高光效基因工程育种研究进展及展望

第41卷第3期黄冈师范学院学报V o l.41N o.3 2021年6月J o u r n a l o fH u a n g g a n g N o r m a lU n i v e r s i t y J u n e.2021
高光效基因工程育种研究进展及展望
乌兰,汤欣欣,胡孝明,朱华国
(黄冈师范学院生物与农业资源学院,湖北黄冈438000)
摘要:光合作用是地球上最重要的生命活动之一,植物的90%生物学产量直接来自于光合作用产生的有机化合物㊂本文回顾了C3植物高光效基因工程育种研究工作,重点介绍了C3碳同化途径的特点和R u b i s c o的修饰与改造,以及利用C4途径关键酶基因提高C3植物光合效率方面的研究进展㊂油茶作为主要的木本油料作物之一,营养物质需求巨大,具有C O2饱和点较低㊁补偿点较高,光合效率不高的C3植物特性㊂综述C3植物高光效基因工程育种研究进展,可为油茶高光效基因工程育种提供参考㊂
关键词:高光效育种;基因工程;C3植物;R u b i s c o;C4途径;油茶
中图分类号:S-1文献标志码:A 文章编号:2096-7020(2021)03-0032-06
收稿日期:2020-11-20D O I:10.3969/j.i s s n.2096-7020.2021.03.06O S I D:
作者简介:乌兰,女,内蒙古呼和浩特人,博士,主要研究方向为植物遗传改良与生物技术利用㊂通信作者:朱华国,男,湖北黄冈人,教授,博士,主要研究方向为植物遗传改良与生物技术利用㊂基金项目:经济林种质改良及资源综合利用湖北省重点实验室及大别山特色资源开发湖北省协同创新中心开放基金项目(201931403);黄冈师范学院高级别培育项目重点项目(202001003);黄冈师范学院博士基金项目(2042019014)㊂
R e s e a r c h p r o g r e s s a n d p r o s p e c t o f h i g h l i g h t-e f f i c i e n c y g e n e t i c e n g i n e e r i n g b r e e d i n g
W UL a n,T A N GX i n-x i n,H UX i a o-m i n g,Z H U H u a-g u o
(C o l l e g e o fB i o l o g y a n dA g r i c u l t u r a lR e s o u r c e s,H u a n g g a n g N o r m a lU n i v e r s i t y,H u a n g g a n g438000,H u b e i,C h i n a)
A b s t r a c t P h o t o s y n t h e s i s i s o n e o f t h em o s t i m p o r t a n t l i f e a c t i v i t i e s o n e a r t h,a n dn i n e t yp e r c e n t o f t h e b i o l o g i c a l y i e l d o f p l a n t s i s d i r e c t l y d e r i v e d f r o mo r g a n i c c o m p o u n d s p r o d u c e db yp h o t o s y n t h e s i s.T h i s r e v i e wf o c u so nC3c a r b o na s s i m i l a-t i o n p a t h w a y a n d t h em o d i f i c a t i o na n d t r a n s f o r m a t i o no fR u b i s c o,a sw e l l a s t h e r e s e a r c h p r o g r e s s i n t h eu s eo f k e y e n-z y m e g e n e s o f t h eC4p a t h w a y t o i m p r o v e t h e p h o t o s y n t h e t i c e f f i c i e n c y o f C3p l a n t s.C a m e l l i a o l e i f e r a,a s o n e o f t h em a i n w o o d y o i l c r o p s,h a s a l a r g e d e m a n d f o rn u t r i e n t s,a n ds h o w sC3p l a n t p h o t o s y n t h e t i c c h a r a c t e r s,a l o w C O2s a t u r a t i o n p o i n t,h i g hc o m p e n s a t i o n p o i n t a n d l o w p h o t o s y n t h e t i ce f f i c i e n c y.T h e r e s e a r c h p r o g r e s s i nh i g hl i g h t e f f i c i e n c yg e n e t i c e n g i n e e r i n g b r e e d i n g o f C3p l a n t sw a s r e v i e w e d,w h i c h c o u l d p r o v i d e r e f e r e n c e f o r h i g h l i g h t e f f i c i e n c y g e n e t i c e n g i n e e r i n g b r e e d i n g o f C a m e l l i ao l e i f e r a.
