多重PCR方法检测锦鲤疱疹病毒基因
一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定
一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定朱霞;李新伟;王好;吕文亮;周井祥【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2011(033)005【摘要】本实验对患病鲤鱼进行病毒分离及鉴定,将表现典型锦锂疱疹病毒(KHV)病症状的鲤鱼肾细胞与单层框镜鲤鱼鳍细胞(KFC)共培养,5d～6d后出现典型的KHV细胞病变,即细胞体积增大并出现空泡化;在电镜下观察到典型的KHV病毒粒子;并应用PCR方法扩增获得KHV ORF25基因的849bp基因片段,连接至pMD18-T载体中,经酶切鉴定后序列分析表明,与GenBank登录的3株KHV同源性均为99.9%,命名为KHV-cj.基因进化比较显示,与KHV-J株关系较近.将病毒培养物(10-6.75TCID50)腹腔注射接种实验鱼可使其100%发病,并且症状和病理变化与自然感染KHV的鱼一致,死亡率为75%.表明本研究在国内首次分离到KHV.%A Koi herpesvirus (KHV) was isolated from carp suffering gill necrosis by co-cultivation of the affceted kidney cells with carp fin cells (CFC).Cytopathic effects (CPE) were presented 5 days to 6 days post co-cultivation.The KHV particles were observed under electron microscope by negatively stained the sediment of virus culture with 0.5％ phosphotungstate.A 849 bp DNA fragment of ORF25 gene was amplified by PCR and sequencing result indicated that the sequence of nucleotide acid homology was 99.9％ with the reference strains of KHV in GenBank.The some clinic signs as nature infection were presented in fish artificially infected with 10-6.75 TCID50 by intraperitoneal injection and the morbility and mortality were 100％ and75％,respectively.This result demonstrated that the KHV was isolated for the first time from the naturally infected fish in China.【总页数】4页(P340-343)【作者】朱霞;李新伟;王好;吕文亮;周井祥【作者单位】吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室,吉林,长春,130118;吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室,吉林,长春,130118;吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室,吉林,长春,130118;吉林农业大学动物生产及产品质量安全教育部重点实验室,吉林,长春,130118;吉林农业大学动物科技学院,吉林,长春,130118【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.四川地区一株锦鲤疱疹病毒的分离鉴定及系统进化分析 [J], 陈俊杰;李媛瑗;阳瑞雪;汪开毓;耿毅;黄小丽;陈德芳;欧阳萍2.锦鲤疱疹病毒天津株的分离与鉴定 [J], 罗璋;郝爽;张振国;孟一耕;史谢尧;冯守明3.锦鲤疱疹病毒GZ1301株的分离与鉴定 [J], 李莹莹;王庆;曾伟伟;潘厚军;王英英;刘春;梁红茹;石存斌;吴淑勤4.东北红豆杉一株产三尖杉宁碱内生真菌Xylaria Primorskensis Y32的分离与鉴定 [J], 张智慧;郑文艺;崔海超;罗朝辉;袁肖寒;顾成波5.一株猪繁殖与呼吸综合征病毒高致病株的分离与鉴定 [J], 芮雪;申贞彦;贺晓霜;张永红;宋勤叶;周双海因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因
PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因乌日琴;刘中勇;黄宝春【期刊名称】《检验检疫学刊》【年(卷),期】2005(015)002【摘要】[目的] 建立锦鲤疱疹病毒的PCR检测方法,并提高检测的准确率和简化操作程序.[方法] 分别利用蛋白酶K-酚/氯仿抽提、异硫氰酸胍(GuScN)抽提法从组织样品中提取KHV病毒DNA,并设计两对特异性引物进行PCR检测.[结果] 异硫氰酸胍抽提法可以有效地去除样品中的影响因素,而蛋白酶K-酚/氯仿抽提法提取的DNA中不能检测到病毒的DNA片段.同时评价了两对特异性引物,选择灵敏性高和操作简便的引物PQDS和PQDV作为快速检测的引物.[结论] 本实验初步建立了快速、灵敏和操作简便的KHV病毒的PCR检测方法.【总页数】3页(P6-8)【作者】乌日琴;刘中勇;黄宝春【作者单位】广州白云机场出入境检验检疫局;广东出入境检验检疫局;广州白云机场出入境检验检疫局【正文语种】中文【中图分类】S9【相关文献】1.多重PCR方法快速检测牛乳中金黄色葡萄球菌及其肠毒素基因型 [J], 李荔枝;张军;胡萍;周国君;王晓静;朱建荣2.快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌mecA基因的PCR方法学评价 [J], 陈宇明;胡婷婷;倪洁;王蓓;蒋晓飞;关明;徐峰;刘维薇3.快速检测肺炎链球菌recA、ply及16S rRNA基因的多重降落PCR方法建立及应用 [J], 侯艳娇;罗欲承;邵晨;倪颖;邵世和4.多重PCR方法检测锦鲤疱疹病毒基因 [J], 乌日琴;陈芳;张艺宜;刘芸莉;刘中勇;林志雄5.利用PCR方法检测锦鲤疱疹病毒3个主要靶基因 [J], 孟庆峰;张琼;宋战昀;肖成蕊;刘阳;蔡阳;张艳;钱爱东;王伟利因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
