 mg 烟叶样品， 放入锥形瓶中，加入 5%甲醇水溶液 20 mL，分别 在 25、30、35、40、45 ℃的条件下提取 30 min， 过滤至 50 mL 容量瓶中，定容后取 10 mL 移至 100 mL 容量瓶中，用 5%甲醇水溶液稀释定容，待检测。 1.2.6 料液比的影响 分别称取 50、100、150、200、 250 mg 烟叶样品，放入锥形瓶中，加入 5%甲醇水 溶液 20 mL，提取 30 min，过滤至 50 mL 容量瓶中， 定容后取 10 mL 移至 100 mL 容量瓶中，用 5%甲醇 水溶液稀释定容，待检测。
（1.河南农业大学烟草学院，国家烟草栽培生理生化研究基地，郑州 450002；2.吉林烟草工业有限责任公司，吉林 延吉 133001）
摘 要：为快捷准确地测定烟叶中生物碱的含量，本研究通过优化提取条件，建立了测定烟草中烟碱、新烟草碱、假木贼碱 和降烟碱的高效液相色谱检测方法。优化后的检测步骤为：干烟叶和 5%甲醇的料液比为 100 mg/20 mL，在 25 ℃下振荡提 取 30 min，色谱条件：C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相 A（90%水+10%甲醇，pH 6.8，0.15%醋酸钠），流动相 B （90%甲醇+10%水，pH 3.8）。烟碱在 0.1~50 μg/mL、其余 3 种在 0.005~2 μg/mL 的范围内，4 种生物碱均具有较好的线性关 系（R2>0.99）；烟碱检出限为 0.000 65 μg/mL，平均回收率 100.79%，RSD 3.11%；新烟草碱检出限 0.088 4 μg/mL，平均回 收率 98.53%，RSD 3.75%；假木贼碱检出限 0.034 8 μg/mL，平均回收率 98.70%，RSD 3.63%；降烟碱检出限 0.150 9 μg/mL， 平均回收率 101.33%，RSD 4.61%。对 4 种不同类型烟叶共 11 个不同样品进行检测验证，检测结果可靠。该方法前处理简 单快捷，灵敏度高，重复性较好，可以满足烟草样品中 4 种生物碱的检测要求。 关键词：烟草；烟碱；新烟草碱；假木贼碱；降烟碱；液相色谱法
电子天平（上海上平，精度 0.000 1 g），超声 仪（郑州生元，SYU-10-300 DT），pH 计（上海丰 控，FK-PH10），LC-20 A 液相色谱（日本岛津，LC20）。
1.2 前处理方法 1.2.1 标准溶液配制 分别称取 4 种生物碱 10 mg，
用 100 mL 甲醇溶解，得到 100 mg/L 的单一标准溶 液母液。分别吸取适量母液，配成 4 种生物碱的标 准混合溶液，按照优化后的检测步骤，通过峰面积 绘制校准曲线，其中，烟碱的浓度为 0.1、0.5、2、 10、20、50 mg/g，其余 3 种生物碱浓度为 0.005、 0.02、0.1、0.5、1、2 mg/g。 1.2.2 生物碱的紫外扫描及色谱条件 取配制好 的单标溶液稀释后进行波长扫描，扫描范围为 200~400 nm。
生物碱是一类存在于植物体中的特殊的含氮 有机物，是植物体随外界环境变化合成的次生代谢 产物，一般具有特殊的生理活性，如抗炎、镇痛和 成瘾性[1]。烟草中含有超过 50 种生物碱，含量较高 的有烟碱（尼古丁）、新烟草碱、假木贼碱、降烟 碱（去甲基烟碱）等[2]。其中烟碱含量最高，一般
占总生物碱组分的 90%以上，其他各种生物碱所占 的比例一般不超过 10%[3]。不同类型烟叶的生物碱 含量差异主要是烟碱和降烟碱的含量差异，而假木 贼碱和新烟草碱在各类型烟叶中的含量均较低，且 较少出现转移或降解[4]。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器 4 种类型烟叶样品（烤烟 4 个，云南；白肋烟
2 个，湖北；雪茄烟海南 2 个、四川 1 个；晒红烟 2 个，吉林），共计 11 个。烘干粉碎过 40 目筛备用。
烟碱、降烟碱、新烟草碱、假木贼碱标准品， 纯度均大于 98%（TRC，加拿大）；醋酸钠、磷酸、 三乙胺、盐酸、氢氧化钠均为分析纯（天津大茂）； 甲醇为色谱纯（天津科密欧）。
Abstract: In order to quickly and accurately determine the content of alkaloids in tobacco leaves, the extraction conditions were optimized, and a method for the determination of nicotine, anatabine, anabasine and nornicotine contents in tobacco by HPLC was established. The optimized detection steps are as follows: 100 mg/20 mL solid-liquid ratio, 5% methanol was extracted by oscillation at 25 ℃ for 30 min, the chromatographic conditions were C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), mobile phase A (90% water +10% methanol, pH 6.8, 0.15% sodium acetate), mobile phase B (90% methanol +10% water, pH 3.8). Nicotine was in the range of 0.1-50 μg/mL and