EGFP-CIDE-3及D sRed1-CIDE-3融合基因真核表达载体的构建及其在293T细胞中的表达和定位

合集下载

HPV18E5与EGFP融合基因真核载体的构建及表达

ｈ
转化大肠埃希菌ＤＨ５一Ｏｔ，蓝白斑筛选。测序正确的质粒和真核表达载体ｐＳｅｃＴａｇ分别进行Ｋｐｎ
ＥｃｏＲＩ、
后提取细胞中的总ＲＮＡ，反转录成ｅＤＮＡ，ＲＴ—ＰＣＲ电泳扩增出一条大小为２２２ｂｐ条带，与ＨＰＶｌ８Ｅ５基因条带相符，内参Ｂ—ａｃｔｉｎ约为３９９ｂｐ（图２）。２．４荧光显微镜下观察重组质粒在细胞中的表达重组质粒转染ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３细胞４８ｈ后，在荧光显微镜下可观察到清晰的荧光存在。由于ＥＧＦＰ位于Ｅ５基因下游，启动子在Ｅ５基因上游，说明构建
ＥｃｏＲＩ、Ｘｈｏ
Ｉ酶切鉴定（图１），分别得到与
ｍｉｎ、变性９４℃３０Ｓ、退火５５℃３０Ｓ、延伸７２℃
１０
ＨＰＶｌ８Ｅ５（２２２ｂｐ）、ＥＧＦＰ（７２０ｂｐ）、ＨＰＶｌ８Ｅ５－ＥＧＦＰ融合基因（９４２ｂｐ）大小相同的片段。重组质粒序列经测定并比对，结果正确。
２．３
Ｓ，３０个循环后７２。Ｃ
Ｔｏ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
ｔｈｅｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｖｅｃｔｏｒ
ｏｆ
ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓＴｈｅＨＰＶｌ８Ｅ５
ｔｙｐｅｌ８Ｅ５ａｎｄＥＧＦＰｆｕｓｉｏｎｇｅｎｅ，ｔｏａｎａｌｙｚｅＥ５ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３ｃｅｌｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ
２ｂＤ３
４
抑制细胞凋亡。研究表明，中国宫颈癌和食管癌患者中ＨＰＶｌ８型的比例仅次于ＨＰＶｌ６型，而对ＨＰＶｌ８型的研究也主要集中在Ｅ６、Ｅ７基因上，对于ＨＰＶｌ８Ｅ５的研
２０００７５０２５０
ＨＰＶｌ８Ｅ５．ＥＧＦＰＥＧＦＰ

登革病毒外膜蛋白DⅢ区融合基因真核表达载体的构建及免疫效果研究

ｐｏｅｎｗｓｉｅｔｅｙｉｄｒｃｍｎｆｏｅｃｎｓａｎｓｒｌｔＴｅｔｒｖｅｔｒｃｍｉａｔｐａｍｉｓｗｒｓｄｔｅｉｒｔｉａｎｉｄｂｉｔｍｕｏｕｒｓｅｔａｓｙａｄＷｅｔｎｂｏ．ｈｅａａｎｅｏｎｎｌｓｄｅｅｕｅｔｍｍｕｉｄｆｉｎｅｉｌｅｔｌｂｏｈｎｚｅｍｉｅｔｏｓｌｅｔｅｒｉｃｏｈｅｖｈｉｍｍｕｏｅｉｉｄａｉｔｏｉｄｃｅｔｌｉｇａｔｏｉｓＲｅｕｔ：ｈｅｕｓｓｏｅａｅｒｃｍｉａｔｐｏｅｎ＇ｎｇｎｃｔａｂｌｙｔｎｕｅｎｕｒｉｎｉｄｅ．ｓｌＴｅｒｓｈｈｗｄｔｔｔｅｏｎｎｒｔｉｙｎｉａｚｎｂｓｈｈｂｃｕｄｂｘｒｓｅｙＢ－１ｃｌ．ｃｍｍｕｉｄｗｔｅｒｖｅｔｐａｍｉｓｗｒｂｅｔｒｄｃｅｔｈｉｇａｔｏｉｓａａｎｔｄｎｕｏｌｅｅｐｅｓｄｂＨＫ２ｅｌＭｉｉｓｅｎｚｉｔｔａｎｌｓｄｅｅａｌｏｐｏｕｅｎｕｒｚｎｎｉｄｅｇｉｓｅｇｅｅｈａｌａｂ
ｋｒｔｅｔＣＮ３１＋）ｅｅｔｒｏｂｎｎｉｅｔｌｍｄ，ｅａｓｃｔＢＫ２ｅｓＥｐｅｓｎｏｅｒｃｍｉｎａｏｃｖｃｒＤＡ．（ｔｇｎｒｅｅｍｉｔｖｎｐａｉｔｎｔｎｆｔｉｏＨ－１ｃｌ．ｘｒｉｆｏｎｔｙｉｏｐｏａｃａｂａｓｓｈｌｒｅｅｎｄｌｓｏｈｔｅｂａ