鲤疱疹病毒3型研究进展
鲤疱疹病毒3型研究进展
张瑞雪;周井祥;王好;袁海延
【期刊名称】《科学养鱼》
【年(卷),期】2016(0)6
【摘要】鲤鱼是人类最廉价的优质蛋白获取源之一,提升鲤鱼产量可以在一定程度上解决全球粮食问题。
锦鲤色彩艳丽、身姿矫健,是观赏鱼中的佼佼者,备受世界宠物爱好者的喜爱。
锦鲤疱疹病毒病（Koi herpesvirus disease,KHVD）是会使鲤鱼、锦鲤及其变种大量死亡的疾病,大面积暴发该病时死亡率为80%~100%,因其较高的发病率和死亡率广受世界关注。
一、病原体锦鲤疱疹病毒（koi herpesvirus,KHV）又称为鲤科疱疹病毒3型（Cy HV-3）,是KHVD的致病源。
【总页数】3页(P54-56)
【作者】张瑞雪;周井祥;王好;袁海延
【作者单位】吉林农业大学,吉林长春130118;吉林农业大学,吉林长春130118;吉林农业大学,吉林长春130118;吉林农业大学,吉林长春130118
【正文语种】中文
【相关文献】
1.鲤疱疹病毒2型研究进展 [J], 袁锐;陈静;刘训猛;吴亚锋;王晶晶;方苹
2.鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF4蛋白在杆状病毒表达系统中的表达及其免疫原性分析 [J], 孟少东;姜新宇;葛恒;胡光耀;杨大佐;张家林;李强
3.鲤疱疹病毒2型和3型三重PCR检测方法的建立与应用 [J], 彭军辉;安伟;张明辉
4.鲤疱疹病毒Ⅱ型检测技术的研究进展 [J], 郭宝琴;魏畅;李强
5.鲤疱疹病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型研究进展 [J], 罗丹;梁利国;谢骏;吴旭东
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鲤疱疹病毒Ⅰ型(CyHV-1)核酸检测试剂盒(恒温荧光法)
广州华南生物工程有限公司
Guangzhou South China Bioengineering Co., Ltd
鲤疱疹病毒Ⅰ型（CyHV-1）核酸检测试剂盒（恒温荧光法）
鲤疱疹病毒Ⅰ型（CyHV-1）核酸检测试剂盒（恒温荧光法）是广州华南生物工程有限公司研发的一种高度灵敏的检测试剂，适用于检测水生生物中的鲤疱疹病毒。
该试剂盒采用了恒温荧光法技术，可以在短时间内快速准确地检测出病毒核酸，从而为鱼类疾病的早期诊断提供了强有力的支持。
鲤疱疹病毒Ⅰ型（CyHV-1）核酸检测试剂盒的主要特点是高灵敏度、高特异性、操作简便、快速准确。
其检测下限可达到100基因拷贝/μl，可以有效地检测出病毒核酸的存在。
同时，该试剂盒采用了恒温荧光法技术，避免了传统PCR方法中需要多次温度变化和时间较长的缺点，从而提高了检测效率。
此外，该试剂盒还具有高特异性，可以准确地检测出鲤疱疹病毒Ⅰ型，不会出现假阳性或交叉反应。
使用鲤疱疹病毒Ⅰ型（CyHV-1）核酸检测试剂盒进行检测时，需要准备样品、试剂盒、PCR仪、离心机等设备。
首先需要将样品进行处理，提取出其中的病毒核酸。
然后将核酸与试剂盒中的引物和探针进行反应，通过PCR扩增技术使病毒核酸得到大量复制。
最后通过荧光检测技术检测出是否存在鲤疱疹病毒Ⅰ型。
整个过程仅需数小时，大大缩短了检测时间。
总之，鲤疱疹病毒Ⅰ型（CyHV-1）核酸检测试剂盒（恒温荧光法）是一种高度灵敏、快速准确的检测试剂，适用于鱼类疾病的早期诊断和治疗。
它的出现为水生生物的健康和养殖业的可持续发展提供了有力保障。
如果在使用过程中遇到问题，请与广州华南生物工程有限公司技术人员联系。
一种鲤科疱疹病毒Ⅱ型的PCR快速检测方法
一种鲤科疱疹病毒Ⅱ型的PCR快速检测方法薛中仪;朱春艳;王瑶;吴霆【摘要】鲤科疱疹病毒Ⅱ型是异育银鲫重大疫病病原,该病毒引发的异育银鲫鳃出血病(大红鳃病)能导致养殖生产巨大经济损失,为满足水产疫病预防与诊断需求,本文建立了一种集DNA快速提取与PCR快速扩增为一体的分子生物学检测方法,旨在为基层水产一线水生动物疫病预防与控制提供一种快速检测方法.【期刊名称】《水产养殖》【年(卷),期】2015(036)007【总页数】4页(P45-48)【关键词】异育银鲫;疱疹病毒;鳃出血病;PCR快速检测【作者】薛中仪;朱春艳;王瑶;吴霆【作者单位】宝应县水生动物疫病预防控制中心,江苏宝应 225800;宝应县水生动物疫病预防控制中心,江苏宝应 225800;宝应县水生动物疫病预防控制中心,江苏宝应 225800;宝应县水生动物疫病预防控制中心,江苏宝应 225800【正文语种】中文【中图分类】S943一种鲤科疱疹病毒II型的PCR快速检测方法薛中仪，朱春艳，王瑶，吴霆（宝应县水生动物疫病预防控制中心，江苏宝应225800）摘要：鲤科疱疹病毒Ⅱ型是异育银鲫重大疫病病原，该病毒引发的异育银鲫鳃出血病（大红鳃病）能导致养殖生产巨大经济损失，为满足水产疫病预防与诊断需求，本文建立了一种集DNA快速提取与PCR快速扩增为一体的分子生物学检测方法，旨在为基层水产一线水生动物疫病预防与控制提供一种快速检测方法。
关键词：异育银鲫；疱疹病毒；鳃出血病；PCR快速检测中图分类号：S943文献标志码：A文章编号：1004-2091（2015）07-0045-04doi：10.3969/j.issn.1004-2091.2015.07.010资助项目：江苏省水产病害测报项目（2015）；国家大宗淡水鱼产业技术体系建设（CARS-46-31）作者简介：薛中仪（1987-），女，助理工程师，在读在职研究生，研究方向：水产养殖与病害防控. E-mail：***************，通信作者：吴霆（1975-），男，高级工程师. E-mail：****************1 前言鲤科疱疹病毒II型（CyHV-2）是水生动物疫病的重要病原，传统宿主是金鱼，Jung等[1]于1995年首次报道了CyHV-2，该病毒引起的病害给日本金鱼养殖业造成了巨大的经济损失，根据其病理学特征而被命名为疱疹病毒性造血器官坏死病毒。
锦鲤疱疹病毒病的流行特点、诊断及防治的研究进展
验及消杀处理，不可擅自用药[21]或转移运输。对病
毒进行攻毒，发现胆汁酸不仅能促进其生长，还
鱼的来源和销售情况进行溯源跟踪，开展流行病
能提高异育银鲫的抗病能力。随着研究的逐渐深
学调查，及早发现并切断传播路径，降低损失。