the other three alkaloids were in the range of 0.005-2 μg/mL, with the standard curves of the four alkaloids all havig good linear relationship (R2 > 0.99). The limits of detection (LOD) of nicotine were 0.000 65 μg/mL, and the average recoveries were 100.79%, RSD 3.11%; the LOD of anatabine were 0.088 4 μg/mL, and the average recoveries were 98.53%, RSD 3.75%; the LOD of anabasine were 0.034 8 μg/mL, and the average recoveries were 98.70%, RSD3.63%; the LOD of nornicotine were 0.150 9 μg/mL, and the average recoveries were 101.33%, RSD 4.61%. A total of 11 different samples of 4 different types of tobacco leaves were tested, and the results were reliable. The method is simple and fast, sensitive and repeatable, and can meet the requirements of detecting four alkaloids in tobacco samples. Keywords: tobacco; nicotine; anatabine; anabasine; nornicotine; HPLC
(1. College of Tobacco Science, Henan Agricultural University; National Tobacco Cultivation & Physiology & Biochemistry Research Center, Zhengzhou 450002, China; 2. Jilin Tobacco Industrial Co., Ltd., Yanji, Jilin 133001, China)
收稿日期：2020-11-02
修回日期：2021-03-19
84
中国烟草科学
2021 年第 42 卷
因素，直接影响着烟草制品的劲头、刺激性、吃味 和安全性[5]。烟碱含量对评吸质量影响极大，过低 劲头不足，过高会造成刺激性大，影响吃味[6-7]；在 烟碱去甲基酶的作用下，烟碱脱去甲基后形成降烟 碱，降烟碱含量高，则会降解生成麦斯明等物质， 影响烟叶香气质和香气量，并导致烟草特有亚硝胺 （TSNAs）含量上升[8-9]；假木贼碱与劲头得分显著 负相关，且对香气浓度有显著影响[10]；新烟草碱对 香气质、香气量、刺激性以及 TSNAs 含量等均有 影响[9,11]。因此准确快速简便的测定烟叶内各生物 碱含量对于烟草研究有着重要作用。
中国烟草科学 Chinese Tobacco Science 2021,42(3):83-89
DOI: 10.13496/j.issn.1007-5119.2021.03.014
高效液相色谱同时检测不同类型烟叶中的多种生物碱含量
林雨晟 1，金洪石 2，张皓楠 1，金江华 2，郭 伟 2，李玉娥 2，赵铭钦 1，刘鹏飞 1*
目前关于烟草生物碱的检测方法主要有气相色 谱法（GC）[12-15]、气相色谱质谱联用法（GC-MS）[1,6-18]、 液 相 色 谱 法 （ LC ） [19-21]、 液 相 色 谱 质 谱 联 用 法 （LC-MS）[22-24]。与其他方法相比，液相色谱法的 样品前处理步骤少、误差小，检测更快速、重现性 更好，更利于广泛使用。刘正聪等[25]利用超高效液 相色谱法（UPLC）检测了卷烟烟丝中的烟碱、降 烟碱、麦斯明、新烟草碱和可替宁等 5 种生物碱， 该方法出峰时间较快，出峰较为密集，目标物不容 易区分。本文在前人研究的基础上，采用高效液相 色谱法，建立了同时检测烟碱、降烟碱、新烟草碱、 假木贼碱等烟草中含量较高的 4 种生物碱[2]的方法， 该方法前处理步骤简便、结果准确，同时检测组分 多，且峰形良好。
基金项目：吉林烟草工业有限责任公司科技项目（JSZX-2019-03）
作者简介：林雨晟（1996-），女，在读研究生，主要从事烟草栽培与生理生化研究。E-mail：linyuchenfei523@
Simultaneous Determination of Alkaloids in Different Types of Tobacco by
HPLC
LIN Yucheng1, JIN Hongshi2, ZHANG Haonan1, JIN Jianghua2, GUO Wei2, LI Yu’e2, ZHAO Mingqin1, LIU Pengfei1*
色谱条件：岛津 Shim pack GIST C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm），流动相 A（90%水+10%甲醇， pH 6.8，0.15%醋酸钠），流动相 B（90%甲醇+10% 水，pH 3.8），柱温：35 ℃；进样量：20 μL。
