正交实验法优选熟地黄中5HMF的提取工艺

正交实验法优选熟地黄中5 HMF的提取工艺【摘要】目的：以5羟甲基糠醛(5HMF)含量和熟地黄干膏收得率为指标，探讨熟地黄中5HMF的提取工艺. 方式：采纳正交实验法考察加水量、提取时刻、提取次数及醇沉浓度4个因素对5HMF含量和干膏收得率的阻碍，并运用高效液相法测定5HMF 的含量. 结果：通过对正交实验结果的极差分析，得出提取次数和提取时刻两个因素对干膏收得率和含量阻碍最大，参考两种要紧阻碍因素，最终确信8倍量水、提取3次、每次 h, 700 mL/L乙醇沉淀的提取工艺，并对该工艺进行三次重复性小试实验. 5HMF收得率可达58%以上. 结论：通过对上述提取条件的重复性考察，该方式重复性好，5HMF收得率稳固，为进一步中试实验提供了参考依据.
【关键词】熟地黄；5羟基糠醛；中药制药工艺
【Abstract】AIM: To optimize the water extracting technology condition of 5HMF from Rehmannia glutinosa libosch. METHODS: The extraction procedure of Rehmannia glutinosa libosch was studied by orthogonal design with dry extract yield and 5hydroxymethyl2furfura(5HMF)as the detective indices. Effects of four factors (the amout of water, extracting time, the mumber of times and alcohol concentration)and 3 levels for each factor on extraction rate were analyzed. RESULTS: The
5HMF extraction rate reached over 58% under the optimum extraction condition which was the adding 8 folds of water, and decocting for 3 times, h once and the precipitation with 700 mL/L alcohol. CONCLUSION: The optimum water decocting condition is repeatable, and ensure stable 5HMF extraction rate. It could be used in the future middle scaled preparation of Rehmannia glutinosa libosch.
【Keywords】radix rehmanniae praeparata; 5 hydroxymethyl2furfura(5HMF); pharmaceutical technology
0引言
熟地黄为玄参科连年生草本植物地黄（Rehmannia gLutinosa Libosch ）的根，经加工炮制而成，在临床上应用较为普遍. 熟地黄含有梓醇、糖类、甙类和5羟甲基糠醛(5 hydroxymethyl 2furfura, 5HMF)等多种化学成份. 有研究报导生地黄炮制成熟地黄后5HMF的含量增加20倍左右［1］，在对5HMF药理作用的研究中发觉其具有抗氧化、改善血液流变学等多种对人体有利的作用［2-3］. 但是关于对熟地黄中5HMF的提取工艺却少见文献报导，为了更好的发挥熟地黄的药用价值，咱们运用正
交设计法，考察阻碍其提取的因素，挑选5HMF的最正确提取工艺条件.
1材料和方式
材料美国产Beckman 125型高效液相色谱仪（32Karat TM Software色谱工作站），色谱柱为DiamonsiL C18(5 μL 200× mm ). BT 125D型电子天平（北京Sartorius公司）；DL720型超声波清洗器（上海科导超声仪器）；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，5 HMF对照品(批号：111626200503,中国药品生物制品检定所)，水（重蒸水），熟地黄药材(陕西省药材总公司).
方式
提取工艺设计
药材吸水率考察周密称取熟地黄3份，每份20 g. 别离加10倍量水浸泡，每30 min观看1次药材的渗透情形，直至药材掰开无硬心为止，并记录浸泡时刻，用量筒测量剩余水量，计算吸水率（表1）.
正交实验设计选用L9（34）正交进行实验，以熟地黄浸膏得率，5HMF含量作为考察指标，因素水平安排见表2. 称取熟地黄粗粉9
份，每份20 g，按正交实验设计方案条件提取过滤，归并滤液，定容到50 mL，备用. 表1熟地黄吸水率的考察表表2因素水平表
的含量测定
溶液制备周密称取5HMF对照品适量，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀制成含 mg/L的溶液，作为对照品溶液. 周密称取药材提取液 mL，蒸干溶剂，残渣用甲醇定容于5 mL容量瓶中，用μm微孔滤膜滤过，作为供试液.
色谱条件的选择色谱柱： DiamonsiL C18(5 μL 200× mm )；流动相为乙腈∶水 (15∶85)，流速1 mL /min，柱温25℃. 测定波长280 nm. 进样量20 μL. 在上述条件下，样品HPLC色谱图中5羟基糠醛与其他峰分离良好.