K e y w o r d s h i g h p h o t o s y n t h e t i c e f f i c i e n c y b r e e d i n g;g e n e t i c e n g i n e e r i n g;C3p l a n t;R u b i s c o;C4p a t h w a y;C a m e l l i a o l e i f e r a
光合作用是地球上最重要的生物过程之一,它将无机物转变为有机物,将光能转变为化学能㊂现有研究表明,植物90%的生物学产量直接来自光合作用产生的有机化合物,如果它们的光合速率提高到满负荷,则产量将大大增加[1-2]㊂光合作用提供了几乎所有生物赖以生存的能量,并调节了地球大气层的组成㊂植物调控光合作用的网络庞大㊁机理复杂,深入探讨其作用机制,对于有效利用太阳能㊁最大限度的进行光合作用,获得更多的光合产物具有提纲挈领的意义㊂本文通过综
第3期
乌 兰,等:高光效基因工程育种研究进展及展望
述C 3植物高光效基因工程育种的研究进展,为油茶高光效基因工程育种提供参考㊂
1 高光效基因工程育种
1.1 高光效育种简介
高光效种质的发展始于20世纪60年代[3]
,早期研究主要集中在把C 3植物改造成C 4植物,局限在只要提高光合效率㊁降低呼吸效率就可以达到增产的目的,虽获得一些高光效种质,但在实
际中效果并不理想[
4-5]
㊂在进一步的研究中逐步完善了作物高光效育种概念:结合光合生理㊁生态和育种目标,利用现代遗传学和分子生物学研究方法和手段,通过整合形态结构上的高光效和生理功能上的高光效,提高群体光合效率,促进光合产物向种子中的转化,筛选出光合作用能力显著加强,产量㊁品质和抗性同步提高,且符合现代育种目标要求的高光效种质资源[
6
]㊂1.2 C 3植物高光效基因工程育种
1.2.1 R u b i s c o 的改造
地球上生命的生存依赖于光合作用,其中C O 2的固定以及随后的3
-磷酸甘油酸酯在卡尔文循环中的循环,它们为维持植物的生长发育提供了必要的碳水化合物基础㊂此过程称为卡尔文循环,其中的关键酶是核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(R i b u l o s e -1,5-b i s p h o s p h a t e c a r b o x y l -a s e /o x y g e n a s e ,R u b i s c o )㊂在C 3植物中,
R u b i -s c o 主要存在于叶肉细胞的叶绿体间质中,在基粒片层上也有少量分布㊂它每秒仅固定2~5个
C O 2分子,
由于周转速度慢和底物亲和力较弱的缺点而成为主要的改良目标[7
]㊂R u b i s c o 催化的
效率低下主要源于其双功能活性,即C O 2和O 2
在活性位点的竞争㊂固定O 2导致光呼吸的浪
费,这一过程消耗了固定C O 2和光呼吸的A
T P 总量的30%[7]
㊂随着R u b i s c o 氧合作用的增加,在水分胁迫㊁低C O 2和高温的条件下,光呼吸的成本变得更加严峻㊂R u b i s c o 与氧气催化了一种副反应,导致光呼吸过程中需释放出先前固定的
C O 2㊁N H 3和能量㊂此外,
R u b i s c o 催化反应缓慢且需要大量的酶支持才能达到足够的光合速率[8
]㊂R u b i s c o 约30亿年前在一个二氧化碳含量
极高的环境中演化而成,该环境中的分子氧很
少[9]
㊂随着地球大气层的变化,R u b i s c o 逐渐演变
成如今的形式:I 型的R u b i s c o 存在于植物㊁
藻类和蓝细菌中,它是一个550k D 的十六聚体,
由八个核基因r b c S 家族编码的小亚基(S S U ,14-15-k D a )和由叶绿体基因r b c L 编码的八个大亚基
(L S U s ,52-k D a )组成㊂S S U 前体在进入叶绿体
过程中经过处理与L S U 组装在一起产生了
R u b i s c o 全酶[10]
㊂r b c L 基因高度保守,而r b c S 较
不保守[11]