入，相信在不久的将来会有针对疱疹病毒病的抗
4.2
穿心莲的饲料的异育银鲫死亡率仅为 15%；何杰
毒饲料问世。
3.2
无害化处理
捞出死鱼和病危鱼，用生石灰处理后深埋。
4.3
加强养殖人员培训
目前，我国水产养殖行业多以家庭作坊式小
隔离消毒
锦鲤疱疹病毒还可存在于病鱼的分泌物中在
规模饲养为主，存在文化水平不高、饲养随意、
水中传播[22]，应注意对染病鱼池的隔离，不得将水外
对设施设备的投入较低等特点，很多养殖户在养
国是渔业大国，据 2020 年中国渔业统计年鉴数据
检测鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒的三重 PCR 检测
2019 年全国淡水养殖总产量的 9.6%，因此对锦鲤
便捷地对该疫病进行确诊。
显示，2019 年我国鲤鱼养殖总产量约 289 万 t，占
方法，相信随着检测技术的进步，可以更快速、更
疱疹病毒病的防治研究非常重要，本文对目前研究
Abstract: Koi herpesvirus disease is an epidemic disease that is easy to invade Cyprinidae fish. It has the
characteristics of strong infectivity, rapid onset and high mortality. It was first found in the 1990s. At present, it has
利用PCR方法检测锦鲤疱疹病毒3个主要靶基因
利用PCR方法检测锦鲤疱疹病毒3个主要靶基因孟庆峰;张琼;宋战昀;肖成蕊;刘阳;蔡阳;张艳;钱爱东;王伟利【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2011(033)004【摘要】为建立锦鲤疱疹病毒(KHV)多靶基因PCR检测方法,本实验将KHV接种鲤鱼鳍条细胞,收获病变细胞悬液,提取DNA,根据GenBank中登录的KHV基因序列及出入境检验检疫行业标准推荐的基因(ORF7),设计合成3对特异性引物,针对胸苷激酶基因(TK)、聚合酶基因(Sph)和ORF7基因进行PCR检测.通过优化后的反应体系进行特异性、敏感性试验和样品检测.结果表明:3对引物能够分别特异性扩增出409bp、292 bp和484bp片段;敏感性试验表明对TK基因检测的敏感性高于Sph和ORF7基因,其最低检测量为1.9×106copies/μL;采用优化的3个PCR方法对8个有临床症状的样品进行检测,其中3份样品的3个基因PCR扩增结果均为阳性.因此,本研究选取的3个基因均可用于KHV的检测及确证实验.%To exploratory the feasibility of multiple gene detection of koi herpesvirus (KHV) by PCR, the PCR detections were conducted to amplify the TK and Sph genes of KHV to comparing with the amplification of ORF7 which was recommended by inspection and quarantine standard for KHV detection. The three genes were amplified with the spcefic primers and the the template DNA of virus extracted from the KHV infected KF cells. The results showed that the fragments of 409 bp (TK), 292 bp (Sph), and 484 bp (ORF7) could be specifically amplified with a detection limit at 1.9×l06 copies/μLof KHV. It was evident that the all of these gene could be used to detection of KHV.【总页数】4页(P316-318,330)【作者】孟庆峰;张琼;宋战昀;肖成蕊;刘阳;蔡阳;张艳;钱爱东;王伟利【作者单位】吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062;辽宁出入境检验检疫局,辽宁大连116001;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062;吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118;吉林农业大学动物科技学院,吉林长春130118;吉林出入境检验检疫局,吉林长春130062【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.利用多重PCR方法检测7种转基因卡诺拉油菜籽品种(系)研究 [J], 张耀川;许亮;张洁;田锦;李玉舒;石进朝2.PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因 [J], 乌日琴;刘中勇;黄宝春3.多重PCR方法检测锦鲤疱疹病毒基因 [J], 乌日琴;陈芳;张艺宜;刘芸莉;刘中勇;林志雄4.利用PCR方法检测转基因大豆加工食品中的修饰基因 [J], 邓鸿铃5.PCR方法检测食品中致病菌常用的靶基因及其引物 [J], 段莹;陶景玉;卢行安;陈明生;崔秀云因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
TaqMan荧光定量PCR快速检测锦鲤疱疹病毒方法的建立与应用
TaqMan荧光定量PCR快速检测锦鲤疱疹病毒方法的建立与应用摘要：本研究采用一步DNA提取法快速提取锦鲤组织样品中的DNA，利用针对锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）TK基因保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，经反应体系优化，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过对荧光信号的实时监测实现对KHV的定量检测。
整个过程快速、简捷，操作简单，可对KHV进行快速有效的诊断，具有一定的应用价值。