蛋白质egfp融合蛋白

蛋白质egfp融合蛋白蛋白质EGFP融合蛋白（EGFP-fusion protein）是由一种绿色荧光蛋白（Enhanced Green Fluorescent Protein，EGFP）与其他蛋白质序列融合而成的蛋白质复合体。

EGFP是一种由Aequorea victoria水母产生的蛋白质，具有独特的荧光特性，能够在外源激发光源的作用下自发发出绿色荧光。

EGFP-fusion protein在生命科学研究中被广泛应用，可以通过显微镜观察该融合蛋白的在细胞和组织中的分布和定位，从而研究该蛋白质的生物学功能和调控机制。

本文将介绍EGFP-fusion protein的构建步骤、应用领域以及存在的挑战和未来发展方向。

首先，构建EGFP-fusion protein需要克隆目标蛋白质的编码区域，通常使用基因克隆技术将EGFP序列与目标蛋白质的编码序列进行连接。

常用的方法是PCR扩增目标蛋白质的编码序列，并在其N或C端引入适当的限制酶切位点，然后将PCR产物与EGFP载体进行双酶切和连接。

连接产物可经过测序验证，进一步进行细胞转染或转基因模型构建等应用。

在应用方面，EGFP-fusion protein可以用于研究蛋白质在细胞内的定位和分布，例如可以用EGFP-actin融合蛋白来研究细胞骨架的重组和功能。

此外，EGFP-fusion protein还可以用于蛋白质相互作用的研究，通过融合EGFP和其他蛋白质的序列，可以观察到这些蛋白质在细胞内的共定位情况，从而推测它们之间可能发生的相互作用。

然而，构建并应用EGFP-fusion protein也面临一些挑战。

首先，蛋白质的融合可能对其原有的结构和功能产生影响，因此需要对融合蛋白进行验证，确保其具备正常的生物学活性。

其次，EGFP的荧光特性可能会受到融合蛋白的结构和环境的影响，从而导致荧光信号强度和彩色性能的改变。

最后，EGFP的表达可能会受到细胞毒性和光毒性的影响，因此需要合理选择表达系统和实验条件，以确保实验的准确性和稳定性。

融合蛋白d-EGF的结构预测、克隆、原核表达及鉴定

中文摘要目的：对融合蛋白d-EGF二级、三级结构进行预测并分析其活性部位的可能影响，进行原核表达，并对表达产物进行分析鉴定。

方法：以融合蛋白质基因序列为基础，用DNAStar软件预测其蛋白质的二级结构；用Insight II软件对其三级结构进行建模预测。

在对融合蛋白理论预测的基础上，分别构建含β-defensin-3、EGF的重组质粒，应用重组PCR等方法，将EGF的基因序列融合到β-defensin-3 DNA序列的3’末端，将融合基因克隆入原核表达载体pET-SUMO,构建目的重组质粒pET-SUMO-d-EGF。

采用PCR、测序等方法对目的基因是否正确重组进行鉴定；以重组质粒转化大肠杆菌E.coli BL21（DE3），以IPTG 诱导表达目的蛋白质，表达产物经过Ni-trap柱纯化，SDS-PAGE检测表达初产物及纯化产物。

