半枝莲、夏枯草萜类生物合成相关基因的鉴定及功能研究

半枝莲、夏枯草萜类生物合成相关基因的鉴定及功能研究
半枝莲Scutella barbata 和夏枯草Prunella vulgaris属于唇形科植物。

半枝莲是一种重要的药用植物,广泛应用于中国、韩国、印度等亚洲国家。

新克罗烷型二萜类化合物是半枝莲中主要的活性成分,对多种癌细胞具有良好的细胞毒性。

夏枯草是唇形科分布最广泛的物种,是一种常用的中药材及草药制剂。

三萜类化合物是夏枯草的主要活性成分。

本论文通过对半枝莲和夏枯草不同组织进行Illumina测序及分析,系统克隆萜类化合物生物合成途径中的基因,并对部分二萜合酶基因进行了功能鉴定,为唇形科植物萜类化合物多样性的产生机制以及特定萜类化合物的生物合成途径研究奠定了基础。

主要研究结果如下:1、首先对半枝莲和夏枯草的不同组织进行转录组测序及组装。

提取半枝莲的根(BZLR)、茎叶(BZLS)、花(BZLF)三个组织的RNA;夏枯草的根(XKCR)、茎叶(XKCS)、花穗(XKCF)以及未成熟的种子(XKCZ)四个组织的RNA。

每个组织分别进行两次重复。

将半枝莲中121,958,564条clean
RNA-sequence reads 组装成 88,980 个转录本,共计 52,211 个 unigenes。

unigenes平均长度为1370 nt,N50长度为2144 nt;夏枯草中121,809,359条clean RNA-sequence reads 组装成 108,672 个转录本,共计 57,985 个unigenes。

Unigene 平均长度为1,120 nt,N50长度为1,843 nt。

通过搜索常用公共数据库如Swiss-Prot、TrEMBL、Pfam(HMM)、Gene Ontology 和 KEGG 等,结果半枝莲中有36659 个 unigenes(70.23%),夏枯草中有 33323 个 unigenes(54.47%)得到了注释。

2、利用NCBI公共数据库和丹参、拟南芥等已知基因序列系统鉴定参与半枝莲和夏枯草中萜类backbone生物合成的基因。

半枝莲和夏枯草分别注释71个unigenes和53个unigenes。

共计鉴定33个基因(32个具有全长cDNA)和35个(35个具有全长cDNA)分别参与半枝莲和夏枯草中萜类backbone的生物合成。

对照丹参全基因组鉴定的backbone基因,我们鉴定了半枝莲和夏枯草中全部17个参与萜类backbone生物合成的基因家族。

包括MVA途径的
AACT,HMGS,HMGR,MVK,PMK,MDD 基因;MEP 途径的
DXS,DXR,MCT,CMK,MDS,HDS,HDR和 IDI,IPK基因;异戊烯转移酶
FPPS,GGPPS,GPPS.SSU基因。

发现10个基因家族在三个物种中非常保守,分别为
AACT,HMGS,MK,PMK,MDD,DXS,DXR,MCT,CMK 和 MDS。

而另外 7 个基因家族,则在不同物种中表现出一定程度的扩张和收缩。

如HMGR基因家族在夏枯草和丹参中均有4个基因,而在半枝莲中只有3个。

DXS在半枝莲和丹参中均有5个基因,而在夏枯草中有6个,以及IDI,FPPS,HDR 和GGPPS基因家族均略有差异。

3、在半枝莲和夏枯草中分别鉴定了 14个和17个萜类合酶基因。

通过聚类分析显示半枝莲和夏枯草中分别有1个和2个基因属于TPS-b基因家族,推测参与单萜的生物合成。

分别有5个和9个基因属于TPS-a基因家族,推测参与半枝莲和夏枯草中倍半萜的生物合成。

半枝莲和夏枯草中分别有8个和6个二萜合酶基因。

由于夏枯草富含三萜类化合物,因此对夏枯草中的三萜合成相关基因进行了鉴定。

共计鉴定了9个基因,包括2个角鲨烯合成酶(SQS),2个角鲨烯单加氧酶(SM),以及5个氧化角鲨烯环化酶(OSC)。

OSC基因家族负责多样化的三萜骨架形成,聚类分析显示PvOSC2,PvOSC3以及半枝莲的SbOSC2与人参中的达玛烷型dammarenediol II合酶聚为一类,后者参与人参中的人参皂甙的生物合成,推测该类OSC基因在唇形科中也普遍存在,其催化功能值得进一步探索。

为进一步揭示上述萜类生物合成相关基因可能的生物学功能以及它们之间的关系,我们分别对半枝莲和夏枯草的表达谱数据进行基于log-2转化的FPKM值的聚类分析。

结果表明,半枝莲的二萜合酶基因TPS8,TPS2以及HMGR3主要在根和花中高表达。

DXP途径中的基因在不同组织均表现出高水平的表达,这与二萜类化合物主要通过DXP途径合成的认知相符。

DXS1和二萜合酶基因TPS11特异地在地上部分的茎叶中高表达,因此,该基因有可能参与半枝莲中新克罗烷型二萜化合物的生物合成。

单萜和倍半萜合酶在不同组织中均具有较低的表达水平。

因此,二萜类生物合成途径在半枝莲中占有优势地位。

发现夏枯草中高表达的基因主要来源于MVA途径,如HMGR1,HMGR3,IDI1,AACT1,FPPS1,及HMGS与三萜合酶相关基因SQS1,OSC2和OSC3,这也与三萜合成主要来源于MVA途径和夏枯草富含三萜类化合物的报道一致。