关键词：锦鲤疱疹病毒；荧光定量PCR；TaqMan；一步法中图分类号：S941.41+9文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）07-0125-04锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）引起的一种传染性疾病。
KHV能够感染锦鲤、鲤鱼和剃刀鱼，其鱼苗、幼鱼、成鱼均可感染。
锦鲤疱疹病毒病多发于春、秋季，潜伏期两周左右，鱼发病并出现症状24～48 h后开始死亡，2～4 d内死亡率可迅速达到80%～100%[1，2]。
此病首先在以色列暴发，接着美国、欧洲（如英国、德国、比利时）及亚洲一些国家均有此病发生，给锦鲤和鲤鱼养殖业造成重大经济损失[3，4]。
锦鲤疱疹病毒颗粒呈球状，有囊膜，直径约170～230 nm，其核衣壳为对称十面体，直径为100～110 nm，该病毒由31种病毒多肽组成，遗传物质为双链DNA，基因组大小约为277 kb[5，6]。
目前锦鲤疱疹病毒病的检测方法有电镜检测、ELISA、普通PCR和荧光定量PCR等[7]。
TaqMan荧光定量PCR是在PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一种特异性荧光探针，该探针为一段寡聚核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′→3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步[8～11]。
锦鲤疱疹病毒的鉴定及预防思考
２ 锦 鲤疱疹病 毒思考
研 究 建 立适 宜于 锦 鲤养 殖 场 新 进 厂 区 苗种 、亲 鱼 、
１ 病毒效价测定及动物感染试 验
１ ． １ 毒价 测定 把病毒液进行稀释 ，稀释量为 １ ０ 倍之上，将其分别 接 种入 ９ ６ 孔 板下 进 行培 养 ，获得 锦 鲤 单层 细胞 ，每 个 稀 释度再进行 ８ 孔重复。放置在 ２ ２ ℃下进行培养，安置上 阳性 对 照孔 ， 对没 有稀 释 的细胞 毒 以及 阴性对 照孔 分析 ， 记录下 Ｃ Ｐ Ｅ ，再使用 Ｋ ａ ｒ ｂ ｅ ｒ 法计算出 Ｔ Ｃ Ｉ Ｄ ５ ０效价 。 １ ． ２ 动物 感 染试 使 用 的是 体 积较 轻 的健 康 锦鲤 作 为 实 验 对 象 ，数 量 为３ ０ 条 ，在 实 验 室 里观 察 了 ２ ８ ｄ ，没 有发 现 任 何 病症 。
死亡率较高。从 ２ ０ ０ ３ 年 以来，我国东北地 区的普通锦鲤
感染病毒的概率越来越 高，死亡率高达 ９ ０ ％。进行 Ｐ Ｃ Ｒ 检 测发 现 Ｋ Ｈ Ｖ 呈 阳性 。Ｋ Ｈ Ｖ Ｄ病 毒在 我 国锦鲤 和 匡锐 鲫 蔓 延较 为严 重 ，导致 我 国经济 损失 。
开 启病毒毒价测定，经过检测发现，ｍ ｔ ｖ ｅ ｊ 第 ２代 细胞培养物 Ｔ Ｃ Ｉ Ｄ 效价 为 １ ０ 。当 锦鲤 感 染 上 病 毒 之后 ， 鱼 活 动 减 少 ，表 现 为 反 应迟 钝 ，食欲 不 振 ，鱼 表 面 皮 肤 泛 白， 有斑 点 。体表 黏 液 分 泌 量 增 多 ，有 些病 鱼 腹 部 底 部 有 出现 迹 象 。随 着 时 间推 移 ， 白色 斑 点 增 多 。随 着 感 染 时间增 加到 ８ ｄ开始死 亡。实验发现 ，当感染病 毒在 ３ ０ ｄ内， 发病率达 １ ０ ０ ％。而 ，对照 鱼 组 没有 任 何 变化 。 进行 Ｐ Ｃ Ｒ鉴 定 发 现 ，取 出 了临床 症 状实 验 鱼之 后 ，锦 鲤 肾脏 组 织 被 病 毒 破坏 ，Ｐ Ｃ Ｒ扩 展增 大 ，而 ８ ４ ９ ｂ ｐ特 异 性 目的片段增多。在病毒感染到 ３ ｄ 之后，实验鱼 的鳃薄片 急速减少，炎症扩散，扩散到整个鱼体周边，整条鱼的 血 管充 满血 。
鲤疱疹病毒3型ORF136基因编码蛋白多克隆抗体的制备与鉴定
鲤疱疹病毒3型ORF136基因编码蛋白多克隆抗体的制备与鉴定郑树城;李莹莹;王庆;曾伟伟;王英英;任燕;石存斌【期刊名称】《中国水产科学》【年(卷),期】2018(025)001【摘要】为了对鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3, CyHV-3)ORF136基因编码蛋白进行功能研究和血清学诊断,本实验通过对ORF136基因推导的第31~157位氨基酸序列进行PCR扩增,并与原核载体pET-32a(+)连接,转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态后进行IPTG诱导表达,将纯化后的重组蛋白免疫新西兰白兔(Oryctolagus cuniculus)以制备ORF136多克隆抗体, 运用Western blot和间接免疫荧光技术对抗体进行鉴定.结果表明, 重组融合表达蛋白大小与预期一致, 约为35 kD, 且主要分布在包涵体中.Western blot分析显示, 免疫兔后获得的纯化ORF136多克隆抗体能特异性识别纯化的CyHV-3和感染CyHV-3的KS细胞; 间接免疫荧光分析进一步表明ORF136多抗能识别感染CyHV-3的KS细胞.ORF136多克隆抗体的制备为ORF136蛋白功能研究和CyHV-3血清学诊断方法的建立提供了重要基础.%Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3), also known as koi herpesvirus (KHV), is the etiologic agent of koi herpesvirusdisease(KHVD)causing morbidity and mortality in common carp and koi Cyprinus car-pio L.populations around the world.Recently,knowledge about diagnosis and detection based on nucleic acid has been reported, but validation of serological techniques for virus infection is limited due to lack of effective anti-bodies. Additionally, fundamental research on thefunction of structural proteins from CyHV-3 is necessary to