㊂此外,R u b i s c o 需要重复构象与重塑
才能保持活性,还需要多种方法使两个亚基的结
构协调一致[8
]㊂如果将R u b i s c o 的催化效率提高
5%~25%,
则可以在具有充足养分和水供应的适当植物中,在生长季节提高叶片的光合速率,最终
使干物质的产量提高数倍[
12-13
]㊂目前通过基因工程的方法改善R u b i s c o 在叶
绿体中的碳同化作用取得了一定的进展㊂最初发现R u b i s c o 在红藻中具有比在高等植物高很多倍
的固碳效率[14-15]
㊂在红藻中发现的R u b i s c o
,为其修饰改造提供了可靠依据㊂W h i t n e y 等通过质
体转化的方法将红藻R u b i s c o 的小亚基编码基因引入烟草的叶绿体中,得到了高效表达,但是表达
的小亚基却不能与烟草本身的大亚基组装成
R u b i s c o 全酶[16]
㊂在水稻中过表达r b c S 增加了R u b i s c o 含量,尽管R u b i s c o 含量最多增加30%,
但无论在高或低C O 2浓度下均未观察到光合速
率的相应提高[
17]
㊂这些研究说明了单纯提高R u b i s c o 组分大小亚基的表达并不能有效的改善
光合效率㊂之后,在玉米中关于突变体的研究确定了R u b i s c o 组装和幼苗存活所需的四个伴侣:
C p
n 60α1(G r o E L 的同系物)C P S 212,B u n d l e S h e a t hD e f e c t i v e2(B S D 2),含有蛋白质13的锌指蛋白和新型蛋白质R u b i s c oA s s e m b l y F a c t o r 1(R a f 1)和R u b i s c oA s s e m b l y F a c t o r 2(R a f 2)[18-19]㊂进一步研究发现,R a f 1能够能够拮抗支架蛋白
C c mM 介导的R u b i s c o 堆积及相变过程,
进而参与调控R u b i s c o 的堆积和羧酶体内核的形成[20]
㊂在C 3植物中参与R
u b i s c o 生物发生的新R u b i s c o 装配因子的发现,为在高等植物中修饰与改造R u b i s c o 提供了新的步骤,为光合速率的改善带来了新的突破口㊂
因此,要提高R u b i s c o 的固碳能力需要进一
步了解该酶的蛋白结构与其催化效率之间的关系,还有其大小亚基组装成全酶的修饰机制㊂直接提高R u b i s c o 本身的催化潜力至关重要,
但间接改善植物体内R u b i s c o 也同样关键[2
1]
㊂这些措施包括提高R u b i s c o 辅助蛋白㊁R u b i s c o 活化酶
的耐热性,以及对抑制R u b i s c o 活性的物质进行
㊃
33㊃
黄 冈 师 范 学 院 学 报 第41卷
调节等㊂在C 3模型植物物种(烟草等)和农作物物种(水稻,小麦等)相关研究已经开始进行㊂例如通过增加景天庚酮糖1,6-二磷酸酯酶(s e d o -
h e p t u l o s e o s e -1,7-b i s p h o s p
h a t a s e ,S B P a s e )活性来增强卡尔文循环中R u B P 的再生[22]
㊁增加R u b i s c o 活化酶的耐热性以及在中等温度下维持
R u b i s c o 活性[23]
㊂利用C R I S P R /C a s 9敲除水稻R u b i s c o 的小亚基r b c S ,并转入高粱的r b c S 基因
而获得的转基因水稻表达出类似C 4植物的催化特性[
24]
㊂在烟草中发现同时刺激电子传输和R u B P 再生会导致碳同化显着增加,
并致使温室和田间条件下生物量和产量的增加㊂在田间条件下可将植物生产力提高27%,
同时还可以有效减少植物的用水量[
25]
㊂近年来,植物高光效育种中对R u b i s c o 的研