梯度洗脱程序为：0 min (0% B)-8.0 min (0% B)-15.0 min (4% B)-23.0 min (26% B)-34.0 min (35% B)-38.2 min (36% B)-39.0 min (40% B)-41.5 min (40% B)- 44.6 min (0% B)。 1.2.3 提取溶剂的筛选 分别配制 2%、4%、6%的 盐酸溶液、氢氧化钠溶液和氨水溶液以及 0%、5%、 10%的甲醇水溶液。称取各烟叶样品 100 mg，分别 放入锥形瓶中，加入溶液 20 mL，振荡提取 30 min， 过滤至 50 mL 容量瓶中，定容后取 10 mL 移至 100 mL 容量瓶中用对应溶液稀释定容，用磷酸或氢氧 化钠溶液调节至 pH：5（使用甲醇的处理不需要调 节 pH 值），待检测。 1.2.4 提取时间的影响 称取 100 mg 烟叶样品， 放入锥形瓶中，加入 5%甲醇水溶液 20 mL，分别 提取 10、15、20、25、30 min，过滤至 50 mL 容量 瓶中，定容后取 10 mL 移至 100 mL 容量瓶中，用 5%甲醇水溶液稀释定容，待检测。 1.2.5 提取温度的影响 称取 100 mg 烟叶样品， 放入锥形瓶中，加入 5%甲醇水溶液 20 mL，分别 在 25、30、35、40、45 ℃的条件下提取 30 min， 过滤至 50 mL 容量瓶中，定容后取 10 mL 移至 100 mL 容量瓶中，用 5%甲醇水溶液稀释定容，待检测。 1.2.6 料液比的影响 分别称取 50、100、150、200、 250 mg 烟叶样品，放入锥形瓶中，加入 5%甲醇水 溶液 20 mL，提取 30 min，过滤至 50 mL 容量瓶中， 定容后取 10 mL 移至 100 mL 容量瓶中，用 5%甲醇 水溶液稀释定容，待检测。
（1.河南农业大学烟草学院，国家烟草栽培生理生化研究基地，郑州 450002；2.吉林烟草工业有限责任公司，吉林 延吉 133001）
摘 要：为快捷准确地测定烟叶中生物碱的含量，本研究通过优化提取条件，建立了测定烟草中烟碱、新烟草碱、假木贼碱 和降烟碱的高效液相色谱检测方法。优化后的检测步骤为：干烟叶和 5%甲醇的料液比为 100 mg/20 mL，在 25 ℃下振荡提 取 30 min，色谱条件：C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相 A（90%水+10%甲醇，pH 6.8，0.15%醋酸钠），流动相 B （90%甲醇+10%水，pH 3.8）。烟碱在 0.1~50 μg/mL、其余 3 种在 0.005~2 μg/mL 的范围内，4 种生物碱均具有较好的线性关 系（R2>0.99）；烟碱检出限为 0.000 65 μg/mL，平均回收率 100.79%，RSD 3.11%；新烟草碱检出限 0.088 4 μg/mL，平均回 收率 98.53%，RSD 3.75%；假木贼碱检出限 0.034 8 μg/mL，平均回收率 98.70%，RSD 3.63%；降烟碱检出限 0.150 9 μg/mL， 平均回收率 101.33%，RSD 4.61%。对 4 种不同类型烟叶共 11 个不同样品进行检测验证，检测结果可靠。该方法前处理简 单快捷，灵敏度高，重复性较好，可以满足烟草样品中 4 种生物碱的检测要求。 关键词：烟草；烟碱；新烟草碱；假木贼碱；降烟碱；液相色谱法
电子天平（上海上平，精度 0.000 1 g），超声 仪（郑州生元，SYU-10-300 DT），pH 计（上海丰 控，FK-PH10），LC-20 A 液相色谱（日本岛津，LC20）。
1.2 前处理方法 1.2.1 标准溶液配制 分别称取 4 种生物碱 10 mg，
用 100 mL 甲醇溶解，得到 100 mg/L 的单一标准溶 液母液。分别吸取适量母液，配成 4 种生物碱的标 准混合溶液，按照优化后的检测步骤，通过峰面积 绘制校准曲线，其中，烟碱的浓度为 0.1、0.5、2、 10、20、50 mg/g，其余 3 种生物碱浓度为 0.005、 0.02、0.1、0.5、1、2 mg/g。 1.2.2 生物碱的紫外扫描及色谱条件 取配制好 的单标溶液稀释后进行波长扫描，扫描范围为 200~400 nm。
生物碱是一类存在于植物体中的特殊的含氮 有机物，是植物体随外界环境变化合成的次生代谢 产物，一般具有特殊的生理活性，如抗炎、镇痛和 成瘾性[1]。烟草中含有超过 50 种生物碱，含量较高 的有烟碱（尼古丁）、新烟草碱、假木贼碱、降烟 碱（去甲基烟碱）等[2]。其中烟碱含量最高，一般
占总生物碱组分的 90%以上，其他各种生物碱所占 的比例一般不超过 10%[3]。不同类型烟叶的生物碱 含量差异主要是烟碱和降烟碱的含量差异，而假木 贼碱和新烟草碱在各类型烟叶中的含量均较低，且 较少出现转移或降解[4]。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器 4 种类型烟叶样品（烤烟 4 个，云南；白肋烟
2 个，湖北；雪茄烟海南 2 个、四川 1 个；晒红烟 2 个，吉林），共计 11 个。烘干粉碎过 40 目筛备用。
烟碱、降烟碱、新烟草碱、假木贼碱标准品， 纯度均大于 98%（TRC，加拿大）；醋酸钠、磷酸、 三乙胺、盐酸、氢氧化钠均为分析纯（天津大茂）； 甲醇为色谱纯（天津科密欧）。