understand the relationship between host and virus. ORF136 is one of the predicted envelope proteins incorporated into mature virions. To study the function of proteins encoded by the ORF136 gene of CyHV-3 and to establish serological methods for detection of CyHV-3, the predicted antigenic determinant based on amino acid sequences of proteins encoded by ORF136 was amplified using PCR. Then, the recombinant prokaryotic expression vector was constructed by connecting the cloned fragment to prokaryotic expression vector pET-32a (+), used for trans-formation of E.coli Rosetta (DE3) and protein expressions induced by IPTG. New Zealand white rabbits were immunized with the recombinant proteins of pET-32a-ORF136 four times. Furthermore, the antiserums were col-lected and affinity purification was used to obtain polyclonal antibody after 66 days. Characterization of the poly-clonal antibody against the ORF136 protein was further analyzed using western blot and indirect immunofluores-cence assays. The expected product size of 381 bp was obtained and the recombinant prokaryotic expression vec-tor pET-32a-ORF136 was confirmed to be constructed as expected using enzyme digestion. As SDS-PAGE analy-sis indicated that the molecular weight of recombinant protein pET-32a-ORF136 was consistent with the expected size (about 35 kD) and was distributed in the inclusions. Western blot analysis further showed that the purified polyclonal antibody could specifically recognize purified CyHV-3 virions and KS cells infected with CyHV-3. Moreover, immunofluorescence staining showed that specifically green fluorescencewas present in the cytoplasm of KS cells infected with CyHV-3, but not in the negative control, further suggesting that CyHV-3 was recognized by the polyclonal antibody. The purified recombinant proteins and effective antibodies are necessary to develop serological methods to detect antigens, except nucleic acid detection method. The purified recombinant proteins could be used as antigens to capture antibodies against CyHV-3 from common carp or koi exposed to KHVD. Similarly, development of a double antibody sandwich ELISA for detection of CyHV-3 also requires an effective polyclonal antibody to capture antigens released from the host. Antibodies produced by recombinant proteins from rabbit or mouse provides the foundation for functional research into structural and nonstructural proteins. In this study, the polyclonal antibody against the ORF136 protein was prepared and analyzed using immunoblotting and immunofluorescence techniques, which provides an essential and valid tool for further research into CyHV-3.