第十四章细胞融合
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1．植物细胞融合
（1）PEG诱导融合时关键是作用时间，尤其 是高Ca2＋和pH溶液处理时间长短非常重要。
（2）PEG规格和纯度与融合效率也有关。目 前发现PEG毒性是其中杂质所致，经纯化后 即无毒性。故目前应用分子质量较大者 （4000～6000）居多。
（3）在电场诱导融合时，融合率与原生质 体密度有关；最适宜的密度一般为2×104～ 8×104个/mL。
如： 亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培养基 上不能超过50个世代 亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在MS上 生长 杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上 生长，而亲本和其它细胞死亡
3）利用物理特性筛选法：根据亲本的原 生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移 率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。
病毒促使细胞融合的主要步骤：
（1）两个原生质体或细胞在病毒黏结作用 下彼此靠近。
（2）通过病毒与原生质体或细胞膜的作用 使两个细胞膜互相渗透，胞质相互渗透。
（3）两个原生质体的细胞核互相融合，融 为一体。
（4）进入正常的细胞分裂途径，分裂成含 有两种染色体的杂种子细胞。
病 毒 诱 导 细 胞 融 合 示 意 图
亲本1：异硫氰酸荧光素（FITC）标记
亲本2：碱性蕊香红荧光素标记
在荧光显微镜下，亲本1为绿色，亲本2 为红色色，杂种细胞可以区分
细胞杂种的鉴定 （1）杂种植物形态特征、特性鉴定 （2）杂种植物的核型分析 （3）同工酶分析 （4) 分子标记鉴定
RFLP鉴定、RAPD标记鉴定
2、体细胞杂种的鉴定
有共同质膜的融合体。
1. PEG诱导融合法
PEG的作用机理： 由于PEG分子具有轻微的负 极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水 化合物等形成H键，当PEG分子链足够长时，在相邻原 生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘 连。与膜相连的PEG分子被洗掉后，膜上电荷发生紊 乱而重新分配。当两层膜紧密接触的区域电荷重新分 配时，可能使一种原生质体上的带正电荷的基团连接 到另一种原生质体的带负电荷的基团上，进而促使原 生质体的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性， 也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。
负极
++ + ++ +
----
+ + -+
-+ -+
- 正极
施加直流电场后，形成串珠的原生质体
在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的
交流
+ + -+
-+ -+ -
+
-+-来自+ -+
+ + -+
-+
-+
-
-+
-
2．基本过程(略) 电融合装置的电极有两种： 微电极型 平行多电极型
四、细胞融合的影响因素
第三节 基本原理
* 细胞融合的一些基本概念
基因型相同的细胞融合成的杂交 细胞称为同核体；来自不同基因型的 杂交细胞则称为异核体
同种细胞在培养时2个靠在一起的 细胞自发合并，称自发融合；异种间 的细胞必须经诱导剂处理才能融合， 称诱发融合
* 细胞融合经历的主要过程： 细胞相互靠近→ 细胞桥形成→ 胞质渗透→ 细胞核融合
二、化学法—PEG结合高pH、高Ca＋ 诱导法
1．基本原理
聚乙二醇（PEG）是一种多聚化合物。可能 的原因：大量负电荷的PEG分子和原生质体表 面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键， 促使异源的原生质体间的黏着而结合，用高 Ca2＋和pH溶液将与质膜结合的PEG分子进行洗 脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种 原生质体上的正电荷连接起来，进而形成具