最后用Western-blot对其特异性进行鉴定；用MTT法检测其促细胞增殖活性；用纸片扩散法药物敏感试验、微量稀释法检测其抗菌活性。

结果：采用DNAStar 软件的Gamier Robson 方法预测的结果表明，融合蛋白质d-EGF含较多的β折叠结构；Charge Density-Charge法预测蛋白质3-22、31-48区段带丰富的正电荷；Insight II软件分析显示重组蛋白d-EGF中原蛋白β-defensin-3、EGF三级结构中的活性必须的六个链内二硫键在融合蛋白中都能够正确形成，维持β-defensin-3三级结构的3个反向平行的β折叠片结构在融合蛋白中能够形成。

融合蛋白的结构含有原蛋白β-defensin-3、EGF的生物活性结构。

成功构建β-defensin-3、EGF 重组质粒，经重组PCR成功扩增出294bp的目的片段，重组体PCR结果与预期结果一致，测序正确。

转入重组质粒的E.coli BL21（DE3）经IPTG诱导、SDS-PAGE 分析得到28 kD左右的目的蛋白条带。

真核表达载体pIRES2-EGFP-hFasL的构建及鉴定

中国组织工程研究与临床康复第 15 卷第 31 期 2011–07–30 出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research July 30, 2011 Vol.15, No.31
真核表达载体pIRES2-EGFP-hFasL的构建及鉴定*☆
ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH
5839

邱明链，等. 真核表达载体 pIRES2-EGFP-hFasL 的构建及鉴定
福建医科大学附属第一医院，1 胸外科，4 肝病中心，福建省福州市 350005；2 西安医学院附属医院病理科，陕西省西安市 710077；3 福建医科大学基础医学院病理系，福建省福州市 350004
上海艾普拓普生物科技有限公司
大连 Takara 公司
QIAGEN 公司上海艾普拓普生物科技
有限公司大连 Takara 公司 Pharmacia Biotech 公司 Thermo
实验方法：外周血单核细胞的制备：取正常人新鲜抗凝血 5 mL与Hanks液等量混匀后，加于4 mL淋巴细胞分离液上，离心收集细胞，用5 mL含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640CM培养液悬浮，加入25 mg/L的ConA，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中孵育24 h。 RT-PCR 扩增 hFasL 基因：ConA刺激后的淋巴细胞，经 Trizol 试剂盒据说明书提取总 RNA。反转录体系：模板RNA溶液5 µL，5×RT buffer 4 µL，dNTP(各10mmol/L)混合物2 µL， RNA酶抑制剂0.5 µL，引物设计参照GenBenk 上hFasL序列分别设计上、下游引物。上游引物： 5’ATG CAG CAG CCC TTC AAT TAC CCA TAT C 3’；下游引物：5’TTA GAG CTT ATA TAA GCC GAA AAA CGT C 3’。Oligo(dT)引物1 µL， AMV反转录酶1 µL，DEPC水6.5 µL。42 ℃保温1 h，置95 ℃温育5 min使AMV反转录酶失活。将此反转录产物直接进行PCR。目的片段大小约846 bp，PCR反应条件：94 ℃预变性2 min， 94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，共30个循环，最后72 ℃延伸10 min。 PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定(100 V， 30 min)，凝胶成像系统摄像。真核表达栽体pIRES2-EGFP-hFasL的构建： 1% 琼脂糖凝胶电泳分离并回收 PCR 产物及 pIRES2-EGFP空载体，经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后，T4 DNA连接酶4 ℃连接，过夜，其产物按常规方法转化于DH5a感受态细胞。挑取单克隆菌落进行扩增培养，采用HiSpeed Plasmid Midi Kit质粒纯化试剂盒(QIAGEN公司)抽提质

真核表达载体pPDGF-NEP的构建及表达

真核表达载体pPDGF-NEP的构建及表达一、真核表达载体pPDGF-NEP的构建（一）、材料各种Taq酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、所有DNA marker及凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自大连Takara公司；全血基因组DNA提取试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

质粒pSIMPLE-19 EcoRⅤ/BAP载体购自大连Takara公司；真核表达质粒pEGFP-1、质粒pcDNA3.1(+)、质粒pCSC-SPPW-net由山东大学医学院生物化学与分子生物学研究所保存。

