兽用生物制品研发与申报——备课11课件

❖ 病毒类种子批应对原始种子进行病毒含量、安全性 （活疫苗）或毒力（灭活疫苗）、免疫原性、特异 性以及纯净（细菌、支原体或外源病毒）等鉴定。
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基础种子批建立
❖ 基础种子由原始种子经适当方式传代扩增而来，增 殖到一定数量后，将相同代次的所有培养物均匀混 合成一批，定量分装，保存于液氮中或其他适宜条 件下备用。按照规定项目和方法进行系统鉴定合格 后，方可作为基础种子使用。基础种子批应达到足 够的规模，以便能够保证相当长时间内生产的需要。
求、实验室制品基本要求和试验方案等适用于效力 试验等其他试验。
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4 一次单剂量接种安全试验
❖ 按照推荐的接种途径，用适宜日龄的靶动物，接种1 个使用剂量，至少观察2周。评估指标包括临床症状、 体温、局部炎症、组织病变等。
❖ 对于可用于多种动物的生物制品，应该用各种靶动 物进行一次单剂量接种安全试验。对于多种接种途 径，应进行多种接种途径的一次单剂量接种安全试 验。
化、适应、鉴定的培养物，或朋友馈赠的经过一 定的工作确定用来制苗的最早培养物为原始种子。 ❖ 如：AIV（H9亚型）灭活疫苗，从病死鸡气管黏 液用PBS制成悬液、离心取上清加双抗、接种鸡
胚分离病毒，经鉴定后即为原始种子。
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2 种子批定义
原始种子定义
原始种子
具有一定数量 背景明确 组成均一 系统鉴定免疫原性良好 系统鉴定繁殖特性良好 系统鉴定生物学特性明确 系统鉴定鉴别特征明确 系统鉴定纯净的菌（毒）株
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生产种子批定义
生产种子
由基础种子制备 处于规定代次范围内 系统鉴定符合有关规定 活的培养物
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3 种子批的建立
原始种子批的建立
❖ 种子批建立原则是对选定的菌（毒）株进行纯培养， 并将培养物分成一定的数量、装量和成分一致的小 包装，于液氮中或其他适宜条件下保存。
❖ 细菌类种子批应对原始种子进行形态和生化特性、 培养特性、血清学鉴定、安全性（活疫苗）或毒力 （灭活疫苗）、免疫原性、纯粹等鉴定。
❖ 分组应随机。
❖ 每只动物均应编号。 27
2 实验室制品基本要求
❖ 实验室安全试验中所用实验室制品的生产用菌（毒） 种、制品组成和配方等，应与规模化生产的产品相 同。
❖ 实验室制品应编制批号，并经过必要的检验，且结 果符合要求。
❖ 实验室制品中主要成分的含量应不低于规模化生产 时的出产标础毒种传代5代以上或基础菌种传代10 代以上制备疫苗。如果将这种代次范围之外的基础 种子用于生产，应通过进一步的试验加以证明。
❖ 从生产种子批中取出的种子，增殖一次后获得的菌 （毒）培养物，即应用于制备疫苗，不得再回冻保 存和再次用于生产。
❖ 应阐述基础种子和生产种子的保存与使用方法，包 括在生产工程中如何确保所用种子不超过批准的最 高代次等详细情况。应保存有足够量的基础种子， 供有关部门进行检验用。
❖ 对于可用于多种靶动物和多种接种途径的生物制品， 应进行多种靶动物和多种接种途径的单剂量重复接 种的安全试验。
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6 超剂量接种安全试验
❖ 用至少3批实验室制品对靶动物进行一次超剂量接种 的安全试验。
❖ 用适宜日龄的靶动物，接种剂量为免疫剂量的数倍 至一百倍不等。通常情况下，灭活疫苗为2倍，活疫 苗为10~100倍，至少观察2周。评估指标包括临床 症状、体温、局部炎症、组织病变等。
❖ 基础种子代次的确定：通常情况下，将基础种子传 代至规定最高代次以上第3代，取不同代次水平的培 养物进行含量、免疫原性试验，考察其繁殖特性和 免疫原性的稳定性。必要时，还须考察基础种子的 遗传稳定性。
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生产种子批的建立
❖ 生产种子由基础种子经适当方式传代扩增而来，达 到一定数量后，均匀混合，定量分装，保存于液氮 中或其他适宜条件下备用。根据特定生产种子批的 检验标准逐项（一般应包括纯净性检验、特异性检 验和含量测定等）进行检验，合格后方可用于生产。 并须确定生产种子在特定保存条件下的保存期。
3 制定安全试验设计方案
❖ 内容包括受试制品的批号，剂量，试验开始和结束 日期，试验动物的年龄、品种、性别等特征，对照 组的设置，每组动物的数量，实验动物来源、圈舍、 试验管理和观察方式，结果的判定方法及标准等。
❖ 还应根据制品的特点增加安全试验。 ❖ 安全试验要求的实验室基本条件、实验动物基本要
兽用生物制品研发与申报培训
根据中监所培训资料改编