第十四章 细胞融合
（教材第六、十三章）
细胞融合的定义 细胞融合的意义 基本原理 融合材料 细胞融合技术 融合细胞的选择 细胞融合技术的应用举例 细胞融合技术的进展与展望
第一节 细胞融合的定义
* 细胞融合的定义: 细胞融合又称体细胞杂交, 是指将
不同来源的原生质体相融合并使之分化 再生,形成新物种或新品种的技术。
状态。
（4）细胞融合过程中，通常耗氧量 较大，缺氧时经常不融合。
（5）有些细胞融合时需要Ca2＋，否则 不融合，细胞蛋白质亦发生变化。
（6）最适合的pH为7.4～7.8之间， 在此范围之外，融合率均较低。
综合：细胞融合的影响因素
PEG诱导法：
PEG规格、纯度，作用时间
电诱导法：
原生质体密度 交流电压 交变电场的振幅频率 交变电场的处理时间 直流高频电压 脉冲宽度 脉冲次数
细胞融合是20世纪60年代发展起来 的一项细胞工程技术
第二节 细胞融合的意义
* 细胞融合意义:
1．有性杂交变无性杂交,加快育种速度
2．进行体细胞融合可打破远缘杂交的 不亲和性培育远缘杂交新种
3．创造新细胞质杂种，如细胞质雄性 不育、抗除草剂
4．制备单克隆抗体、植物育种中的核 质替换和细胞器的互作研究
- - + + -
-+ +-
桥梁
示
PEG被洗掉
意 +- +-
图
电荷重排
+ -+
融合
+ -+ -
原生质体膜接触
PEG诱导融合的特点：其优点是 融合成本低，勿需特殊设备； 融合子产生的异核率较高；融 合过程不受物种限制。其缺点 是融合过程繁琐，PEG可能对细
胞有毒害。
2．基本过程
（1）以植物原生质体为例，PEG法 诱导原生质体融合的基本过程：
第五节
细胞融合技术
p126-p133
生物法—仙台病毒法 化学法—PEG结合高Ca＋、
高pH诱导法 物理法—电融合诱导法 细胞融合的影响因素
一、生物法—仙台病毒法（HVJ）
仙台病毒属于黏液病毒副流感类群， 是RNA病毒，多型颗粒状，易在小鼠中 蔓延。仙台病毒促细胞融合的有效部 位是膜，促细胞融合的因素是病毒被 膜上的磷脂成分。
Ca2+浓度 0.05 mol/L pH 9.5-10.5
三、物理法—电融合诱导法
1．基本原理
20世纪80年代出现。在直流电脉冲 的诱导下，原生质体质膜表面的电荷 和氧化还原电位发生改变，使异种原 生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进 而闭合成完整的膜形成融合体。
电融合法
1979年：Senda首先实现原生质体融合 交流电使原生质体排成串珠
第六节 融合细胞的选择
细胞融合体类型 比较常用的杂种细胞筛选方法
一、细胞融合体类型 1．同核体—同源原生质体的融合体 2．异核体—异源原生质体的融合体 3．多核体—含有双亲不同比例核物质
的融合体
细胞融合体类型
原理：两种亲本细胞融合 的混合物中可能有多种类 型细胞，筛选的目的是获 得优良的杂种细胞。
细胞融合过程
第四节 融合材料
植物或微生物原生质体的制备 动物单个细胞的获得
一、植物或微生物原生质体的制备
除去细胞壁的裸露细胞，称为 原生质体。
植物叶片、植物根尖组织、植 物花粉、愈伤组织或悬浮培养的细 胞均可。
植物叶片细胞获原生质体
二、动物单个细胞的获得
动物细胞间连接方式多样，分离单 细胞的步骤是： （1）组织的获得 （2）组织的消化
直流电使原生质体质膜发生不可逆击穿
与PEG融合比较起来，电融合有三大优 点：一是不存在对细胞的毒害问题； 二是融合效率高； 三是融合技术操作简便。 电融合仪的结构特点： 一是交变电场部分； 一是高频直流电击部分。
电融合的基本过程：
细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时， 电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结 果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原 生质体紧密接触排列成串；
（4）在融合液中加入少量CaCl2，即可维 持一定电导率，对细胞也有保护作用；其 次交变电流强弱、处理时间长短及电脉冲 大小均会影响融合率。
