2006锦鲤疱疹病毒病的研究进展_刘宗晓

１前言锦鲤疱疹病毒（ＫＨＶ），属于疱疹病毒科，是双链ＤＮＡ病毒，有囊膜，与其同科的ＣＨＶ、ＣＣＶ之间有免疫交叉反应［１］。

ＷａｌｔｚｅｋＴＢ等［２］通过比较疱疹病毒的主要囊膜蛋白基因、衣壳蛋白基因、ＤＮＡ聚合酶基因、螺旋酶基因４个基因，认为，ＫＨＶ与ｃａｒｐｐｏｘｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ（Ｃｙｐｒｉｎｉｄｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ１，ＣｙＨＶ－１）和ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃｎｅｃｒｏｓｉｓｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｏｆｇｏｌｄｆｉｓｈ（Ｃｙｐｒｉｎｉｄｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ２，ＣｙＨＶ－２）十分相近，而与ｃｈａｎｎｅｌｃａｔｆｉｓｈｖｉｒｕｓ（Ｉｃｔａｌｕｒｉｄｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ１，ＩｃＨＶ－１）也有在相近之处，因此建议将ＫＨＶ隶属于ＣｙＨＶ－３。

目前ＫＨＶ的主要囊膜蛋白基因、衣壳蛋白基因、ＤＮＡ聚合酶基因、螺旋酶基因、胸苷激酶基因及某些未知功能的蛋白基因的部分或完整的核苷酸序列已有报道，但关于ＫＨＶ的其他基因的研究未见报道，其完整的基因组序列及基因图谱还有待于进一步研究和完善。

ＫＨＶ的感染谱较小，仅感染锦鲤和鲤鱼；死亡率高达８０％￣１００％，且很快死亡；研究表明，该病毒的致病性具有水温依赖性，该病毒的最适生活温度为１８￣２７℃，其发病水温主要在２３￣２８℃之间；ＫＨＶ的潜伏期长，一般为１４天，甚至更长。

２国内外流行现状１９９８年在以色列的ＭａｇａｎＭｉｃｈａｅｌ地区的首次暴发锦鲤疱疹病毒病，但以色列官方宣称这次发作是来源于欧洲，也许是从英国非法进口的鱼及渔场设备所致。

在１９９８年夏至１９９９年春的发病导致渔场主损失肉用鲤鱼６００ｔ，出口损失近４００万美元，但直到１９９９年才确认ＫＨＶ为其真正的病原。

自１９９８年以来该病在英国、欧洲大陆、美国及以色列等国家和地区暴发流行。

日本也于２００３年１０月首次证实了该病的存在［４］。

自１９９８年以来，ＫＨＶ在英国每年夏天都要流行一次。

另外，１９９８年南非也有此病的报道。

２００１年４月在以色列的Ｈａｚｏｒｅａ地区再次暴发流行ＫＨＶ，且由于这次ＫＨＶ的暴发流行，ＫＨＶ被列入以色列水生动物疾病名录，作为以色列必须向官方报告的水生动物疾病。

但目前还不能明确判断ＫＨＶ的危害在生产实践中所占的地位。

随后该病在美国、德国、中国台湾均有报道，据分析该病的流行和蔓延主要通过外贸出口及观赏鱼类的交流所造成。

２００２年４月，广东省某养殖场进口的锦鲤（Ｃｙｐｒｉｎｕｓｃａｒｐｉｏ）出现了暴发性疾病，死亡率高达８０％以上，刘荭［５］等人用ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ证实了本次流行的主要病原可能是ＫＨＶ，同时伴有副溶血弧菌和嗜水气单胞菌的继发感染。

究其原因，ＫＨＶ可能是从进口的观赏锦鲤中传入我国的。

这提示，ＫＨＶ随着进口锦鲤进入我国的风险极大，并且有可能对我国养殖锦鲤及锦鲤出口贸易造成严重的影响。

３临床症状ＫＨＶ感染锦鲤后，临床症状主要表现为：停止游泳；鱼皮肤上出现苍白的块斑与水泡；鳃出血，产生大量的粘液或组织坏死；鳞片有血丝；鱼眼凹陷，类似寄生虫感染和细菌感染，出现症状后２４￣４８ｈ死亡；有些鱼表现神经症状，极小的刺激能引起较强烈的反应，然后是不活跃期［６］。

４诊断方法研究进展锦鲤疱疹病毒病的临床表现与许多普通的细菌感染和寄生虫侵袭相似，这些现象会掩盖病毒所致的危害。

不能单纯通过观察鱼的外部特征或临床表现来进行决定性的判断，因此，确诊还需必要的实验室诊断。

目前的诊断方法有细胞培养分离技术、电镜技术、ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、原位杂交技术及ＬＡＭＰ法等，聚合酶链式反应（ＰＣＲ）和细胞培养技术是ＯＩＥ推荐的诊断方法。