线性关系的考察周密量取对照品溶液适量，置50 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，别离吸取对照溶液4, 8, 12, 16和20 μL注入液相色谱仪中，测定其峰面积，以峰面积为纵坐标(A)，对照品的浓度为横坐标(C)，绘制标准曲线，得回归方程：Y=132034X+284737, R=，5 HMF在～ mg/L范围内呈良好的线性关系.
周密度实验周密吸取10 μL对照品溶液，按上述色谱条件，持
续进样6次，测得5HMF平均峰面积，计算相对标准差RSD=%.
稳固性实验在相同条件下，周密吸取供试品溶液，在12 h内，每隔2 h测定1次峰面积，计算RSD为% ，说明本品在12 h内稳固. 加样回收率实验抽取4号样品加入5HMF对照品适量，混匀，按供试品溶液制备，并按上述色谱条件测试. 按供试品溶液制备方式提取测定，测得峰面积并计算含量，平均回收率％，RSD=%.
重复性小试实验验为进一步考察上述提取工艺的稳固性，按的实验条件进行3次重复性小试实验.
2结果
通过正交实验极差分析结果显示各因素对出膏率的阻碍依次为提取次数>提取时刻>醇沉浓度>加水量（表3）. 对含量的阻碍依次为提取时刻>提取次数>醇沉浓度>加水量，通过极差分析说明，提取次数、提取时刻对5HMF的含量和熟地黄浸膏得率的阻碍比较著性，溶媒用量、提取时刻阻碍较小. 综合分析两种指标，初步确信熟地黄提取的最正确工艺应用8倍量的水，每次提取 h,提取2次，然后用950 mL/L 乙醇沉淀至700 mL/L. 按上述优化条件进行重复3次实验（表4），5羟基糠醛收得率可达58%以上. 表3正交实验极差分析表表4熟地黄优选提取工艺的重复性小试实验
3讨论
熟地黄药材为炮制品，水提后存在出膏过量等问题，该工艺中引入醇沉净化方式进行处置，在保证含量的前提下，操纵出膏率，可为制剂提供方便. 咱们用正交设计法对5HMF的提取工艺进行优选，通过直观、极差分析法选出最正确工艺，为验证此优选方案的可行性，咱们又按最正确工艺进行了3次重复性小实验，结果稳固，5 HMF收得率可达58%以上，初步完成了对熟地黄药材的实验室及小试实验提取工艺的挑选.
关于熟地黄中5HMF含量的测定有薄层扫描、高效液相等多种方式［4-5］. 结合实验室现有条件，咱们选取高效液相法进行测定. 张清波等［6］和秦向阳等［7］曾报导HPLC测定熟地黄中 5 HMF的含量，但咱们在其给定的流动相和检测波长下，以DiamonsiL C18分析柱为色谱柱进行实验，发觉 5HMF的色谱峰显现拖尾和分叉现象，且流动相极性太大，出峰时刻较短，溶剂峰干扰严峻. 为此，咱们对实验条件进行改良．采纳DiamonsiL C18 ( 5 μL 200× )色谱住；以乙腈∶水 (15∶85)为流动相，流速1 mL/min，柱温25℃. 测定波长280 nm，取得了较好的分离成效. 采纳高效液相色谱法测定5 HMF的含量，可不经分离，直接测定，其方式简便、准确、灵敏，重现性及回收率均符合要求. 在本实验给定的条件下，基线平稳，可
有效排除溶剂峰的干扰，且峰型较好.
【参考文献】
［1］刘漂亮，白玫，白荣枝，等. 熟地黄中5羟甲基糠醛的提取分离及含量测定［J］.中草药，1995,26(1):13-14.
［2］耿放，王喜军. 5羟基糠醛(5HMF)在中药复方中的研究现状及相关药效探讨［J］. 世界科学技术中医药现代化,2005, 7(6):52-54.
［3］冯建明，赵仁. 三种地黄炮制品现代研究进展［J］. 云南中医学院学报，2000,23(12):40-42.
［4］楚文，张昌斌，曹永红，等. 限制5羟甲基糠醛生成条件和探讨［J］. 人民军医药学专刊，1998,14(2):101-103.
［5］饶品昌，黄道明．薄层扫描法测定熟地黄中5羟甲基糠醛的含量［J］. 中成药，1998,20(8):20-21.
［6］张清波，乔菲，陈晓雪，等. HPLC法测定熟地黄中5羟甲基糠醛的含量［J］. 中国药品标准，2001,2(4):33-34.
［7］秦向阳，周军，李晓曄，等. RP HPLC法测定熟地黄中5羟甲基糠醛的含量［J］. 第四军医大学学报,2006,27（6）:510-511.。