（二）、方法2.1. PDGF启动子的获取用全血基因组DNA提取试剂盒提取人外周血基因组DNA，根据Genbank上的PDGF 基因全序列（Genbank：HSN 10C 3,2782bp,该序列中含有一个EcoRⅠ酶切位点）设计多对引物，并在上下游外引物F/R上分别加入Bsp106及KpnⅠ酶切位点。

第一步先以基因组DNA 为模板，分别使用内引物F0/R1、F1/R进行分段PCR扩增，获得PCR产物1和PCR产物2。

第二步以PCR产物1和PCR产物2为模板，以外引物F/R进行PCR扩增，扩增产物即为2782bp的PDGF启动子序列。

第三步将上一步获得的PCR产物通过酶切插入至pSIMPLE-19 EcoRⅤ/BAP载体中构建pSIMPLE-19-PDGF，并进行酶切、测序鉴定和扩增（实验步骤见图1）。

各引物序列：F0：5’-CTTACGGGCTGTGTGACCTT-3’；F：5’-ATCGATAGCA TGGAGAGGCTACAGGTAGAGT-3’；F1：5’-TCTCTGCCACTGTGCCACGCT-3’；R：5’-GGTACCGGCAGTCGATGGTTCGTCTTCACTC-3’；R1：5’-AGCGTGGCACAGTGGCAGAGA-3’。

图1 神经特异性启动子PDGF promoter的调取2.2. NEP基因的获取根据NCBI Genbank提供NEP、β-actin的基因序列，β-actin：F 5’-ACACTGTGCCCATCTACGAGGGG-3’，R 5’-ATGATGGAGTTGAAGGTAGTTTCGTGGAT-3’；引物NEP：F5’-AAAGCTAAAAAGAAAACAG-3’，R 5’-CAGTGCCAACAAACAAA T-3’，扩增片段大小分别为395、575bp，引物为上海博亚公司合成。

基因工程常用的三种载体

基因工程常用的三种载体基因工程是一门综合性的学科，其中一个关键方面是使用载体进行基因转移和操控。

载体是一种可以携带和传递特定基因的DNA分子。

在基因工程中，常用的载体有质粒、噬菌体和人工染色体。

下面将详细介绍这三种载体的相关信息。

1. 质粒（Plasmid）质粒是一种环状双链DNA分子，通常存在于细菌细胞内，也可通过人工方法导入其他生物体内。

质粒是最常用的基因工程载体，因其结构相对简单且易于操作，可以携带外源基因并通过转染等方法传递到细胞中。

质粒的大小通常在1-20千碱基对之间，具有自主复制和不受宿主基因组限制的能力。

质粒常用于基因克隆、表达以及基因敲除等研究。

例如，在基因克隆中，通过将目标基因插入质粒中的多克隆位点，可以将质粒转化到宿主细胞中进行扩增和分析。

质粒也常用于表达外源基因，可以将目标基因与促进其表达的启动子及调控元件结合在一起，构建表达载体进入目标细胞中，使其产生目标蛋白。

2. 噬菌体（Bacteriophage）噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，是基因工程中另一常用的载体。