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培训目录
❖ 一、菌（毒）种种子批建立试验 ❖ 二、实验室安全试验 ❖ 三、实验室效力试验 ❖ 四、诊断制品试验研究 ❖ 五、相关法律法规
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一、菌（毒）种种子批建立试验
种子批分为三级
原始种子 基础种子 生产种子
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1 原始种子
❖ 比较难界定，没有一个确切的模式。 ❖ 灭活疫苗的原始种子应该是从动物体内分离、纯
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血清学效力检验与靶动物免疫攻毒保护 相关性的研究
❖ 采用平行关系试验证明血清学方法的合理性，并为 建立判定标准提供依据。常用于成品的效力检验中。
❖ 具体试验方法：用不同剂量的疫苗免疫接种动物， 以便获得不同抗体水平的动物，根据抗体水平的高 低，将动物分成若干组，用已经选定的强毒株按照 预定剂量进行攻毒，对抗体水平与攻毒保护率之间 的关系进行分析。
❖ 生产种子批应达到一定规模，并含有足量活病毒 （或细菌），以确保能满足生产一批或一个亚批产 品。
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4 基础种子的鉴定
生物学特性鉴定
含量鉴定
安全或毒力试验
免疫原性试验
基础种子鉴定
免疫抑制试验 毒力返强试验
鉴别检验或特异性鉴定
纯净性检验
稳定性试验 11
（1）生物学特性鉴定
❖ 细菌、支原体类：形态和培养特性、生化特 性、血清学特性。
❖ 基因工程类活疫苗应按照《农业转基因生物安全管 理条例》和《农业转基因生物安全评价管理办法》 有关规定进行安全性或稳定性试验，基因工程类灭 活疫苗可以同时申报。
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（4）免疫原性（或最小免疫剂量）试验
❖ 基础种子免疫原性测定：应分别用基础种子的最低 代次和最高代次进行最小免疫剂量测定，以便决定 基础种子的使用代次。当然也包括基础种子的最低 代次和最高代次的生物学特性、含量、纯净及特异 性鉴定。
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（3）安全或毒力试验
❖ 安全性或毒力试验：主要考察基础种子对靶动物的 致病性（灭活疫苗）和安全性（活疫苗），为制定 相应标准提供依据并为今后的生产和检验过程中应 采取的安全措施提供依据。
❖ 活疫苗安全性试验：包括用多大的剂量对敏感日龄 的靶动物或实验动物是安全的。
❖ 灭活疫苗毒力试验：同样包括用多大的剂量对敏感 日龄的靶动物或实验动物能致死或发病或流产。
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二、实验室安全试验
❖ 预防、治疗用兽用生物制品，其质量考察有3个重要 指标。即：安全性、有效性和质量可控性。诊断制 品3个重要指标是敏感性、特异性和质量可控性。
❖ 可见预防、治疗用兽用生物制品的安全性是第一位 的。
❖ 实验室的基本要求是符合国家规定的生物安全标准。
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1 实验动物基本要求
❖ 实验动物应符合兽药典中生产、检验动物标准。实验猪筛选 一般应检测CSFV、PRRSV、PRV、PPV、PCV2以及疫苗 对应抗原抗体。
❖ 最小免疫剂量试验：用最高代次基础种子，用不同 剂量的菌（毒）种分别接种不同组别的靶动物；在 接种后的适宜时间分别进行攻毒，以最小的剂量获 得有效保护（90%）就是该菌（毒）株的最小免疫 剂量。
❖ 也可不攻毒，在接种后适宜时间分别采血测定抗体 效价来测定最小免疫剂量。但前提是该方法已经证 明与免疫攻毒方法具有平行关系。
❖ 传代次数：在靶动物体内连续传代次数一般不少于5 代（即首次接种后要进行4次继代）。
❖ 观察：每一次继代后应在适当的时间内观察接种动 物是否出现由于疫苗株毒力返强所导致的临床症状 指标和病理变化。
❖ 最后一次传代观察时间应在接种后至少观察21天。
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❖ 比较不同代次接种动物的临床变化及病理变化，特 别应对最后一代传代动物与第一代传代动物的临床 症状和病理变化进行对比。
❖ 血清中和试验应采用标准血清中和，不能用自分离 的血清。
（8）纯粹性（纯净性）检验
❖ 按照药典进行。（猪外源病毒增加PCV2）
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（9）保存期试验
❖ 稳定性试验：确定基础种子在特定保存条件下的保 存期。