【总页数】7页(P204-210)【作者】郑树城;李莹莹;王庆;曾伟伟;王英英;任燕;石存斌【作者单位】中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部渔药创制重点实验室,广东省水产动物免疫技术重点实验室,广东广州510380;上海海洋大学水产与生命学院,上海201306;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部渔药创制重点实验室,广东省水产动物免疫技术重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部渔药创制重点实验室,广东省水产动物免疫技术重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部渔药创制重点实验室,广东省水产动物免疫技术重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部渔药创制重点实验室,广东省水产动物免疫技术重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部渔药创制重点实验室,广东省水产动物免疫技术重点实验室,广东广州510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,农业部渔药创制重点实验室,广东省水产动物免疫技术重点实验室,广东广州510380【正文语种】中文【中图分类】S941【相关文献】1.家蝇u93基因编码蛋白多克隆抗体的制备与鉴定 [J], 马素贞;王涛;龙慧玲;国果;杨阳;常振策;王兵;吴建伟2.鲤疱疹病毒Ⅱ型ORF25截短蛋白的多克隆抗体制备与免疫原性分析 [J], 周勇;史玉恒;范玉顶;刘文枝;江南;赵建青;许晨;曾令兵3.Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF121蛋白的多克隆抗体制备及鉴定 [J], 余琳;吕利群;王浩4.家蝇 u93 基因编码蛋白多克隆抗体的制备与鉴定 [J], 马素贞; 王涛; 龙慧玲; 国果; 杨阳; 常振策; 王兵; 吴建伟5.Ⅱ型鲤疱疹病毒ORF6多克隆抗体的制备与鉴定 [J], 南星羽;冯梓钊;费越越;余路;罗扬;许丹因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
应用聚合酶链式反应(PCR)检测锦鲤疱疹病毒
戊 醇 等 购 自长 春 鼎 国生 物 技 术 有 限公 司 。
１ ３ 特 异 性 引 物 ．
由 上海 生 工 生 物 工 程 技 术 服 务 有 限 公 司 合
成。
１４ Ｐ ． ＣＲ试 剂
用设 计好 的锦 鲤疱 疹 病 毒 特 异性 引 物 进 行 Ｐ Ｒ Ｃ
反 应 ， 时 设 立 阴 性 对 照 （ ｕｆｒ 。通 过 ｌ 同 ＴＥ ｂ ｆ ） ｅ
引物 进 行 Ｐ Ｒ 反 应 ， 时 设 立 阴 性 对 照 （ Ｅ ｂ ｆ ｒ 。 通 过 １ 琼 脂 耱凝 胶 进 行 鉴 定 。 阴 性 对 照 比 较 。 Ｃ 同 Ｔ ｕｆ ） ｅ 与 在
４ ４ ｐ处 出 现特 异 性 目的 条 带 。经 序 列测 定 。 得 Ｐ Ｒ产 物 的基 因序 列 与 Ｎ Ｂ 上 锦 鲤 疱疹 病 毒 的 同源 率达 ８ｂ 所 Ｃ Ｃ Ｉ
闫 春梅 ， 雅 斌 ， 伟 ， 占 山 ， 家松 张 郑 熊 张
（ 林 省 水产 科 学 研 究 院 。 林 长春 １ ０ ３ ） 吉 吉 ３ ０ ３
摘 要 ： 为建 立 并优 化锦 鲤 疱 疹病 毒 检 测 方 法 ， 对 目前 国 内集 约 化 养 殖 鲤 鱼 大 面 积 流 行 的 病 死 现 象进 行 有 针 针 对 性 的 检测 ． 对在 疫 区采 集 到 的病 鱼肾 睫 、 胰 脏 、 等 组 织 ， 取 基 因 组 Ｄ 肝 肠 提 ＮＡ， 用 锦 鲤 疱 疹 病 毒 特 异 性 应
道， 该病给 渔业生产带 来 了极重 大危 害 ， 必须尽快
开 展 ＫＨＶ 流 行 病 学 、 断 与 检 测 及 免 疫 预 防 等 诊
方 面的研究 。
’
采 自吉 林 省 内某 网 箱 养 殖 场 。
一种鲤科疱疹病毒Ⅱ型的PCR快速检测方法
２ ． ２ ． ２ ． １引物 设计 参 考文 献 ｌ ５ ＇ ７ 】 设 计 和合 成引 物 ：
Ｃ ｙ Ｈ Ｖ ｐ ｏ ｌ － Ｆ Ｏ Ｒ （ ５ ’ 一 Ｃ Ｃ Ｃ Ａ Ｇ Ｃ Ａ Ａ Ｃ Ａ Ｔ Ｇ Ｔ Ｇ Ｃ —
２ ． １ ． ２ 仪器 Ｄ Ｋ 一 ８ Ｄ型水浴 锅 （ 上 海森 信 实验 仪器 有 限公 司生 产 ） ； ＭＩ Ｋ Ｒ Ｏ ２ ０ ０ Ｒ型 台式 高 速冷 冻 离 心 机（ 德 国 Ｈｅ ｔ ｔ ｉ ｃ ｈ公 司生产 ） ； Ｓ １ ０ ０ ０型 Ｐ Ｃ Ｒ仪 （ 美 国 Ｂ １ ０ 一 Ｒ Ａ Ｄ公 司生 产 ） ； Ｂ Ｇ — Ｐ ｏ ｗ ｅ ｒ ６ ０ ０型 电 泳 仪 （ 北
２ ． ２ ． ２ Ｐ Ｃ Ｒ反应
医检测 中广 泛应 用 于痕 量 Ｄ Ａ Ｎ提 取 ，同 比有机 酚
法具有简单快速 ， 清洁无毒 ， 检材用量少 ， 反应灵敏 度 高 等 特 点【 ｚ ， 闭， 尤 其是 快速 方 面 ， 同样 Ｄ Ｎ Ａ模 板
提取 缩短 了至少 １ ０个小 时 。
Ｄ Ｎ Ａ Ｐ ｏ ｌ ｙ ｍ ｅ ｒ ａ ｓ ｅ 、 ｄ Ｎ Ｔ Ｐ ｓ 和优 化 的反 应 缓 冲 液 ， 浓度 为 ２×。Ｄ Ｎ Ａ扩增 时 ， 只需 加 入模 板 ， 引 物 和水 ， 使 Ｓ ｕ ｐ ｅ ｒ Ｍｉ ｘ 溶 液 的浓度 为 １ ×即可 进行 反应 。其 扩增 产物 ３ 端带 “ Ａ” 碱基 ， 进行 Ｐ Ｃ Ｒ扩 增 可 以减少 操
鳃、 脾 等 相关 组织 作 为 待 测 样 品 ； 阳性 对 照 为 已经 出现 明显 发 病症 状 的异 育银 鲫 ， 且经 过 电镜 和 Ｐ Ｃ Ｒ 双 重确 认感 染 鲤疱 疹病 毒 Ⅱ型 的鱼 肾脏 组 织 ； 阴性 对 照 为从 未受 鲤疱 疹病 毒 Ⅱ型 感染 的异 育 银鲫 ， 且 电镜 和 Ｐ Ｃ Ｒ双重 检 测 确认 鲤 疱疹 病 毒 Ⅱ型 阴性 的
鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量检测方法[发明专利]
![鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量检测方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/6a9301345022aaea988f0f0e.png)
专利名称：鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量检测方法
专利类型：发明专利
发明人：张文,徐立蒲,吕晓楠
申请号：CN201910275066.4
申请日：20190408
公开号：CN109897918A
公开日：
20190618