究逐渐成为热点,不断在细胞层面和分子层面解析R u b i s c o 的复杂机制,正在研究通过酶工程或提高叶绿体中C O 2的方法来改善R u b i s c o 催化效率低下的问题,目前尚未阐明R u b i s c o 的组装机制,其活化酶R c a 的功能也尚未解析㊂未来对于R u b i s c o 的进一步研究将有助于我们改变植物尤其是C 3植物光合作用中的有机物积累和碳同化作用,为提高生物产量带来新的可能㊂1.2.2 C 3植物中引入C 4途径
与C 3植物相比,19世纪60年代C 4光合作用的发现以及对C 4高光合作用能力的认识引发
了对改善C 3植物固碳能力的关注
[26
],其根源是R u b i s c o 加氧酶反应的不同,以及C 3和C 4植物
之间的生态㊁生理关系的不同㊂人口增长与物质需求一直是研究的重点,而C 4途径以其具有的低光呼吸和高光合效率特性成为一条提高植物产量
的可靠途径[27]
㊂尽管C 3植物中缺乏C 4植物这
样的系统,但是可以通过基因工程的手段在C 3植
物叶片中实现引入㊂C 4途径将细胞质中的磷酸烯醇丙酮酸(P h o s p h o e n o l p y
r u v a t ,P E P )羧化,草酰乙酸转运到叶绿体中,草酰乙酸中的P E P 羧基激酶使草酰乙酸脱羧成P E P ,然后将P E P 转运回细胞质㊂四种C 4途径关键酶,即磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(P h o s p h o e n o l p y r u v a t e c a r b o x y
l a s e ,P E P C )㊁N A D P 依赖性苹果酸酶(N A D P -m a l i c e n z y
m e ,N A D P -M E )㊁苹果酸脱氢酶(M a l a t ed e -h y d r o g
e n a s e ,M D H )和丙酮酸正磷酸二激酶(P y r u v a t e p h o s p h a t e d i k i n a s e ,P P D K ),在将C O 2
浓缩在R u b i s c o 周围的过程中起着重要作用[2
8
]㊂P E P C 催化P E P 和H C O -3
形成草酰乙酸[29
]㊂O A A 代谢成苹果酸,
然后扩散到束缚鞘细胞中,通过在束缚鞘细胞中被羧化增加R u b i s c o 周围的
C O 2浓度㊂最终,C 4循环的初始底物P
E P 通过P P D K 在叶肉细胞中再生[3
0]
㊂前人研究发现参与C 4途径的光合酶也存在
于一些C 3植物中,
但活性较低[31-33
]㊂在典型的C 3植物烟草中,
木质部和韧皮部周围茎和叶柄的细胞中存在P E P C ,N A D P -M E 和P P D K 的表
达[34
]㊂在小麦中C 4特异性光合基因在小麦颖果的果皮组织中表达[
35
]㊂在大豆的叶片中检测到四种与C 4途径相关的酶的活性[36
]㊂与C 4光合
作用相关的许多基因(例如N A DM E ,P E P C ,
P P D K 和N A D P -M E )已成功转如C 3植物的基
因组中[30,37]
㊂将高粱的N A D P -M E 基因引入水
稻 N o n g
k e n 58中,从而使N A D P -M E 活性提高了1~7倍,并在高光强度下增加了光抑制作
用[38
]㊂前人将玉米(Z e a m a y
s L .)的P E P C 基因转到水稻基因组中,引起水稻叶片中气孔的密
度和面积增加以及干物质的积累增多[
39
]㊂在燕麦(A v e n a s a t i v a L i n n .)中过表达编码玉米P E P C 转运蛋白的基因时,其叶片观察到较大的束鞘细
胞,细胞壁脂质沉积增加的现象[40
]㊂在C 3植物
中引入C 4途径具有成功的实例,说明了这一方法的具有一定的可行性,因为要进行植物的同源转化,对于植物本身的技术研究水平还有一定的要求,并不适用于全部的C 3植物,这一方法具有一定的局限性㊂关于大莎草(E l e o c h a r i sv i v i p
a r a L i n k )C 4光合作用代谢通路最近鉴定出了包括5
个转录因子㊁4个受体样蛋白和1个B U R P 蛋白
共10个调节基因[4
1]
