蛋白质O-GlcNAc糖基化修饰对tau蛋白磷酸化修饰的影响

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摘要! 蛋白质的 + 位 ,-乙酰葡萄糖胺（ +-./0,*0） 糖基化修饰是一种新近发现的广泛存在于细胞核蛋白与细胞 浆蛋白的蛋白质翻译后修饰1 其性质与经典的膜蛋白和分泌蛋白的糖基化修饰不同，而与蛋白质磷酸化修饰更 相似1 +-./0,*0 糖基化和磷酸化均修饰 234 蛋白的丝氨酸和苏氨酸残基，通过改变 +-./0,*0 糖基化供体底物浓 度以及其关键酶活性等方法，改变分化后成神经细胞样的 56"# 细胞中的蛋白质 +-./0,*0 糖基化修饰水平，然 后用特异性识别不同位点磷酸化的 234 蛋白抗体，进行蛋白质印迹分析来检测 234 蛋白磷酸化水平的变化1 结果 发现细胞内蛋白质 +-./0,*0 糖基化对 234 蛋白磷酸化的影响，在不同的磷酸化位点其影响不同1 增加蛋白质 +./0,*0 糖基化修饰导致 234 蛋白大多数磷酸位点的磷酸化水平降低，反之亦然1 这些结果说明， 234 磷酸化在大 多数位点受到 +-./0,*0 糖基化修饰的负性调节1 这一研究为阐明调节 234 蛋白磷酸化水平的机理和阿尔茨海默 病脑中 234 异常过度磷酸化的分子机制提供了新的线索1 关键词! 234，蛋白质 +-./0,*0 糖基化修饰，蛋白质磷酸化，+.7，+-./0,*0389，阿尔茨海默病 学科分类号! :;"&
生物化学与生物物理进展d d
()*+, -.*/012, -.*3045, d d d d d d d d /GGB ；%6 （ > ）
研究了 !"#$%&’% 糖基化修饰对 ()* 磷酸化的影响+
增：我们将 B. ?N 长的人 !#5 的 %9&’ 通过 $#%! 和 &’#D" 插入到真核表达载体 7%9&’BC . 中+ 将 此重组质粒转化 9:R # 感受态细胞，在克隆并鉴定 后大量扩增+ 用 Z<’#H& 公司的 E)T3 试剂盒抽提 质粒（ 根据说明书所述步骤进行） + 测定 (/FG 以确 定质粒 9&’ 浓度+ !# $# %" 细胞的处理 d d J5V 处理和高糖处理：在细胞转至用胶原包被 过的六孔培养板的第二天，换成含有 RG $I = M &#O 的上述相同培养基，在同样条件下培养 / 天，以诱 导细胞分化+ / 天后，用不含血清，含不同浓度的 葡萄糖和 RG $I = M &#O 的 D,E< .F>G 继续培养 > 天，中间换液一次+ > 天后，仍然以上述培养基但 含不同浓度的 J5V 继续培养细胞 Q A+ 然后收集细 胞作进一步分析+ d d 饥饿处理：培养在六孔培养板中的细胞在接种 后的第二天，换成含有 RG $I = M &#O、葡萄糖和血 清的 D,E< .F>G 诱 导 培 养 细 胞 ‘ 天，中 间 换 液 / 次+ 第 Q 天开始换成不含葡萄糖和血清，但仍含有 RG $I = M &#O 的 D,E< .F>G 进行饥饿处理不同时 间，然后收集细胞+ d d 质粒转染：将 ,-./ 细胞，按 .C R e .G R 个细胞 = 孔培养于六孔培养板中，使细胞在每个孔中约达 到 ‘G_ b QG_ 汇片，用含 .G_ 马血清和 R_ 小牛 血清的 D,E< .F>G 培养基，R_ -!/ 孵箱，在 B‘a 培养过夜+ 第二天，用 ,-<"418"()* （ 野生型） 及 7%9&’BC ."!#5 质粒转染细胞+ !#5 质粒与 ()* 质 粒的 质 量 比 分 别 为 . f .， / f .+ 转 染 根 据 <4;3(28I14 公司在 $378X1%()0341 /GGG 试剂说明书中 所提 供 的 方 法 进 行+ 在 转 染 > A 后， 换 上 含 RG $I = M &#O 和 .G_ 马 血 清、 R_ 小 牛 血 清 的 D,E< .F>G 生 长 培 养 基 培 养 >> A 后，收 获 细 胞+ 每孔用不同方法处理的细胞都用 .RG $$ . e 样品缓 冲液 裂 解 收 集 细 胞 （ . e 样 品 缓 冲 液 中 加 入 .GG $08$ = M 正钒酸钠，RG 008$ = M &)O，. 008$ = M + 收集液在沸水浴中煮 > ,EJO，. 008$ = M H95’ ） 034，而后用探头式超声波处理 /G 次，.F GGG e ) 离心 .R 034，收集上清，储存于 c /Ga 备用+ !# $# &" 蛋白质印迹分析：蛋白质印迹和凝集素印