噬菌体具有高度选择性对细菌进行感染和复制的能力，因此可以利用噬菌体来转移和表达外源基因。

噬菌体载体通常比质粒大，可以携带更长的DNA序列。

噬菌体常用于噬菌体展示技术和抗体库构建。

噬菌体展示技术是一种用于筛选蛋白质相互作用、抗体或潜在药物靶点的方法。

通过将目标多肽或蛋白质与噬菌体表面蛋白基因融合，在噬菌体所感染的细菌中进行筛选。

另外，噬菌体也常用于构建噬菌体抗体库，通过大规模的筛选，筛选出具有特定抗体活性的噬菌体克隆。

3. 人工染色体（Artificial Chromosome）人工染色体是通过基因工程方法人为合成的染色体模拟体，在某些情况下可用于携带超长的DNA分子。

人工染色体被设计成可以稳定传递和复制的DNA分子，通常包括一个原核或真核的起始序列、一个中央控制区域和一个终止序列。

人工染色体在基因组学和基因治疗研究中发挥着重要作用。

真核表达载体pcDNA3-ICOSIg的构建及表达

（２０１３）３７ — ０６６４１－０４
收稿Ｅｌ朋：２０１３－０１－１９
摘要．修目Ｅｌ期．２０１３－０４．２４背景：人可诱导共刺激分子（ＩＣＯＳ）是迄今发现的重要共刺激分子家族成员，可促进激活Ｔ细胞的增殖和分泌、（２０１００８０７００５ＡＮＬＭ・ｃ）调节Ｔｈ１，１－ｈ２细胞的极化、增强依赖Ｔ细胞的Ｂ细胞功能，阻断ＩＣＯＳ共刺激信号会导致Ｔ细胞的克隆失活或克隆无反应，从而诱导肿瘤对机体的免疫逃逸。目的：构建表达ＩＣＯＳＩｇ的质粒，观察其在小鼠体内的表达。方法：克隆编码ＩＣＯＳ的胞外片段，将其与编码小鼠免疫球蛋白ＩｇＧ恒定片段（Ｉｇ）的基因融合，构建ＩＣＯＳＩｇ融合基因及其分泌型真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ＩＣＯＳＩｇ，酶切鉴定重组子，测序，利用阳性脂质体载体包被ｐｃＤＮＡ３－ＩＣＯＳｌｇ转染小鼠右侧大腿肌肉组织，Ｗｅｓｔｅｍｂｌｏｔ法检测血清ＩＣＯＳＩｇ水平。结果与结论：经测序鉴定证实ｐｃＤＮＡ３一ＩＣＯＳＩｇ质粒目的基因片断与Ｇｅｎｂａｎｋ上公布的ＩＣＯＳ序列完全一致，说明质粒构建成功。脂质体载体包被ｐｃＤＮＡ３．ＩＣＯＳＩｇ转染小鼠７ｄ，在小鼠血清中检测到ＩＣＯＳｌｇ的阳性表达，说明ｐｃＤＮＡ３・ＩＣＯＳｌｇ能够在小鼠肌细胞内表达。证实利用基因合成和重组技术可成功构建真核表达载

不同片段的NPM1-EGFP融合表达载体的构建和表达

ｏａｓｅｔｎａｄｄｓｒｂｔｎｗｅｅｄｔｒｉｅｙｍｉｒｓｏｙｆｔｎｆｅｉｎｉｔｕｉｒｅｅｎｄｂｃｏｃｐ．ＲｅｕｔＴｅｒｃｍｂｎｔｐａｍｉａｄｎｉａｓｅｐｃｒｏｉｏｍｓｌｓｈｅｏｉａｌｎｓｄｗｓｉｅｔｌａｘｅ．ｃ
关键词：腺肿瘤；Ｐ；粒；Ａ— －３乳ＮＭ１质ＭＤＭＢ２１细胞；位定中图分类号：７－Ｒ３３文献标志码：Ａ文章编号：０２２６２１）２０４－３１０－６Ｘ（０２１－０５０
不同结构域的真核重组质粒构建成功，在细胞中成功表达，可以用于分析其亚细胞定位，而为进一步研究并从
显微镜观察其亚细胞定位。结果
酶切鉴定和基因测序结果显示不同片段的ｐＧＰＮＭ１合表达质粒构建成ＥＦ —Ｐ融ＮＭ１及其Ｐ
功，可在ＭＤ — －３并ＡＭＢ２１细胞内表达，倒置荧光显微镜下可以清晰显见融合蛋白的亚细胞定位。结论
ＮＭ１Ｐ在乳腺癌发生发展中的作用奠定基础。
产物经电泳分离、切胶纯化后，分别采用ＸｏＩ和ＥｏＩ行酶切，ｈｃＲ进然后与同样酶切后的ｐＧＰＣＥＦ・３载体进行连
接反应，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取克隆，提取质粒并酶切鉴定。将酶切及测序鉴定后的ｐＧＰＥＦ／ＮＭ１Ｐ质粒采用脂质体介导后将其转入ＭＡＭ－３细胞中，Ｄ — Ｂ２１通过Ｗｅｔｎｂｔｓｒｌ技术检测其蛋白的表达。倒置荧光ｅｏ

