液液萃取-QuEChERS净化-高效液相色谱-串

现代农业科技2022年第24期
动物科学摘要本文采用液液萃取-QuEChERS 净化-高效液相色谱-串联质谱法测定了恩诺沙星可溶性粉中五氯酚酸钠含量,对提取方法、流动相及净化条件进行了优化,并分析了该方法的准确度和精密度。

结果表明,该方法在0.50~100.00μg/L 浓度范围内线性关系良好,相关系数为0.9994,检出限为0.5μg/kg ,定量限为1.0μg/kg 。

平均回收率为80.2%~94.0%,相对标准偏差小于7%。

该方法快速、高效且价格低廉,适用于恩诺沙星可溶性粉中五氯酚酸钠的快速筛查测定。

关键词五氯酚酸钠;QuEChERS 净化;恩诺沙星可溶性粉;高效液相色谱-串联质谱法中图分类号O657.63;TS251.51文献标识码A 文章编号1007-5739(2022)24-0156-04DOI :10.3969/j.issn.1007-5739.2022.24.039开放科学(资源服务)标识码(OSID ):
Determination of Pentachlorophenol Sodium in Enrofloxacin Soluble Powder by Liquid-Liquid Extraction-QuEChERS Purification-High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry
YU Mingxia CAO Xiu FENG Huihui LIU Xiujuan YANG Yaqin DONG Xiaohai ZHOU Qifang
LI Yuanyuan HAO Xuefei *
(Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology,Henan Academy of Agricultural Sciences,
Zhengzhou Henan 450002)
Abstract This paper used liquid-liquid extraction-QuEChERS purification-high performance liquid chromato-graphy-tandem mass spectrometry to determine the pentachlorophenol sodium in enrofloxacin soluble powder,the extrac-tion method,mobile phase and purification conditions were optimized,and the accuracy and precision of the method were analyzed.The results showed that this method had good linear responses in the range of 0.50-100.00μg/L,and the correlation coefficient was 0.9994,the limit of detection was 0.5μg/kg,the limit of quantification was 1.0μg/kg.The average recovery was 80.2%-94.0%and the relative standard deviation was less than 7%.This method was rapid,efficient and inexpensive,which was suitable for rapid screening and determination of pentachlorophenol sodium in enrofloxacin soluble powder.
Keywords pentachlorophenol sodium;QuEChERS purification;enrofloxacin soluble powder;high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
液液萃取-QuEChERS 净化-高效液相色谱-串联质谱法
测定恩诺沙星可溶性粉中五氯酚酸钠含量
余明霞曹秀
冯慧慧刘秀娟杨亚琴董小海周其芳李园园郝学飞*
(河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所,河南郑州450002)
五氯酚酸钠即五氯苯酚钠,价格低且高效,可用作树木落叶休眠期喷射剂,防止树木褐腐病,也可用作除草剂、杀虫剂[1]、塑料和橡胶防菌剂、木材防腐剂
等。

我国曾广泛使用五氯苯酚钠作为水产养殖杀螺
剂,用于鱼塘、虾塘的消毒[2-3]。

五氯酚酸钠具有较好的
水溶性[4],并且性质稳定,很难降解,易造成水和土壤
的污染[5];可以通过吸入、食入、皮肤吸收等多种途径进入动植物体内,经过食物链被人体吸收[6-8]。

五氯酚酸钠不仅可以直接伤害人体,对人类后代也具有潜在危险性[9]。

五氯酚酸钠已被国际癌症研究机构和美
国国家环境保护局列为2B 类致癌物和持久性有机
作者简介余明霞(1987—),女,河南平顶山人,助理研究员,
从事农药残留与兽药残留检测工作。

*通信作者
收稿日期
2022-03-15
156
表1梯度洗脱条件时间/min
乙酸铵/(mmol ·L -1)
甲醇/(μg ·mL -1)
060402.0025752.5010903.5010904.0060405.00
60
40
表2多反应模式下五氯酚酸钠质谱参数
离子对(m/z )保留时间/min 解簇电压/V 入口电压/eV 碰撞能量/eV 262.7/262.7* 3.27-70-10-5264.7/264.7 3.27-70-10-5266.7/266.7
3.27
-70
-10
-5
注:*为定量离子对。