４．１常规的临床诊断如果出现下列情况，再结合临床特征，则可怀疑ＫＨＶ的感染：１）仅有鲤鱼（包括锦鲤）及其普通变种能被感染锦鲤疱疹病毒病的研究进展刘宗晓刘荭江育林（华中农业大学水产学院，湖北武汉，４３００７０）（深圳出入境检验检疫局动植中心，广东深圳，５１８００１）作者简介：刘荭（１９７１－），女，毕业于华中农业大学，博士，高级兽医师，已发表文章４０多篇。

致死。

其他种类如金鱼和草鱼在同一系统中，甚至可与锦鲤保持长期接触而不被感染，这一特点可有助于ＫＨＶ的诊断。

２）水温在１８￣３０℃间有大量死亡，水温升高或降低，死亡率下降或停止。

３）死亡极快，一条健康鱼从病到死只有２４￣４８ｈ。

４）死亡率极高，如果疾病暴发１０天内死亡率可达８０％￣１００％。

这些常规的诊断只能作为一种有意义的参考，确诊还要依靠灵敏特异的诊断方法。

４．２细胞培养分离技术细胞培养分离技术是最准确的诊断方法，是ＯＩＥ推荐的首选方法。

但研究发现，ＫＨＶ非常特殊，只能在源自原始宿主细胞中生长，即只能在锦鲤鳍细胞中生长，病毒接种这种细胞后，可观察到特征性的细胞病变。

Ｃａｌｌｅ等［７］报道，常用的鱼类细胞系都难以分离到ＫＨＶ，刘荭等也证实了ＫＨＶ不可能在ＣＯ、ＣＫ和ＥＰＣ等３种鱼类细胞上复制。

最近，美国的研究者已经建立起锦鲤鳍原代细胞系，可用以分离ＫＨＶ。

英国的研究者们也正在紧张地进行ＫＨＶ敏感细胞系的建立。

因此尽早建立对ＫＨＶ敏感的细胞系，并研究该细胞系的生物学特性，从而更有效的诊断和控制ＫＨＶ的流行。

４．３分子生物学诊断方法４．３．１ＰＣＲ法ＰＣＲ是目前较为精确检测ＫＨＶ感染的方法。

在过去的几年里，运用ＰＣＲ方法确定了ＫＨＶ的阳性病例，其中英国至少有１６例、德国４５例、荷兰１例、美国２例，而以色列报道的病例也应用此技术。

Ｇｉｌａｄ等用ＫＨＶ的１个保守片段，建立了可用来区别ＫＨＶ和鲤鱼疱疹病毒（ＨｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｃｙｐｒｉｎｉＣＨＶ）和叉尾鱼回病毒（Ｃｈａｎｎｅｌｃａｔｆｉｓｈｖｉｒｕｓ，ＣＣＶ）的ＰＣＲ方法。

ＩｓｈｉｏｋａＴ等［８］运用ＰＣＲ技术对２００４年发生于日本的４３份ＫＨＶ可疑病例进行了分子流行病学调查，他们根据ＫＨＶ的ＤＮＡ聚合酶基因和主要囊膜蛋白基因的核苷酸序列设计引物，进行ＰＣＲ扩增，结果表明，检测阳性率为８６％（３７／４３），且两个基因的最小检测量分别为１００ｆｇ和１０００ｆｇ，这说明以主要囊膜蛋白基因为模板检测ＫＨＶ更加灵敏。

另外基因进化分析表明，日本的流行株和其他国家的毒株在基因进化上有很近。

ＢｅｒｃｏｖｉｅｒＨ等［９］基于ＫＨＶ的胸苷激酶基因建立了ＰＣＲ方法，研究表明，该方法能够区分ＫＨＶ与Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｃｙｐｒｉｎｉ（ＣＨＶ）ａｎｄｔｈｅｃｈａｎｎｅｌｃａｔｆｉｓｈｖｉｒｕｓ（ＣＣＶ），且较为敏感，最小检测线为１０ｆｇ，这与ＩｓｈｉｏｋａＴ等报道的不一致，可能与基于不同的基因所造成的。

刘荭等建立了ｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ，并初步证实了２００２年发生于广东省某养殖场进口的锦鲤（Ｃｙｐｒｉｎｕｓｃａｒｐｉｏ）出现了暴发性疾病的病原为ＫＨＶ，从而说明通过进出口贸易及进口观赏锦鲤引进ＫＨＶ的极大风险，为我国有效预防和控制该病在我国的流行提供了技术支持。