Abstract: In order to quickly and accurately determine the content of alkaloids in tobacco leaves, the extraction conditions were optimized, and a method for the determination of nicotine, anatabine, anabasine and nornicotine contents in tobacco by HPLC was established. The optimized detection steps are as follows: 100 mg/20 mL solid-liquid ratio, 5% methanol was extracted by oscillation at 25 ℃ for 30 min, the chromatographic conditions were C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), mobile phase A (90% water +10% methanol, pH 6.8, 0.15% sodium acetate), mobile phase B (90% methanol +10% water, pH 3.8). Nicotine was in the range of 0.1-50 μg/mL and the other three alkaloids were in the range of 0.005-2 μg/mL, with the standard curves of the four alkaloids all havig good linear relationship (R2 > 0.99). The limits of detection (LOD) of nicotine were 0.000 65 μg/mL, and the average recoveries were 100.79%, RSD 3.11%; the LOD of anatabine were 0.088 4 μg/mL, and the average recoveries were 98.53%, RSD 3.75%; the LOD of anabasine were 0.034 8 μg/mL, and the average recoveries were 98.70%, RSD3.63%; the LOD of nornicotine were 0.150 9 μg/mL, and the average recoveries were 101.33%, RSD 4.61%. A total of 11 different samples of 4 different types of tobacco leaves were tested, and the results were reliable. The method is simple and fast, sensitive and repeatable, and can meet the requirements of detecting four alkaloids in tobacco samples. Keywords: tobacco; nicotine; anatabine; anabasine; nornicotine; HPLC
(1. College of Tobacco Science, Henan Agricultural University; National Tobacco Cultivation & Physiology & Biochemistry Research Center, Zhengzhou 450002, China; 2. Jilin Tobacco Industrial Co., Ltd., Yanji, Jilin 133001, China)
收稿日期：2020-11-02
修回日期：2021-03-19
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中国烟草科学
2021 年第 42 卷
因素，直接影响着烟草制品的劲头、刺激性、吃味 和安全性[5]。烟碱含量对评吸质量影响极大，过低 劲头不足，过高会造成刺激性大，影响吃味[6-7]；在 烟碱去甲基酶的作用下，烟碱脱去甲基后形成降烟 碱，降烟碱含量高，则会降解生成麦斯明等物质， 影响烟叶香气质和香气量，并导致烟草特有亚硝胺 （TSNAs）含量上升[8-9]；假木贼碱与劲头得分显著 负相关，且对香气浓度有显著影响[10]；新烟草碱对 香气质、香气量、刺激性以及 TSNAs 含量等均有 影响[9,11]。因此准确快速简便的测定烟叶内各生物 碱含量对于烟草研究有着重要作用。
中国烟草科学 Chinese Tobacco Science 2021,42(3):83-89
DOI: 10.13496/j.issn.1007-5119.2021.03.014
高效液相色谱同时检测不同类型烟叶中的多种生物碱含量
林雨晟 1，金洪石 2，张皓楠 1，金江华 2，郭 伟 2，李玉娥 2，赵铭钦 1，刘鹏飞 1*
目前关于烟草生物碱的检测方法主要有气相色 谱法（GC）[12-15]、气相色谱质谱联用法（GC-MS）[1,6-18]、 液 相 色 谱 法 （ LC ） [19-21]、 液 相 色 谱 质 谱 联 用 法 （LC-MS）[22-24]。与其他方法相比，液相色谱法的 样品前处理步骤少、误差小，检测更快速、重现性 更好，更利于广泛使用。刘正聪等[25]利用超高效液 相色谱法（UPLC）检测了卷烟烟丝中的烟碱、降 烟碱、麦斯明、新烟草碱和可替宁等 5 种生物碱， 该方法出峰时间较快，出峰较为密集，目标物不容 易区分。本文在前人研究的基础上，采用高效液相 色谱法，建立了同时检测烟碱、降烟碱、新烟草碱、 假木贼碱等烟草中含量较高的 4 种生物碱[2]的方法， 该方法前处理步骤简便、结果准确，同时检测组分 多，且峰形良好。