污染物。

我国农业农村部于2002年发布第235号公告规定动物源性食品中不得检出五氯酚酸钠,2018年《国家食品安全监督抽检实施细则(2018年版)》把
五氯酚酸钠作为畜禽肉及其副产品中必检项目[10];2019年12月又发布第250号公告,规定食品动物中
禁止使用五氯酚酸钠。

因此,对恩诺沙星可溶性粉中五氯酚酸钠检测方法的研究很有必要。

目前,五氯酚酸钠常用检测方法是气相色谱-串联质谱法[11-16]和高效液相色谱-串联质谱法[17-20],其中:气相色谱-串联质谱法前处理复杂,并且需要衍生;高效液相色谱-串联质谱法选择性强、准确度高、灵敏度高,并且能满足低残留的检测要求,被广泛运用。

在对五氯酚酸钠分析检测时,前处理至关重要。

为了符合国家要求,降低试剂用量,减少环境污染,提高灵敏度,减少对仪器端的污染,本研究将液液萃取-QuEChERS 净化[21-24]与高效液相色谱-串联质谱法相结合,拟建立一种快速、灵敏、准确度高的分析恩诺
沙星可溶性粉中五氯酚酸钠的新方法。

1材料与方法
1.1试剂与设备
五氯酚酸钠标准品1000μg/mL (德国Dr.Ehren-
storfer 公司);盐酸(优级纯);乙醚(分析纯);乙腈(色
谱纯,中国默克公司);乙酸铵(色谱纯,美国Fisher 公司)。

试验用样品为市售10%恩诺沙星可溶性粉。

AB SCIEX Qtrop 6500+高分辨多级质谱仪(美
国AB SCIEX 公司);QuEChERS 净化管(50mg 无水硫酸镁、50mg C 18,吴桥津杨过滤器材厂);AE240分
析天平(日本梅特勒托利多公司);GL-21B 高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂);Milli-Q@Synthesis 纯水机(Millipore 公司);MixOne 漩涡混合器(合肥艾本森科学仪器有限公司);EG 20A plus 电热板(美国Lab Tech 公司);KQ-500DE 型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2条件的选择与优化1.
2.1流动相的优化。

用5mmol/L 乙酸铵溶液作水相,分别用乙腈和甲醇作有机相。

1.2.2
质谱和色谱条件的优化。

色谱柱:Waters
ACQUITY UPLC R
BEH C 18色谱柱(100mm ×2.1mm ,
1.7μm ),柱温40℃;进样量1μL ;流速0.3mL/min ;采用梯度洗脱条件,具体见表1。

质谱条件:采用电喷雾电离负离子模式(ESI-)扫描;喷雾电压为-4500V ,离子源温度为450℃,碰撞气压力为Medium ,气帘气压力为137.9kPa ,雾化气压力(GS1)为379.2kPa 和辅助加热气压力(GS2)为344.7kPa ,扫描方式为多反应监测(MRM )模式。

五氯酚酸钠质谱参数见表2。

1.2.3提取液的选择。

五氯酚酸钠在酸性条件下以
分子态存在,易溶于有机溶剂;在碱性条件下以离子态存在,易溶于水。

提取液酸碱性对其回收率影响大。

针对五氯酚酸钠添加量为5.0μg/kg 进行分析,选用7种不同提取液对样品进行提取,分别为70%乙腈水(含5%三乙胺)(pH 值12)、70%乙腈水(含8%三乙胺)(pH 值10~11)、1%甲酸乙腈(pH 值4)、2%甲酸乙腈(pH 值4.5)、5%氨水甲醇(pH 值9)、5%氨水乙腈(pH 值8~9),水溶解后加1mol/L HCl 1mL 调节pH 值再用乙醚提取。