乌日琴等［１０］通过对从组织中提取ＫＨＶＤＮＡ的方法和ＰＣＲ引物的探讨，建立了快速、灵敏和操作简便的ＫＨＶ的ＰＣＲ检测方法，并提高检测的准确率和简化操作程序。

但目前，检测ＫＨＶ的ＰＣＲ并没有预期的精确，该方法只能在已经表现出了疾病临床症状的鱼体内检测出ＫＨＶ，即只能从深度感染并表现出临床症状的鱼中检出，对看似健康的鱼却无法确定是否有病毒存在，也就是无法检测潜在的病毒，而且很有可能出现假阳性或假阴性。

因此进一步研究灵敏、特异、能检出潜在病毒感染的检测技术，是当务之急，势在必行。

４．３．２ＬＡＭＰ法ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－ＭｅｄｉａｔｅｄＩｓｏｔｈｅｒｍａｌＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法是一种新式恒温核酸扩增方法，采用能特异识别靶序列上６个位点的４条引物及一种具有链置换活性的ＤＮＡ聚合酶在６５℃左右进行核酸的指数级扩增，其扩增效率可达到１０－９￣１０－１０个拷贝数量级。

在扩增反应中产生茎环结构，保证引物与其杂交启动新一轮核酸合成，反应副产物焦磷酸镁沉淀可用肉眼观测到，或加入ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ，根据颜色由黄到绿的变化，来判断是否发生扩增。

该扩增法具有简便、快速、准确、廉价、易检测等特点。

ＧｕｎｉｍａｌａｄｅｖｉＩ等［１１］基于胸苷激酶（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ，ＴＫ）基因设计引物，建立了快速检测ＫＨＶ的ＬＡＭＰ法，其灵敏度与ＰＣＲ法相当。

ＳｏｌｉｍａｎＨ等［１２］设计３对引物建立了快速、灵敏、廉价的检测ＫＨＶ的ＬＡＭＰ法，该方法可在９０ｍｉｎ内判定结果，并在产物中加入ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ，根据其颜色的变化来判定，从而更加直观。

另外该方法不需要特殊的仪器设备，适合现场诊断。

因此ＬＡＭＰ法表现出了良好的应用前景。

除了上述方法外还有ＥＬＩＳＡ方法、电镜技术及原位杂交技术等。

ＥＬＩＳＡ方法检测ＫＨＶ的背景值高，与ＣＣＶ和ＣＨＶ之间具有较高的交叉免疫反应。

另外，鱼类的血清抗体水平较低，不易检出，因此，ＥＬＩＳＡ的应用受到了一定的限制。

电镜技术及原位杂交技术等需要昂贵的仪器设备，不适宜推广应用。

因此，要进一步研究更加敏感、特异、易于基层推广应用的诊断方法，为更好的确诊和控制ＫＨＶ在全球的暴发流行提供技术手段，从而减少经济损失。

５综合防制措施防制病毒性传染病的有效方法是疫苗免疫，但目前尚无有效的ＫＨＶ疫苗，因此对该病的防制应采用综合防制措施加以控制和消灭。

５．１免疫预防ＰｅｒｅｌｂｅｒｇＡ等［１３］认为可以通过变温的方法或在细胞上连续传代获得不致病的突变株，作为疫苗株免疫锦鲤，但有效的ＫＨＶ疫苗还有待于进一步研究。

有很多方法可以启动锦鲤对ＫＨＶ的免疫应答，如将感染鱼饲养于２０℃￣２８℃间一段时期，然后降低或升高温度使病毒失活，类似于疫苗免疫，从而使机体获得免疫力，达到免疫的目的。

另外，可以通过基因工程的方法缺失或突变毒力基因，获得基因工程疫苗，还可以将ＫＨＶ保护性抗原重组于嗜单胞菌中，构建基因工程活载体疫苗。

５．２综合防制措施在目前缺乏有效的疫苗之前，采用积极有效的综合防制措施是必要的，如加强饲养管理，提高机体的免疫力；建立和健全疫情上报制度；加强口岸检疫，不从疫区引种等。

５．２．１加强饲养管理要采取以防为主的措施。

包括：控制和消灭病原体，切断传播途径；改善和优化养殖环境；提高养殖种群和养殖群体的免疫力等全面综合预防措施，防止病毒病的发生。

５．２．２建立隔离制度一旦发生传染性疾病，首先必须采取严格的隔离措施，以免疫情传播蔓延。

实施隔离，即对已发病的池塘或地区首先进行封锁，对池内的养殖动物不向其它池塘和地区转移，不排放池水。

工具未经消毒不在其它池使用。

与此同时，饲养人员要勤于清除发病死亡尸体，及时掩埋、销毁。

对发病鱼类及时做出诊断，确立对策指导疾病防治和控制疫情流行。

５．２．３加强口岸检疫，不从疫区引进苗种通过贸易进口和观赏鱼的交流可将ＫＨＶ传入我国，因此，要加强进出口口岸检疫，增强ＫＨＶ的防范意识，不从疫区引进苗种。