! ! 与蛋白质的磷酸化受蛋白激酶与磷酸酯酶的双 重调控相似，蛋白质 +-./0,*0 糖基化程度也是 +./0,*0 糖 基 转 移 酶（ +.7 ） 和 +-./0,*0 糖 苷 酶 （ +-./0,*0389 ） 共 同 作 用 的 结 果1 前 者 是 催 化 ./0,*0 连接到肽链的丝氨酸或苏氨酸残基上的酶1 后者是将万方数据 +-./0,*0 从蛋白质肽链上水解的酶1 抑
! ! 蛋 白 质 的 + 位 ,-乙 酰 葡 萄 糖 胺 修 饰 （ +./0,*0 糖基化修饰）是一种新近发现的、广泛发生 在细胞质与细胞核内的、动态的蛋白质翻译后修饰 方 式1 它 是 指 单 个 ,-乙 酰 葡 萄 糖 胺 （ ,3092</=/40>83?@A9，./0,*0）以 +-糖苷键与蛋白质的 丝氨酸或苏氨酸的羟基相连接
［ &］ 化修饰之间必定有一定的联系 1
跃的领域1 然而，在 *H 脑中导致 234 异常过度磷 酸化的机理尚不完全清楚1 ! ! 234 蛋白除被磷酸化修饰外，最近研究发现也
［ ;， $］ 1 从牛脑中提纯的 234 被 +-./0,*0 糖基化修饰 蛋白，平均每分子 234 可被四分子的 +-./0,*0 糖
万方数据 !# $# $" 7%9&’BC ."!#5 真核表达质粒的构建和扩
!# $# ’" :81%A@( BB/RQ 染色：培养在六孔培养板上 的细胞，经 ,SJ 轻轻洗涤后，用 >_ 的甲醛固定细 胞 BG 034，然后再用 . 0I = M 的 :81%A@( BB/RQ 试剂 染色 >R 034+ 最后在荧光显微镜下观察并拍照+
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! ! ! 生物化学与生物物理进展! !
-./01 23/%4561 23/74891
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蛋白质 !"#$%&’% 糖基化修饰对 ()* 蛋白 磷酸化修饰的影响
# 钱! 慰" ）! 刘! 飞# ）! 朱! 俐! 龚成新# ）! 金淑仪" ） （ " ）南通医学院生物化学教研室，南通 ##$%%" ；
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制其 活 性 使 蛋 白 质 +-./0,*0 糖 基 化 程 度 明 显 增 加1 ! ! 阿尔茨海默病（ */DE9@?9F G@89389 ，*H ） 是一 种发病率颇高的渐进性大脑退行性病变，但其发病 机理尚不清楚1 很多证据表明， 234 蛋白的异常过
［ ’］ 度磷酸化是 *H 致病过程中的关键事件 1 因此， 控制 234 蛋白磷酸化水平是 *H 防治研究中极其活
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c /Ga 储存备用+
基础研究所神经生化系自行研制+
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司 产 品+ 0&#O 为 ’$80841 M)N@ 公 司 产 品+ /GGG 试 剂 为 <4;3(28I14 公 司 产 品+ S3@S14U303T1 : BB/RQ 为 J3I0) 公司产品+ !"# !、 $#% !为 S38$)N@ 公司产品+ 941)@6 53@@*1 Y3( （ 用于 提取 基 因 组 9&’ ） 为 Z3)I14 公 司 产 品+ ,$)@03T E)T3 Y3( （ 用于中等量抽提质粒） 为 Z3)I14 公司产 品+ #1$ H[(2)%(384 Y3( （ 用于从琼脂糖凝胶中纯化 9&’ 片 段 ） 为 Z3)I14 公 司 产 品+ O\]< <0)I34I ,$)(1 为 O\]< ,:!5! O<ME 公司产品+ <008N3$84 5E " , ,^9O 膜为 E3$$37821 公司产品+ !# $" 方法 !# $# !" 细胞培养： ,-./ 细胞培养在含 .G_ 马血 清和 R_ 小牛血清的 D,E< .F>G 基础培养基中，培 养条件为 B‘a ，R_ 的 -!/ ，每隔 / b B 天换液一 次+
［ Q， P］ 迹按照已发表的方法完成 +
!" 材料与方法