1.2.4净化方法的选择。

样品会污染仪器,若长期做大批样品会给仪器带来更大隐患,应该对样品进行进一步净化。

分析固相萃取柱和QuEChERS 的净化效果。

1.2.5QuEChERS 净化管的选择。

本试验探索无水硫酸镁与C 18、PSA 吸附剂组成、用量对五氯酚酸钠的净化效果。

按以下4种组成制备QuEChERS 净化管:①50mg 无水硫酸镁、50mg C 18、50mg PSA ;②50mg 无水硫酸镁、50mg C 18;③50mg 无水硫酸镁、100mg
余明霞等:液液萃取-QuEChERS 净化-高效液相色谱-串联质谱法测定恩诺沙星可溶性粉中五氯酚酸钠含量157
现代农业科技2022年第24期
动物科学图110滋g/L 五氯酚酸钠总离子流图
时间/min
6555453525155
00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.0
C 18;④50
mg 无水硫酸镁、50mg C 18、100mg PSA 。

1.3测定及方法评价
1.3.1五氯酚酸钠标准溶液的配制。

取五氯酚酸钠标准品1000μg/mL 1mL 于10mL 容量瓶中,用甲醇定容配制成100μg/mL 标准储备液,再逐级配制成1μg/mL 的标准中间液,临用前稀释成合适浓度的标
准工作液。

1.3.2样品提取。

称取2g (精确至0.001g )恩诺沙星可溶性粉于50mL 离心管中,加入20mL 水,于涡旋混合器上快速混匀1min ,置于超声波中超声10min ,加入1mol/L HCl 溶液1mL ,调pH 值至4左右,加入20mL 乙醚,涡旋混匀1min ,置超声波中超声10min ,8000r/min 离心5min ,取上层乙醚层于30℃
电热板上蒸至近干。

1.3.3样品净化。

准确加入1mL 乙腈超声溶解,转移至QuEChERS 净化管,涡旋混匀1min ,8000r/min 离心5min ,量取0.5mL 上清液置于试管中,再补加5mmol/L 乙酸铵0.5mL 涡旋混匀,过0.22μm 有机
相滤膜,供高效液相色谱-串联质谱上机测定。

1.3.4方法学评价。

主要包括线性关系以及准确度、
精密度2个方面。

(1)线性关系和检出限、定量限。

吸取一定量的标准中间液,用乙腈∶乙酸铵=1∶1作为稀释液配制
0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0μg/L 标准工作液进行测定。

以标准工作溶液质量浓度C 作为横坐标,以每个浓度色谱峰面积A 作为纵坐标,绘制标准曲线。

(2)准确度与精密度。

进行1.0、5.0、10.0μg/kg
3个浓度水平的添加回收试验,每个添加水平做6个平行,计算平均回收率和相对标准偏差。

2结果与分析
2.1流动相优化结果
甲醇、乙腈洗脱效果都很强,差异不大,但是乙
腈出峰过早,考虑到与其他杂质分离度的问题,采用甲醇作为有机相。

五氯酚酸钠在甲醇和乙酸铵为流动相时出峰时间最佳,无杂质干扰(图1)。

2.2质谱条件优化
将五氯酚酸钠的标准工作液稀释成质量浓度为
1.0μg/mL 的上机液,在ESI 模式下全扫描,发现五氯
酚酸钠在负离子模式下相应更好,运用仪器自动化方法获得五氯酚酸钠的最优质谱条件。

2.3提取液选择
70%乙腈水(含5%三乙胺)(pH 值12)、70%乙
腈水(含8%三乙胺)(pH 值10~11)、1%甲酸乙腈(pH 值4)、2%甲酸乙腈(pH 值4.5)、5%氨水甲醇(pH 值9)、5%氨水乙腈(pH 值8~9)6种提取液的平均回收率为28%~70%,五氯酚酸钠用水溶解后加
1mol/L HCl 1mL 调节pH 值再用乙醚提取,平均回
收率达到93.9%。