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，该方法包括以下步骤：第一、合成引物与TaqMan探针：根据CEV P4a基因序列，对引物序列进行优化，上游引物第1个碱基改为简并碱基W，下游引物第1个碱基改为简并碱基R；根据KHV ORF7基因保守序列，设计1对特异性引物和1条TaqMan探针；分别使用FAM和VIC作为探针报告基团，BHQ1作为探针淬灭基团；第二、确定反应体系及条件：采用20μL反应体系，2×Probe PCR Master Mix
10μL，上、下游引物和探针引物终浓度在0.2μmol/L～0.8μmol/L之间，QN ROX参考染料0.1μL，模板2.5μL，DEPC水补足20μL；反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，50～60℃退火31s，40个循环。
申请人：北京市水产技术推广站
地址：102600 北京市大兴区北京经济开发区科创十四街99号1幢
国籍：CN
代理机构：天津合正知识产权代理有限公司
代理人：吕琦
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PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因
匀。l2000 r / min，离心 lmin。弃去上清，加入 200!L 70%乙醇，反复洗涤 2 次。弃去上清，50C 条件下干 燥 l0min。30!L 灭菌水溶解，充分摇匀。l2000 r / min， 离心 lmin，上清液即为待测样品 DNA。 2 . 2 . 2 蛋白酶 K - 酚 / 氯仿抽提法：见文献［2］。 2.3 引物设计及序列
引物进行筛选，确定了快速检测中应用的一对引物。
2 材料和方法 2 . l KHV 病毒株
本室自存，在水族箱内感染健康锦鲤至出现发
病症状取患病组织作为待测样品。
2 . 2 DNA 提取方法比较 2.2.l 异硫氰酸胍抽提法：
裂解液：异硫氰酸胍（GLSON）6 mOI / L、N - 十二 烷基酰基氨酸（N - LaLrOyI SarOOSine）0 . 5% 、二硫苏 糖醇（DTT）lmmOI / L、醋酸钠 300 mmOI / L、糖原 20!g。
图 l 是分别利用 2 种不同的 DNA 制备方法从 病鱼组织中分离锦鲤 KHV 病毒 DNA 进行 PCR 检测 的结果。结果显示利用蛋白酶 K - 酚 / 氯仿抽提法 不能检测患病锦鲤体内的 KHV 病毒，而利用异硫氰 酸胍抽提 法 可 以 有 效 地 从 患 病 锦 鲤 的 组 织 中 制 备 DNA，病毒浸染组织 PCR 检测呈阳性，PCR 产物大小 和预期一致。 3 .2 两种不同核酸制备方法在 KHV 的 PCR 检测 中敏感性的比较
利用PCR方法检测锦鲤疱疹病毒3个主要靶基因_孟庆峰
细胞悬液，提取 DNA，根据 GenBank 中登录的 KHV 基因序列及出入境检验检疫行业标准推荐的基因(ORF7)，设
计合成 3 对特异性引物，针对胸苷激酶基因(TK)、聚合酶基因(Sph)和 ORF7 基因进行 PCR 检测。通过优化后的
反应体系进行特异性、敏感性试验和样品检测。结果表明：3 对引物能够分别特异性扩增出 409 bp、292 bp 和 484 bp
孟庆峰 1,2，张 琼 3，宋战昀 2，肖成蕊 2，刘 阳 2，蔡 阳 2，张 艳 1，钱爱东 1*，王伟利 2*
(1. 吉林农业大学 动物科技学院，吉林 长春 130118；2. 吉林出入境检验检疫局，吉林 长春 130062； 3. 辽宁出入境检验检疫局，辽宁 大连 116001)
摘 要：为建立锦鲤疱疹病毒(KHV)多靶基因 PCR 检测方法，本实验将 KHV 接种鲤鱼鳍条细胞，收获病变
2 结果与讨论
2.1 3 个基因 PCR 检测结果 分别采用设计的 3 对 引物以 KHV DNA 为模板进行扩增，扩增产物用 1 % 琼脂糖凝胶进行检测，分别在大约 409 bp、484 bp、 292 bp 位置出现目的条带(图 1)。将测序结果进行分 析表明 3 段基因均为目的基因。
本研究基于 TK 基因、Sph 基因和出入境检验检 疫 行 业 标 准 推 荐 的 ORF7 基 因 [6]的 保 守 序 列 设 计 合 成 3 对 特 异 性 引 物 ， 以 KHV 标 准 株 核 酸 为 模 板 ， 利用优化的反应体系对 KHV 3 个主要基因进行 PCR 扩增(表 1)。结果表明，应用 3 个反应体系均能扩增 出目的条带，无杂带产生，具有较好的特异性。 2.2 KHV P CR 检测特异性试验结果 以优化的反 应体系及反 应条件对 KHV、SVCV、IHNV 和 CHV 进行扩增。结果显示，仅 KHV 核酸扩增 出目 的 条 带，其他病毒株及阴性对照均未扩增出条带(图 2)。 表明 PCR 检测 KHV 特异性好，无交叉反应。 2.3 KHV P CR 检测敏感性试验 利用建立的方法对 不同稀释倍数的模板进行扩增，经过计算，ORF7 基 因、Sph 基因和 TK 基因的 PCR 最低检测病毒核酸拷 贝数分别为 1.6×107 copies/μL、2.66×106 copies/μL 和 1.9×106 copies/μL，敏感性较好(图 3～图 5)。敏感 性试验表明 TK 基因的 PCR 最低检测病毒核酸拷贝 数最低，同时有研究表明 TK 基因在致病性中发挥 着作用[7]，在该病毒种属中也相对保守，所以利 用 TK 基 因 进 行 鉴 定 比 用 另 两 种 基 因 进 行 确 证 效 果 好。
锦鲤疱疹病毒的鉴定及预防
锦鲤疱疹病毒的鉴定及预防包卫空;沈锦玉【摘要】本文对感染了锦鲤疱疹病毒病(Koi herpes virus diseases, KHVD)的锦鲤进行检测确诊,对病鱼肌肉、鳃、肠道、肝、脾和肾组织进行了电子显微镜镜检和聚合酶链反应(PCR)检测.电镜检测中在锦鲤的肝、脾及肾脏的细胞组织中都观察到了胞疹病毒,颗粒大小100～200 nm,肾样品内最多,肝和脾次之,肌肉、鳃、肠道中未见病毒颗粒.PCR结果显示肝、脾、肾组织能扩增到KHV病毒基因,且呈阳性,验证了电镜观察结果.本文同时从实践操作的角度简单论述了锦鲤疱疹病毒的预防方法.【期刊名称】《水产养殖》【年(卷),期】2015(036)004【总页数】4页(P45-48)【关键词】锦鲤;疱疹病毒;鉴定;预防【作者】包卫空;沈锦玉【作者单位】无锡市水产技术推广站,江苏无锡214021;浙江省淡水水产研究所,浙江湖州313001【正文语种】中文【中图分类】S941锦鲤疱疹病毒病（Koi herpes virus diseases，KHVD）是由锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）引起的一种传染性疾病，该病毒能感染鲤鱼和锦鲤，死亡率高达80%～90%[1]，是目前锦鲤养殖业发展面临的最大瓶颈问题。