,为其他物种的高光效育种提供了切实的理论依据㊂C h e n [4
2]
等研究发现了C 3-C 4和C 4光合作用之间的主要转录差异,
这将为反向遗传学在高光效育种中研究提供潜在目标㊂1.2.3 其他途径
随着科研水平的不断提高,在高光效基因工程育种的途径中不断出现新技术和新观点㊂例如,人造叶绿体的成功构建带来了人工光合作用领域的里程碑式的进展:研究人员利用微流体体系模拟植物的叶绿体,即利用菠菜的类囊体薄膜实现光反应,并驱动合成酶循环过程,在细胞尺寸的油包水液滴中实现了C O 2固定和光合成反应[43
]㊂S o u t h [44]等人使用合成生物学的方法,重新设计光呼吸过程,使转基因烟草的植株生长量
㊃
43㊃
第3期
乌 兰,等:高光效基因工程育种研究进展及展望
较野生型烟草提高了40%㊂利用多基因组装和转化系统在水稻叶绿体中成功建立了新的光呼吸旁路,通过遗传工程手段在拟南芥㊁烟草和水稻中创建的由高温响应启动子驱动的细胞核融合基因表达的D 1蛋白合成途径,建立了植物细胞D 1蛋白合成的 双途径 机制(天然的叶绿体途径和创建的核途径)㊂通过新增的细胞核源D 1合成途径显著提高了拟南芥㊁烟草和水稻的高温抗性㊁光
合作用效率㊁二氧化碳同化速率和生物量[45
],为
水稻增产提供了新方式,也为其他物种的高光效育种提供了新思路㊂
2 油茶高光效基因工程育种进展及展望
油茶(C a m e l l i a o l e i f
e r a A b e l .)属山茶科(T h e a c e a e )山茶属(C a m e l l i a L .)植物,是我国特有的木本食用油料树种,与油橄榄㊁油棕㊁椰子并
称为世界四大木本油料植物[46]
,起源于中国并在南方18个省市均有分布[4
7]
㊂目前,我国约有油茶种植面积300万公顷,每年生产约26万吨山茶
油[
48
]㊂从油茶种子中提取的茶油是一种高质量的食用油,茶油富含多种植物化学物质
[46
],含有
90%左右的不饱和脂肪酸,
其中单不饱和脂肪酸超过80%[4
9]
㊂前人研究显示,食用茶油有益于健康,有助于降低血脂和预防心血管疾病[50
]㊁减轻乙醇对胃粘膜的损害[51
],减少体内脂肪积累和预防肝脂肪变性的功效[
52
]㊂油茶花芽发育周期长,从5月上旬花芽分化开始至10月中下旬开花,
历时5个多月[53
],次年3月到10月为果实生长期[
54
]㊂由此可以看出油茶从花芽分化到果实完全成熟共用18个月之久,花果共存的现象体现了油茶 抱子怀胎 的特性,表明油茶开花结实耗时长,对于营养物质的需求量是极其巨大的㊂前人研究发现,油茶光合特性表现为C O 2饱
和点较低㊁补偿点较高,光合效率不高等特
点[55
],其净光合速率日变化规律存在一致性,即
均为 双峰 曲线,存在明显的 光合午休 现象[56
],这些都佐证了油茶属于C 3植物这一结论㊂
中国对茶油的需求在不断增长,尤其对其产量和
品质追求日益提升[57]
㊂目前,C 3植物的高光效
基因工程育种工作的策略主要集中于操控光合反应过程,为了最小化光吸收期间的能量损失和加速碳固定而进行的对于R u b i s c o 的改造,引入C 4途径和人工开发新的合成途径这三大类㊂油茶高光效基因工程育种相关研究较少㊂关于油茶
R u b i s c o 的研究,仅分离获得了R u b i s c o 亚基
r b c L (1,522b p )和r b c S (1,425b p )的全长c D -N A ,研究表明C o -r b c L 的表达水平与种子产量和
油脂产量高度相关(P<0.001),C o -r b c S 的表达
与产量相关(P<0.01),C o -r b c S 和C o -r b c L 可能
是早期选择高油产量品种的分子标记[
58]
㊂油茶的遗传转化困难,本文综述其他物种高光效基因工程育种的成功实例,为选择油茶高光效相关基因应用于油茶高光效基因工程育种指明了方向㊂
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责任编辑 喻晓敏
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