（5）此外，用混合盐溶液对原生质体进 行融合前预处理，以及在促融剂中添加伴 刀豆球蛋白、二甲基亚砜、胰蛋白酶、精 胺或亚精胺等也可提高融合效率。
2.动物细胞融合 （1）亲本细胞表面性质影响较大。 （2）细胞种类不同，融合效果也不同。 （3）细胞融合时需要适宜温度和运动
膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲 就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融 合在一起。
关于融合参数：电融合中的主要参数包括交流电压、交变 电场的振幅频率、交变电场的处理时间；直流高频电压、 脉冲宽度、脉冲次数等。
电融合法原理
交流电场使原生质体表面电荷偶极化，
沿着电极排列，形成串珠
分离→ 纯化→ 融合→ 选择→ 再生→ 鉴定
（2）融合中应注意的问题： ① 两种原生质体的识别标记 ② 原生质体的密度应在105个/ml ③ 常用PEG的分子量通常为4000～6000 ④ 计算：
融合率＝（融合细胞的细胞核总数/视野内全部细 胞的细胞核总数）×100％
高pH和高Ca2+促细胞融合
1）亲本 2）同核体：同源原生质体
的融合体 3）异核体：非同源的原生
质体的融合体 4）多核体：含有双亲不同
比例核物质的融合体 5）异胞质体：具有不同胞
质来源的杂合细胞。 6）核质体：有细胞核而带
有少量细胞质的亚原生质 体
二、比较常用的杂种细胞筛选方法： 1．遗传互补筛选法 2．抗性互补筛选 3．物理特性筛选法 4．生长特性筛选法 5．其它方法
1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个 功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令 杂种细胞表现正常。
如亲本1：叶绿体缺陷型
亲本2：光致死型
两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白
色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长
2）抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质 体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差 异选择杂种细胞。
形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察 进行鉴定。
细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。 生化鉴定：同功酶鉴定。
分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。
2-1、形态学
比较再生植株与融合亲本在形态上的 异同
（1）PEG诱导融合时关键是作用时间，尤其 是高Ca2＋和pH溶液处理时间长短非常重要。
（2）PEG规格和纯度与融合效率也有关。目 前发现PEG毒性是其中杂质所致，经纯化后 即无毒性。故目前应用分子质量较大者 （4000～6000）居多。
（3）在电场诱导融合时，融合率与原生质 体密度有关；最适宜的密度一般为2×104～ 8×104个/mL。
如： 亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培养基 上不能超过50个世代 亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在MS上 生长 杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养基上 生长，而亲本和其它细胞死亡
3）利用物理特性筛选法：根据亲本的原 生质体大小、颜色、漂浮密度及电泳迁移 率、形成的愈伤组织的差异筛选杂种细胞。
病毒促使细胞融合的主要步骤：
（1）两个原生质体或细胞在病毒黏结作用 下彼此靠近。
（2）通过病毒与原生质体或细胞膜的作用 使两个细胞膜互相渗透，胞质相互渗透。
（3）两个原生质体的细胞核互相融合，融 为一体。
（4）进入正常的细胞分裂途径，分裂成含 有两种染色体的杂种子细胞。
病 毒 诱 导 细 胞 融 合 示 意 图
亲本1：异硫氰酸荧光素（FITC）标记