自20世纪70年代在英国发现以来迅速向全世界扩展，其鉴定和预防方法受到研究人员和养殖户的高度重视。
Davison等对鲤疱疹病毒基因组序列进行了细致的分析和比较研究[2]。
较多的研究者构建了聚合酶链反应等分子手段鉴定鲤鱼疱疹病毒[3-6]。
本文报道患疱疹病毒病锦鲤各组织的电镜观察、分子鉴定以及一些预防措施。
1.1 外观及电镜观察肉眼观察病鱼外观，解剖观察。
取病鱼肌肉、鳃、肠道、肝、脾和肾组织样品，样品经清洗、固定、脱水、置换、切片、染色等样品制备环节后进行电镜观察。
1.2 PCR检测1.2.1 DNA抽提取病鱼肌肉、鳃、肠道、肝、脾和肾组织100 mg，放在1.5 mL的离心管中，加入300 μL裂解液（异硫氰酸胍0.5%，二硫苏糖醇1mmol/ L，醋酸钠300 mmol/L，糖原20 μg），将组织捣碎、充分溶解，在12 000 r/min下离心5 min，取上清液置于1.5 mL离心管中，加入10-15 μLGolden bead （上海申能博彩）充分摇匀，室温下充分混匀后，在12 000 r/min离心1 min。
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（． ａ ｇｏ ｇＩｓｅｔ ｎａｄＱｕｒ ｔ ｅＴ ｃｎ ｌｇ ｅｔｒＧｕｎ ｚ ｏ １６ ３ Ｃ ｉａ １ Ｇｕｎ ｄ ｎ ｐ ｃ ｏ ａａｉ ｅｈ ｏｏ ｙＣ ｎｅ， ａ ｇｈ ｕ５０ ２ ， ｈｎ ； ｎ ｉ ｎ ｎ ｎ
中国动物检疫 ２ １ 年 第２ 卷 第 １ 期 ０１ ８ １
一３ ９一
多重 Ｐ Ｒ方法检测锦鲤疱疹病毒基 因 Ｃ
乌 日琴 陈 芳 张艺 宜 ｚ刘芸 莉 ２刘 中勇 ， 志雄 ， ， ， 林
（． 东出入境检验检疫局技术 中心， 东广州 ５０ ２；． １广 广 １６ ２ 华南农业大学动物科学系， 东广州 ５０４ ） ３ 广 １６ ２
Ｋ Ｖ病毒 Ｐ Ｒ检测结果与常规 Ｐ Ｒ检测结果基本吻合，在多重 Ｐ Ｒ检测体系中Ｋ Ｖ Ｔ Ｈ Ｃ Ｃ Ｃ Ｈ Ｋ基因片 段检测的灵敏度高于检验检
疫行业标准方法。结果表 明， 多重 Ｋ Ｖ病毒 Ｐ Ｒ检 测方法能够快速 、 Ｈ Ｃ 准确和灵敏地检测 Ｋ Ｖ病毒基 因。 Ｈ 关键 词： 测； 检 锦鲤疱疹病毒 ； 多重 Ｐ Ｒ Ｃ
中图分类号 ：８ ２ ６ ９ ６ ￥ ５ ．５ ． 文献标识码： Ａ 文章编号：０ ５ ９ ４ （０ １１ － ０ ９０ １ ０ － ４ Ｘ ２ １） １０ ３ － ５
Ａ ｕｔ ｌｘ Ｐ Ｒ ｓ ｙｆ ｒＳｍｕｔｎ ｏ ｓＤｅｅ ｔ ｎ ｏ Ｋｏ ｒ ｅ ｖｒ ｓＧｅｌ Ｍ ｌ ｐｅ Ｃ Ａｓａ ｉ ｌ ｅ ｕ ｔｃ ｏ ｆ ｉ ｉ ｏ ａ ｉ Ｈｅｐ ｓ ｉ ｌ ｕ ｏ
２Ｃ ｌ ｇ ｆ ｉ ｌＳ ｉｎ ｅ ， ｏ ｔ ｉａＡｇｉｕｔｒｌ ｉｅｓ ｙ Ｇｕ ｎ ｚ ｏ １ ６ ２ Ｃｈ ａ ．ｏｌ ｅｏ ｍａ ｃｅ ｃｓ Ｓ ｕｈ Ｃｈｎ ｒ ｌ ａ ｖ ｒｉ ， ａ ｇ ｈ ｕ ５ ０ ４ ， ｉ ） ｅ Ａｎ ｃ ｕ Ｕｎ ｔ ｎ
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ｍｅ ｔ ｏ ｍｐ ｏ ｅ ｈ ｅ ｉｇ ｏ ｉ ｆ ＫＨＶ ｉ ｆｃ ｉ ｎ ３ ｅｓ ｆ ｐ ｍ ｅ ｓ ｗｅ ｅ ｄ ｓｇ ｅ ｔｒ ｅ ｎ ｓ ｅ ｉ ｃ ｅ ｕ ｎ ｅ ｏ ｉ ｔ ｒ ｓ ｉ ｒ ｖ ｔ ｄ ａ ｎ ｓｓ ｏ ｎ ｅｔ ． ｏ ｓ ｔ ｏ ｒ ｒ ｒ ｅ ｉ ｄ ａ ｇ ｔ ｇ ｐ ｃ ｆ ｓ ｑ ｅ ｃ ｓ ｆ ＫＨＶＳ Ｍ ｉ ｎ ｉ ｉ ｐ
（ ＡＹ５ ８ ９ ）， ６ ５ ０ ＫＨＶ５９（ ４１ ８ ３ ａ ｄＫＨＶ Ｋ ｅ ｅ ＡＪ３ １ ２ ， ｉｈｗｅｅｆｅ ｕ ｎ ｌ ｓｄ ｉ ＣＲ ｓａ ｒｄ ｔｃｉｇＫＨＶ ｉａ ／ ＡＦ １ ０ ） ｎ Ｔ ｇ ｎ （ ５ ５ １ ） ｗｈｃ ｒ ｒ ｑ ｅ ｔ ｕ ｅ ｎＰ ｙ ａｓｙ ｆ ｅｅ ｔ ｏ ｎ ｖｒ ｌ
ＤＮＡ ｓ ｄ ｉ ｈ ｓａ ｎ ａ ｈ ｏ ｈ ｍ ｏ ｌ ｍｐ ｉ ｎ ｅ ｕ ｔｉ ９ ｐ， ８ ｐ ａ ｄ ４ ９ｂ ａ ｍｅ ｔｗｉ ｉ ｌ ｕ ｌ ｉ ｃ ｄ ｙ ｕ ｅ ｔ ｅ ａ ｓ ｙ ａ ｄ ｅ ｃ ｆｔ ｅ ｃ ｕ ｄ ａ ｌ ｙ ａ ｄ ｒ ｓ ｌ ｎ ２ ０ ｂ ４ ４ ｂ ｎ ｆ ｎ ０ ｐ ｆ ｇ ｎ ｔ ｖ ｒ ｃ ｅｃ ａ ｉ ｓ ｂ ｒ ｈ ａｎ Ｐ ＣＲ ｒ ｄ ｃｓｗｉ ｉ ｅ ｅ ｔｓ ｅ ｔ ｅ ｓ ｅ ｏ ｐ ｏ ｕ ｔ ｔ ｄ ｆ ｒ ｎ ｉ ， ｉ ｆ ｈ ｚ ｈ ｚ ＫＨＶＳ ｈ ， ｐ Ｉ ＫＨＶ５ ９ ｎ ／ ａ ｄ ＫＨＶ Ｋ ｅ ｅＴ ｅ ｒ ｉ ｈ ｙ ｓ ｅ ｉ ｃａ ｄ ｎ ｐ ｃ ｆ ａ ｄ ｆ Ｔ ｇ ｎ ． ｈ ｙ ｗｅ ｅｈ ｇ ｌ ｐ ｃｆ ｎ ｏ ｓ ｅ ｉ ｃ ｂ ｉ ｉ ｎ ｓｏ
摘
要：根据 对 已 道的 Ｐ Ｒ检 测方法灵敏 性评 价 ，以常用 Ｋ Ｖ 病毒 Ｐ Ｒ检 测的 目的基 因 Ｋ Ｖ ｐＩ 报 Ｃ Ｈ Ｃ Ｈ Ｓｈ 片段 （ Ｙ ６５０ 、 Ａ ５８９ ）
Ｋ Ｖ ／（ Ｆ １８３和 Ｋ Ｖ Ｔ Ｈ ５９Ａ ４ １０ ） Ｈ Ｋ基 因（ Ｊ３１２ 作为靶基 因， 计并选择 ３ Ａ ５５ １） 设 对特异性 引物建立的多重 Ｐ Ｒ检测体 系用 于 Ｋ Ｖ Ｃ Ｈ 病毒 多基 因的检 测。本研 究建立的 多重 Ｐ Ｒ体 系具有较 高的特异性 ，能够特异性扩增 出 Ｋ Ｖ ｐＩ Ｃ Ｈ Ｓｈ 片段 ２０ ｐＫ Ｖ ／ 片段 ９ ｂ 、Ｈ ５９ ４４ ｐ和 Ｋ Ｖ Ｔ ８ ｂ Ｈ Ｋ基 因片段 ４９ ｐ ０ ｂ ，对锦鲤和 鲤鱼 的另外 一种病毒 性病原 鲤春毒血症 病毒检 测结果为 阴性 。多重 Ｋ Ｖ病毒 Ｈ Ｐ Ｒ体 系检 测 Ｋ Ｖ ｐＩ Ｈ ５９ Ｋ Ｖ Ｔ Ｃ Ｈ Ｓｈ、 Ｖ ／ 和 Ｈ Ｋ基 因片段单 一模板 的检 测下限分别 为：０ ｇ １ 和 １０ Ｋ １ ｆ、０ ｆ ０ ｇ ０ 堙，在相 同模板 浓度 的 情况下， Ｈ Ｓｈ、Ｈ ５９ Ｋ Ｖ Ｔ Ｋ Ｖ ｐＩ Ｖ ／ 和 Ｈ Ｋ基 因片 同时被检 出的检 测下限为 １０ｇ 对 Ｋ Ｖ病毒 感染组织 的检 测结 果表 明， Ｋ 段 ０ ｆ。 Ｈ 多重