❖ 基础种子保存期试验如何做？做多少项目？国内外 没有一个统一的标准。最高标准按毒种标准，每一 项都要做；最低标准仅做含量测定。专家个人观点， 除做含量测定外，灭活疫苗应增加毒力测定项，活 疫苗应增加免疫原性测定项。
❖ 安全试验多使用靶动物进行。
❖ 有的制品还须用敏感的小型实验动物（如啮齿类）进行试验。 检验细胞培养代谢产物的安全性。
❖ 应使用敏感性最高的品系动物进行安全试验。
❖ 应使用最小日龄的动物进行安全试验。
❖ 与繁育有关的制品，应使用怀孕动物进行安全试验。
❖ 每批制品的实验室安全试验中所用的动物数量应不少于10只 （头），来源困难或经济价值高的不少于5只（头）。
❖ 病毒类：血清学特性。
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（2）含量测定
❖ 应尽量采用通行方法，并应确保在全部试验过程中采用相同 的测定指标： 半数感染量ID50 半数鸡胚感染量EID50 半数致死量LD50 半数鸡胚致死量ELD50 半数细胞培养物感染量TCID50 最小感染量MID 最小致死量MLD 病毒蚀斑形成单位PFU 荧光病灶单位FFU 菌落形成单位CFU 支原体变色单位CCU
❖ 对于可用于多种靶动物和多种接种途径的生物制品， 应进行多种靶动物和多种接种途径的超剂量接种的 安全试验。
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7 对怀孕动物的安全试验（可能不适用）
❖ 对用于妊娠动物的制品，应使用妊娠期动物进行安 全试验，考察制品对妊娠、胎儿健康的影响。另外， 有些病原可能导致生殖系统的不可逆损伤，这类制 品的安全试验中，应对幼龄动物接种后，一直观察 到产仔，以考察其对生殖功能的影响。
❖ 所有的安全试验研究者均应签名。
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5 单剂量重复接种安全试验（可能不适用）
❖ 对可能进行多次接种的生物制品，均须进行该试验。 按照推荐的接种途径，用适宜日龄的靶动物，接种1 个使用剂量后2周，以相同方法再接种一次，再次接 种后应继续观察至少2周。评估指标包括临床症状、 体温、局部炎症、组织病变等。
物的品种、日龄、数量、级别，接种时间、途径和 接种量（一般为使用剂量的100倍），传代方法，观 察内容和时间，微生物分离鉴定方法，以及传代后 毒力返强程度的评价标准。
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❖ 在传代过程中，应根据菌（毒）种在靶动物体内的 增殖特点，在适宜时间采集含菌（毒）量最高的组 织、血清（如：PRRSV接种后第5天病毒载量最高 采血清）、分泌物或排泄物，经适当处理作为继代 接种物，以确保微生物的重分离率和传代成功率。
❖ 禁止将重分离的微生物在体外增殖后再进行传代。 ❖ 应使用基础种子的最低代次对第一组试验动物进行
接种。 ❖ 应采用适当的检测方法，鉴定分离物中是否存在被
检微生物，并测定其含量。
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❖ 继代：由前次接种动物分离到的材料，按照与第一 次传代相同的途径接种继代动物。每一次继代后的 病原应进行重新分离与鉴定。
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❖ 针对多种动物、多种接种途径、各靶动物、各使 用日龄都应进行免疫原性（或最小免疫剂量）试 验。
❖ 针对多个血清型的疫苗应进行交叉保护试验。 ❖ 不同地区的流行毒株交叉保护试验（如AIV）。
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（5）免疫抑制试验（可能不适用）
❖ 有些病原（如PRRSV、IBDV、REV等）可使动物 的免疫系统造成损害，对该类病的生物制品还应进 行免疫抑制试验，评估其制品是否存在免疫抑制现 象。
❖ 禽用疫苗评估一般采用ND疫苗。 ❖ 猪用疫苗评估一般采用CSF疫苗。 ❖ 血清学检测或攻击强毒，观察保护率，同时也要观
察组织学病理变化，分析是否有免疫抑制。
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（6）毒力返强试验（可能不适用）
❖ 先进行预试验，摸索出该种子接种后含毒最高的时 间、组织等。
❖ 应用最低代次的基础种子试验。 ❖ 应根据菌（毒）的特点制定试验方案，包括试验动
❖ 如：PRRSV应观察第一代与最后一代动物的肺、实 质器官（心、肝、脾、胃、肾）、淋巴结等组织的 组织病理变化（要做切片对比）。
❖ 病原学鉴定：必要时，应对最后一次传代的分离物 进行表型和基因型鉴定，并与基础种子进行比较， 以评估其遗传稳定性和毒力返强的可能性。
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（7）鉴别检验或特异性鉴定
❖ 应采用适宜方法鉴别疫苗株，并尽可能与相关毒株 相区别。如荧光抗体试验、毒种的血清中和试验、 菌种的试管凝集试验、菌种的玻片凝集试验或菌种 的生长特性检验。