SOEing法构建EGFP真核表达载体及其在杜氏盐藻中的表达

基因．ｒｎｒ序列与融合片段相连，构建含Ｐｎｒ — ＥＧＦＰ－Ｔｎｒ表达盒的盐藻真核表达载体０７ＮＥＴ。电击法转化杜氏盐藻，在盐藻转化株中观察到了ＥＧＦＰ的瞬时表达。此研究为转基因杜氏盐藻研究和成功建立杜氏盐藻生物反应器奠定了
尚未见报道。
重叠区扩增基因拼接法（Ｇｅｎｅｓｐｌｉｃｉｎｇｂｙｏｖｅｒｌａｐｅｘｔｅｎｓｉｏｎ，ＳＯＥｉｎｇ）是利用ＰＣＲ技术在体外进行有效的基因重组和定点突变，不需要内切酶消化和连接酶处理Ｊ。众所周知，由于引物只需要与模板有效
另发），本研究利用改进的ＳＯＥｉｎｇ法将Ｐｎｒ和有完整读码框的增强型绿色荧光蛋白（Ｅｎｈａｎｃｅｄｇｒｅｅｎｌ氏盐藻作为宿主表达外源基因，生产有用的外源蛋白，具有繁殖速度快、培养简单、表达产物下游纯化过程简单等优越性。因此，利用盐藻作为生物反应器具有较高的应用前景 ¨ Ｊ。硝
实验基础。
关键词：杜氏盐藻；重叠区扩增基因拼接法（ＳＯＥｉｎｇ）；增强型绿色荧光蛋白（ＥＧＦＰ）；真核表达载体
中国分类号：Ｑ７５４文献标识码：Ａ文章编号：１００ｏ一３２０７（２００７）０４ — ０５４６ — ０６

杂合抗菌肽基因的设计及表达载体的构建

杂合抗菌肽基因的设计及表达载体的构建
王金固;杜娟;李尚伟
【期刊名称】《贵州农业科学》
【年(卷),期】2011(039)005
【摘要】为高效表达具有高抗菌活性的抗菌肽,根据Magainin 2(MA)、Sapecin(SA)和Melittin (ME)基因核心序列,设计杂合抗茵肽MA-SA-ME(MSM)基因并进行密码子优化.生物信息学分析显示,该抗茵肽具有很好的抗茵作用.将MSM基因与毕赤酵母表达载体pPICZQ-A连接,构建重组表达载体pPICZa-A-MSM,以实现抗茵肽基因MSM在毕赤酵母GS115中进行分泌表达.构建的重组表达质粒经PCR检测、双酶切和测序3步鉴定表明,构建的重组表达质粒与预期完全相符,可用于下一步的毕赤酵母表达试验.
【总页数】4页(P133-136)
【作者】王金固;杜娟;李尚伟
【作者单位】贵州大学昆虫研究所,贵州山地农业病虫害重点实验室,贵州贵阳550025;贵州大学昆虫研究所,贵州山地农业病虫害重点实验室,贵州贵阳550025;贵州大学昆虫研究所,贵州山地农业病虫害重点实验室,贵州贵阳550025
【正文语种】中文
【中图分类】Q782
【相关文献】
1.杂合抗菌肽Py-Sa真核表达载体的构建 [J], 陈晓平;陈成玉;谢晶;刘超
2.杂合抗菌肽Sα-Jp基因真核表达载体的构建 [J], 陈晓平;贾春兰;马吉霞
3.杂合抗菌肽MgJ基因真核表达载体的构建 [J], 尹佳
4.杂合抗菌肽Me-HNP1真核表达载体的构建与初步表达 [J], 于婷;王思霁;刘畅;崔敬爱
5.番木瓜环斑病毒外壳蛋白基因及抗菌肽D基因双抗表达载体的构建 [J], 张锡炎;郑学勤;伍世平;王君健;梁小友
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