恩诺沙星可溶性粉中五氯酚酸钠在酸性条件下回收率高于碱性条件。

根据五氯酚酸钠的特性,先用水溶解再用乙醚萃取回收率更高。

2.4净化方法的选择
固相萃取柱净化效果较好,但是操作繁琐,成本增大。

QuEChERS 净化法操作简单、节约成本、除杂效果好,已经成为现代农药残留、兽药残留除杂的流行手段。

因此,试验采用QuEChERS 净化法对样品进行净化处理。

2.5QuEChERS 净化管的选择
4种QuEChERS 净化管回收率分别为0、90.2%、
92.4%、0。

当净化管中含有PSA 吸附剂时,饲料添加剂中五氯酚酸钠无回收,将10μg/mL 五氯酚酸钠标
准溶液经50mg PSA 净化后,经UPLC-MS/MS 测定,质谱也无响应,这是由于PSA 吸附剂对五氯酚酸钠具有吸附作用[13-16]。

C 18含量由50mg 增加至100mg ,
净化效果无明显改善。

因此,选用50mg 无水硫酸镁、50mg C 18的QuEChERS 净化管可达到良好的净化效果。

158
表3
五氯酚酸钠平均回收率与相对标准偏差(n =6)五氯酚酸钠添加量/(μg ·kg -1)平均回收率/%
RSD/%1.080.2 6.25.0
89.8 3.910.0
94.0
3.1
2.6方法学评价2.6.1
线性关系和检出限、定量限。

五氯酚酸钠在
0.50~100.00μg/L 质量范围内具有良好的线性关系,
相关系数为0.9994。

取信噪比S/N ≥3时的浓度为检测限,信噪比S/N ≥10的浓度为定量限,测得该方法检测限为0.5μg/kg 、定量限为1.0μg/kg 。

2.6.2准确度与精密度。

五氯酚酸钠在浓度为1.0、
5.0、10.0μg/kg 时的平均回收率为80.2%~94.0%,RSD 为3.1%~
6.2%(表3)。

该方法准确度与精密度均满足残留检测的相关要求,可用于实际样品的检测定量。

3结论
本文建立了液液萃取-QuECHERS-高效液相色谱-串联质谱测定恩诺沙星可溶性粉剂中违禁药物五氯酚酸钠的检测分析方法。

该方法净化效果好,前处理简单快速,灵敏度和准确度高,能满足兽药制剂中五氯酚酸钠的痕量测定,为兽药制剂中违禁添加药物提供了快速的筛查方法。

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余明霞等:液液萃取-QuEChERS 净化-高效液相色谱-串联质谱法测定恩诺沙星可溶性粉中五氯酚酸钠含量
159
(上接第159页)
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保种子质量。

新疆气候干燥,一般摊晒2~3d,种子含
水率可降至20%~25%,可短期保存。

种子干燥可使
用机械设备,亦可进行人工干燥,但会增加生产成本。

6种子贮藏技术
6.1贮藏
种子含水量和贮藏温度是影响种子贮藏寿命的关键因素[18],粗加工种子贮藏时间一般不宜超过2个
月,应及时用于当年临冬播种。

精加工种子在室内常温下保存时间不应超过6个月,如需延长种子寿命,应在-10℃以下干燥、黑暗条件下贮藏。

乌仁其木格等[19]研究表明,在室外温度下塑料袋包装超干燥贮藏华北驼绒藜种子,安全含水量为4.2%~6.5%,种子寿命可达2.5年左右,且成本较低,利于推广。

种子寿命与保存环境条件有直接关系,因而种子库须保持通风、干燥、低温。

贮藏期间需要防火灾、防鼠害,并定期检测库房的空气湿度及安全[12]。

6.2运输
6.2.1粗加工种子运输。

粗加工种子一般在新疆使用,装车时应将超出车厢的袋子用绳系好并加盖防雨设备,以防运输过程中丢失和淋雨。

6.2.2精加工种子运输。

精加工种子一般均为出疆种子,途中需防重压、防潮湿,需出具种子检疫合格证。

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