Bradford法测蛋白质浓度

Bradford法测蛋白质浓度
Bradford法测蛋白质浓度
Bradford 蛋白检测
就是考兰法。

特点
1.快速：10分钟既可完成测定。

2.稳定：加样，混匀后 2 分钟既可测定， 1 小时内吸光度变化不超过10%。

3.高敏感度：可精确定量 1～1000 μg/ml 的蛋白样品。

4. 595 nm检测
4.不受绝大部分样品中的化学物质的影响。

巯基乙醇的浓度可高达1M，二硫苏糖醇的浓度可高达5 mM。

但受略高浓度的表面活性剂影响。

若SDS高于0.1%，TritonX-100高于0.1%，Tween20，60，80高于0.06%，可取少量样品加水稀释到适当浓度，再行测定。

考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质浓度
1、试剂：
（1）考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml, 滤纸过滤。

最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250, 4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。

（2）标准蛋白质溶液：
纯的牛血清血蛋白，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成100
ug/ml蛋白溶液。

2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器
3、标准曲线的制作
试管编号 0 1 2 3 4 5 6
100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
考马斯亮蓝试剂（ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。

4、样品中蛋白质含量的测定
另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。

注意事项：
1、如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。

2、若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除。

一、实验目的
配制一组浓度分别为0.10mg/ml ，0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ，0.02mg/ml，0 mg/ml的牛血清蛋白（BSA）溶液，测定这组溶液的吸光度，得到蛋白质浓度对吸光度的一条标准曲线。

测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线得到蛋白质的浓度。

二、实验原理
考马斯亮蓝（CBB）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。

考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。

其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。

蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。

该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/ml，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

三、实验过程
1．准备所需的药品和仪器。

2．计算所需配制的溶液的量。

先配制1 mg/ml的牛血清蛋白（BSA）母液，再往母液中加入磷酸缓冲溶液（PBS）配制一组浓度分别为1.0mg/ml ，0.8mg/ml，0.6mg/ml ，0.4mg/ml ，0.2mg/ml的BSA溶液，再将这组溶液稀释10倍，得到一组浓度分别为0.10mg/ml ，0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ，0.02mg/ml的BSA溶液。

计算第一步稀释各组需要的BSA溶液及PBS溶液的体积。

3．具体操作过程。

用天平称量1.00g牛血清蛋白（BSA），溶于去离子水中，配成100ml的溶液，溶液的浓度为10mg/ml。

用移液枪分别取100ul，80ul，60ul，40ul，20ul的BSA溶液，置于1.5ml的EP管中，再分别加入900ul，920ul，940ul，960ul，980ul的磷酸缓冲溶液（PBS）配成1ml的溶液，震荡使溶液混合均匀。

得到一组浓度分别为
1.0mg/ml ，0.8mg/ml，0.6mg/ml ，0.4mg/ml ，0.2mg/ml的BSA溶液。

移液枪分别移取100ul刚配好的一组BSA溶液，置于1.5ml的EP 管中，各加入900ul的PBS溶液，震荡使溶液混合均匀。

得到一组浓度分别为0.10 mg/ml ，0.08mg/ml，0.06mg/ml ，0.04mg/ml ，0.02mg/ml的BSA溶液。

另外量取1ml的PBS溶液（BSA溶液浓度为0 mg/ml）作对照试验。

用移液枪分别移取50ul配好的一组BSA溶液，滴加到孔板中，再分别加入200ul的考马斯亮蓝（CBB）。

静置10min后，用酶标仪测得这组BSA溶液的吸光度。

四、实验数据及处理
测得的BSA溶液的吸光度如下：
五、实验结果分析
得到的吸光度对BSA浓度的关系曲线为y=3.09x+0.6807，
R2=0.9541。

可以看出吸光度—浓度的关系曲线中R2值较小，即测得的吸光度与浓度的线性不是很好。

究其原因可能有以下两点：一是移液枪的操作不是很熟练，二是移液枪在移液过程中存在着气泡，使移的液体体积不准确。