E3泛素连接酶HECTD3真核表达质粒的构建

E3泛素连接酶HECTD3真核表达质粒的构建【摘要】目的克隆E3泛素连接酶（homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3，HECTD3）基因及构建真核表达质粒。

方法提取人卵巢癌细胞SKOV-3细胞RNA，并逆转录为cDNA，以此作为模板PCR法扩增HECTD3基因，将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+），测序验证构建质粒中包含HECTD3基因。

结论HECTD3基因克隆及真核表达质粒构建成功，可以用于后续卵巢癌发生发展的分子生物学研究。

【关键词】E3泛素连接酶；卵巢癌；真核表达质粒泛素化是一种蛋白质的翻译后修饰，参与调控多种生物学过程，其系统功能的紊乱与癌症发展进程密切相关[1]。

HECTD3 （homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3）是一个功能目前尚未阐述清楚的新的E3泛素连接酶。

有报道指出该基因可能在乳腺癌和宫颈癌中介导顺铂的化疗耐受[2]，但是目前尚未有人报道HECTD3在卵巢癌中的作用。

且卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤，仅2011年1年就导致全世界140000人死亡[3]。

因此本文拟克隆HECTD3基因，并构建该基因真核表达质粒，对进一步研究HECTD3基因在卵巢癌发生发展中的作用提供有力的工具和手段。

1 实验材料卵巢癌细胞SKOV-3、真核表达载体pCDNA3.1、大肠杆菌DH5α感受态由本室保存。

RPMI-1640、胎牛血清、胰酶购自美国Gibco公司。

PrimeSTARHS DNA Polimerase with GC Buffer、EcoR I和Nhe I限制性外切酶购自TaKaRa公司。

Gel Extraction Kit购自omega公司，DL2000、1Kb DNA Marker购自天根生化科技有限公司。

VEGFA基因重组真核表达载体的构建与表达吴勇

VEGFA 基因重组真核表达载体的构建与表达吴勇1，刘学刚2，郭嘉诚1，李慧敏1，丁周志1，王亚明1，宋伟3，徐家丽1，赵武1(蚌埠医学院第一附属医院1．儿科;2．心胸外科;3．超声心动图，安徽蚌埠233004)摘要：目的构建VEGFA 基因重组真核表达载体pEGFP-VEGFA ，并检测其在人胚胎肾细胞（HEK293T ）中的表达。

方法以人脐血单核细胞的RNA 为模板，采用RT-PCR 技术扩增VEGFA 基因，并将其定向插入真核表达载体pEGFP-Nl 中，构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA 。

经限制性核酸内切酶BglII 和SalI 酶切和DNA 测序鉴定后，用脂质体法将pEGFP-VEGFA 转染HEK293T 细胞，转染后24h 和48h 采用荧光显微镜观察pEGFP-VEGFA 的表达。

结果pEGFP-VEGFA 被双酶切为4697bp 和1251bp 两条条带，测序结果证实VEGFA 序列与GenBank 公布的VEGFA mRNA 序列完全一致。