亲本2：碱性蕊香红荧光素标记
在荧光显微镜下，亲本1为绿色，亲本2 为红色色，杂种细胞可以区分
细胞杂种的鉴定 （1）杂种植物形态特征、特性鉴定 （2）杂种植物的核型分析 （3）同工酶分析 （4) 分子标记鉴定
RFLP鉴定、RAPD标记鉴定
2、体细胞杂种的鉴定
有共同质膜的融合体。
1. PEG诱导融合法
PEG的作用机理： 由于PEG分子具有轻微的负 极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水 化合物等形成H键，当PEG分子链足够长时，在相邻原 生质体之间形成分子桥，其结果是使原生质体发生粘 连。与膜相连的PEG分子被洗掉后，膜上电荷发生紊 乱而重新分配。当两层膜紧密接触的区域电荷重新分 配时，可能使一种原生质体上的带正电荷的基团连接 到另一种原生质体的带负电荷的基团上，进而促使原 生质体的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性， 也使原生质体的核、细胞器发生融合成为可能。
负极
++ + ++ +
----
+ + -+
-+ -+
- 正极
施加直流电场后，形成串珠的原生质体
在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的
交流
+ + -+
-+ -+ -
+
-+-来自+ -+
+ + -+
-+
-+
-
-+
-
2．基本过程(略) 电融合装置的电极有两种： 微电极型 平行多电极型
四、细胞融合的影响因素
第三节 基本原理
* 细胞融合的一些基本概念
基因型相同的细胞融合成的杂交 细胞称为同核体；来自不同基因型的 杂交细胞则称为异核体
同种细胞在培养时2个靠在一起的 细胞自发合并，称自发融合；异种间 的细胞必须经诱导剂处理才能融合， 称诱发融合
* 细胞融合经历的主要过程： 细胞相互靠近→ 细胞桥形成→ 胞质渗透→ 细胞核融合
二、化学法—PEG结合高pH、高Ca＋ 诱导法
1．基本原理
聚乙二醇（PEG）是一种多聚化合物。可能 的原因：大量负电荷的PEG分子和原生质体表 面的负电荷间在钙离子的连接下形成静电键， 促使异源的原生质体间的黏着而结合，用高 Ca2＋和pH溶液将与质膜结合的PEG分子进行洗 脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种 原生质体上的正电荷连接起来，进而形成具
第十四章 细胞融合
（教材第六、十三章）
细胞融合的定义 细胞融合的意义 基本原理 融合材料 细胞融合技术 融合细胞的选择 细胞融合技术的应用举例 细胞融合技术的进展与展望
第一节 细胞融合的定义
* 细胞融合的定义: 细胞融合又称体细胞杂交, 是指将
不同来源的原生质体相融合并使之分化 再生,形成新物种或新品种的技术。
状态。
（4）细胞融合过程中，通常耗氧量 较大，缺氧时经常不融合。
（5）有些细胞融合时需要Ca2＋，否则 不融合，细胞蛋白质亦发生变化。
（6）最适合的pH为7.4～7.8之间， 在此范围之外，融合率均较低。
综合：细胞融合的影响因素
PEG诱导法：
PEG规格、纯度，作用时间
电诱导法：
原生质体密度 交流电压 交变电场的振幅频率 交变电场的处理时间 直流高频电压 脉冲宽度 脉冲次数
细胞融合是20世纪60年代发展起来 的一项细胞工程技术
第二节 细胞融合的意义
* 细胞融合意义:
1．有性杂交变无性杂交,加快育种速度
2．进行体细胞融合可打破远缘杂交的 不亲和性培育远缘杂交新种
3．创造新细胞质杂种，如细胞质雄性 不育、抗除草剂
4．制备单克隆抗体、植物育种中的核 质替换和细胞器的互作研究
- - + + -
-+ +-
桥梁
示
PEG被洗掉
意 +- +-
图
电荷重排
+ -+
融合
+ -+ -
原生质体膜接触
PEG诱导融合的特点：其优点是 融合成本低，勿需特殊设备； 融合子产生的异核率较高；融 合过程不受物种限制。其缺点 是融合过程繁琐，PEG可能对细
胞有毒害。
2．基本过程
（1）以植物原生质体为例，PEG法 诱导原生质体融合的基本过程：
第五节
细胞融合技术
p126-p133
生物法—仙台病毒法 化学法—PEG结合高Ca＋、
高pH诱导法 物理法—电融合诱导法 细胞融合的影响因素
一、生物法—仙台病毒法（HVJ）