4、对半枝莲和夏枯草中二萜合酶基因的克隆和体外功能鉴定研究。

从半枝莲和夏枯草根cDNA中分别克隆到3个和2个二萜合酶基因,其序列与转录组组装序列一致。

SbTPS8,SbTPS9和SbTPS12的cDNA长度分别为2793bp,2690bp 和 3102bp,蛋白长度分别为 803aa,810aa 和 594aa;PvTPS14 和PvTPS16的CDNA长度分别为2403bp和1785bp,蛋白长度分别为800aa和593aa。

SbTPS8,SbTPS9和PvTPS14
具有保守的结构域是DxDD结构与,为Class Ⅱ二萜合酶。

SbTPS12和PvTPS16具有保守的DDxxD结构域,为Class I二萜合酶。

将半枝莲,夏枯草与唇形科中52个已知功能二萜合酶进行系统进化树分析显
示,SbTPS9,PvTPS15与参与ent-CPP形成的二萜合酶聚为一类。

SbTPS8和PvTPS14与唇形科中特化的CPP/LDPP合酶聚类。

进一步大肠杆菌原核表达发现SbTPS8,SbTPS9,SbTPS12重组蛋白可溶性好,纯化后目的蛋白的条带大小与预测的一致。

而PvTPS14和PvTPS在相同条件下可溶蛋白表达量低。

对其诱导温度及纯化条件进行优化,依然没有得到可溶性目的蛋白。

以GGPP为底物,将纯化后的pET32-CPS重组蛋白分别与丹参的SmKSL1和拟南芥中的AtKS进行体外酶促反应。

SmKSL1特异作用于normal-CPP,而AtKS特异作用于ent-CPP。

结果表明,SbTPS8只与SmKSL1共催化,产物与丹参中SmCPSl(normal-CPP合酶)和SmKSL1共催化产物一致,为miltiradiene,确定其为normal-CPP合酶。

SbTPS9只与AtKS共催化,产物与丹参中SmCPS5(ent-CPP合酶)和AtKS共催化产物一致,为ent-kaurene,因此确定SbTPS9为ent-CPP合酶。

SbTPS12与SbTPS8共催化产生miltiradiene,确定SbTPS12为miltiradiene 合酶。

体外验证PvTPS 14和PvTPS 16无明显的稳定活性。

5、利用高产GGPP的大肠杆菌工程菌体系验证Class I二萜合酶的底物杂泛性的研究。

首先利用南欧丹参Salvia sclarea的香紫苏醇合酶(SsSS)来验证己报道大肠杆菌工程菌体系的重复性和稳定性。

SsSS分别与12种class Ⅱ型二萜合酶共同发酵,结果SsSS与9种二萜合酶
共同发酵能检测到明显的与文献报道一致的产物,而与CLPP(12)和ent-CLPP(13)共同发酵的产物量低。

由于terpentedienyl diphosphate(9)载体的抗性特殊,不便于高通量操作,因此,本实验利用该体系测试了SbTPS12和PvTPS16与11种class II型二萜合酶的反应情况。

结果表明,SbTPS12可以与两种类型的底物反应,SbTPS12与Copaly1 diphosphate(3)共催化产物为miltiradiene;SbTPS12与ent-kolavenyl diphosphate(12)共催化产物为ent-kaurene。

PvTPS16可以与四种类型的底物反应,与Copalyl diphosphate(3)和8α-hydroxy-CPP(7)的产物为miltiradiene。

与endo-CPP(6)共催化的产物推测为 13R-(+)-manoyl oxide。

说明
SbTPS12,PvTPS16具有不同程度的底物杂泛性,不同的KSL可以催化的底物类型是不同的。

综上,本研究利用Illumina测序、数字表达谱、大肠杆菌体外酶促鉴定及大肠杆菌工程菌等体系对半枝莲、夏枯草中参与萜类生物合成的相关基因进行了系统鉴定和分析。

半枝莲DXP途径基因的高水平表达,二萜合酶基因的扩张以及在根、地上部分的不同表达模式,推测二萜类生物合成途径为半枝莲的优势生物合成途径。

而夏枯草中MVA途径以及三萜生物合成的一系列酶基因在不同组织呈现较高表达,从而推测三萜生物合成途径为夏枯草中的优势生物合成途径。

4个二萜合酶基因功能的鉴定和底物杂泛性的研究,明确了相关基因的功能及其催化反应特性。

这些结果使我们对半枝莲和夏枯草的萜类生物合成有了全面的认识,从分子水平上阐释了半枝莲和夏枯草中萜类化合物多样性的成因,并为通过基因工程技
术提高萜类化合物产量奠定了基础。