仙台病毒属于黏液病毒副流感类群， 是RNA病毒，多型颗粒状，易在小鼠中 蔓延。仙台病毒促细胞融合的有效部 位是膜，促细胞融合的因素是病毒被 膜上的磷脂成分。
Ca2+浓度 0.05 mol/L pH 9.5-10.5
三、物理法—电融合诱导法
1．基本原理
20世纪80年代出现。在直流电脉冲 的诱导下，原生质体质膜表面的电荷 和氧化还原电位发生改变，使异种原 生质体黏合并发生质膜瞬间破裂，进 而闭合成完整的膜形成融合体。
电融合法
1979年：Senda首先实现原生质体融合 交流电使原生质体排成串珠
第六节 融合细胞的选择
细胞融合体类型 比较常用的杂种细胞筛选方法
一、细胞融合体类型 1．同核体—同源原生质体的融合体 2．异核体—异源原生质体的融合体 3．多核体—含有双亲不同比例核物质
的融合体
细胞融合体类型
原理：两种亲本细胞融合 的混合物中可能有多种类 型细胞，筛选的目的是获 得优良的杂种细胞。
细胞融合过程
第四节 融合材料
植物或微生物原生质体的制备 动物单个细胞的获得
一、植物或微生物原生质体的制备
除去细胞壁的裸露细胞，称为 原生质体。
植物叶片、植物根尖组织、植 物花粉、愈伤组织或悬浮培养的细 胞均可。
植物叶片细胞获原生质体
二、动物单个细胞的获得
动物细胞间连接方式多样，分离单 细胞的步骤是： （1）组织的获得 （2）组织的消化
直流电使原生质体质膜发生不可逆击穿
与PEG融合比较起来，电融合有三大优 点：一是不存在对细胞的毒害问题； 二是融合效率高； 三是融合技术操作简便。 电融合仪的结构特点： 一是交变电场部分； 一是高频直流电击部分。
电融合的基本过程：
细胞膜的接触：当原生质体置于电导率很低的溶液中时， 电场通电后，电流即通过原生质体而不是通过溶液，其结 果是原生质体在电场作用下极化而产生偶极子，从而使原 生质体紧密接触排列成串；
（4）在融合液中加入少量CaCl2，即可维 持一定电导率，对细胞也有保护作用；其 次交变电流强弱、处理时间长短及电脉冲 大小均会影响融合率。
（5）此外，用混合盐溶液对原生质体进 行融合前预处理，以及在促融剂中添加伴 刀豆球蛋白、二甲基亚砜、胰蛋白酶、精 胺或亚精胺等也可提高融合效率。
2.动物细胞融合 （1）亲本细胞表面性质影响较大。 （2）细胞种类不同，融合效果也不同。 （3）细胞融合时需要适宜温度和运动
膜的击穿：原生质体成串排列后，立即给予高频直流脉冲 就可以使原生质膜击穿，从而导致两个紧密接触的细胞融 合在一起。
关于融合参数：电融合中的主要参数包括交流电压、交变 电场的振幅频率、交变电场的处理时间；直流高频电压、 脉冲宽度、脉冲次数等。
电融合法原理
交流电场使原生质体表面电荷偶极化，
沿着电极排列，形成串珠
分离→ 纯化→ 融合→ 选择→ 再生→ 鉴定
（2）融合中应注意的问题： ① 两种原生质体的识别标记 ② 原生质体的密度应在105个/ml ③ 常用PEG的分子量通常为4000～6000 ④ 计算：
融合率＝（融合细胞的细胞核总数/视野内全部细 胞的细胞核总数）×100％
高pH和高Ca2+促细胞融合
1）亲本 2）同核体：同源原生质体
的融合体 3）异核体：非同源的原生
质体的融合体 4）多核体：含有双亲不同
比例核物质的融合体 5）异胞质体：具有不同胞
质来源的杂合细胞。 6）核质体：有细胞核而带
有少量细胞质的亚原生质 体
二、比较常用的杂种细胞筛选方法： 1．遗传互补筛选法 2．抗性互补筛选 3．物理特性筛选法 4．生长特性筛选法 5．其它方法
1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个 功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷，令 杂种细胞表现正常。
如亲本1：叶绿体缺陷型
亲本2：光致死型
两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白
色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长
2）抗性互补筛选法：利用亲本细胞原生质 体对抗生素、除草剂及其它有毒物质抗性差 异选择杂种细胞。
形态鉴定：根据双亲的形态学性状观察 进行鉴定。
细胞学鉴定：细胞器鉴定、染色体鉴定。 生化鉴定：同功酶鉴定。
分子鉴定：RFLP鉴定、RAPD标记鉴定。
2-1、形态学
比较再生植株与融合亲本在形态上的 异同