在经转染的HEK293T 细胞内观察到较强的绿色荧光，表明pEGFP-VEGFA 成功转染HEK293T 细胞，并在其中得到了表达。

结论成功构建重组真核表达载体pEGFP-VEGFA ，为进一步研究VEGFA 基因的生物学功能奠定了基础。

关键词：血管内皮生长因子A ；基因；遗传载体Construction and expression of recombinant eukaryoticexpression vector of VEGFA geneWU Yong 1，LIU Xue-gang 2，GUO Jia-cheng 1，et al（Department of 1．Pediatrics ；2．Cardiothoracic Surgery ，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College ，Bengbu 233004，China ）Abstract ：Objective To construct a recombinant eukaryotic expression vector pEGFP-VEGFA ，and to detect its expression in HEK293Tcells．Methods VEGFA gene was amplified from the total RNA of human umbilical cord blood monocytes by RT-PCR andthen directionally inserted into the eukaryotic expression vector pEGFP-N1in order to construct the recombinant expression vector pEG-FP-VEGFA．The recombinant vector pEGFP-VEGFA was identified by restriction endonuclease BglII and SalI digestion analysis ，and se-quence analysis．The pEGFP-VEGFA was then transfected into the HEK293T cell by lipofectin reagent ，and its expression was detectedby fluorescence microscopy at 24and 48h post-transfection．Results The recombinant vector pEGFP-VEGFA was digested into twobands of 4697and 1251bp．Sequencing results showed that the sequence of VEGFA in pEGFP-VEGFA was identical to GenBank VEG-FA accession number NM_001025366．Strong green fluorescence was observed in the HEK293T cells transfected with the pEGFP-VEG-FA ，which showed that the pEGFP-VEGFA had been successfully transfected into the HEK293T cells and acquired expression．Conclu-sion We successfully construct the recombinant eukaryotic expression vector pEGFP-VEGFA ，which lays a foundation to further study the biological function of VEGFA gene．Key words ：vascular endothelial growth factor A ；gene ；genetic vectors基金项目：安徽省自然科学基金面上项目（No 11040606M198）作者简介：吴勇，男，硕士研究生通信作者：赵武，男，博士，副教授，研究方向：小儿血管疾病的临床与基础研究，E-mail ：zhaowuronghai@yahoo．com．cn ·54·安徽医药Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2013Jan ;17(1)左室流出道梗阻（Left Ventricular Outflow Tract Obstruc-tion，LVOTO）是一类常见的先天性心脏病，占先天性心脏病发病总数的14%，遗传率高达0．71 0．90［1］。

GST-Glypican 3 N端融合蛋白表达载体构建及表达纯化

GST-Glypican 3 N端融合蛋白表达载体构建及表达纯化肖明兵;赵敏星;倪润洲;江枫;周嘉伟【摘要】目的构建人磷酯酰肌醇蛋白聚糖3(Glypican3,GPC3)N端蛋白与谷胱甘肽-S-转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达及纯化.方法以重组质粒pcDNA3.1-GPC3N为模板,扩增GPC3 N端基因,产物经纯化回收后与载体PGEX-4T-1连接并转化大肠埃希菌Rosetta,酶切鉴定序列完全正确者诱导表达GST-GPC3 N端融合蛋白,并以谷胱甘肽琼脂糖小珠亲和纯化.结果 Glypican 3 N 端基因片段成功插入载体PGEX-4T-1,插入位点及碱基序列完全正确,转化Rosetta 后,经IPGT诱导成功表达分子质量为64 000的GST-GPC3 N端融合蛋白.结论成功建立了重组GST-GPC3 N端融合蛋白的原核表达载体、表达菌株及诱导表达和纯化的方法,为GPC3 N端融合蛋白的进一步应用打下基础.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2010(028)003【总页数】3页(P212-214)【关键词】磷酯酰肌醇蛋白聚糖3;载体;克隆;表达【作者】肖明兵;赵敏星;倪润洲;江枫;周嘉伟【作者单位】南通大学附属医院消化病研究室,江苏南通226001;南通大学附属医院消化病研究室,江苏南通226001;南通大学附属医院消化病研究室,江苏南通226001;南通大学附属医院消化病研究室,江苏南通226001;中国科学院上海神经科学研究所,上海200030【正文语种】中文【中图分类】Q78Glypican 3(磷酯酰肌醇蛋白聚糖3，GPC3) 可参与细胞增殖、分化、黏附等, 其异常表达与一些肿瘤关系密切[1-3]。

国内外已相继有表达GPC3 C末端融合蛋白的相关报道，但GPC3 N端融合蛋白的表达国内尚未见报道。

本实验室曾成功构建人GPC3 N端融合基因pcDNA3.1重组载体[4]。

美洲棉铃虫细胞中dsRNA介导的egfp基因沉默分析

美洲棉铃虫细胞中dsRNA介导的egfp基因沉默分析赵淑玲;梁昌镛;李敏;王海花;张高瞻【摘要】为了分析在美洲棉铃虫细胞( HzAM1)内RNAi的效果,将egfp基因克隆到含有双向T7启动子/终止子的质粒载体中,在体外合成全长的增强型绿色荧光蛋白(egfp)基因dsRNA,将dsRNA和含有能在昆虫细胞内表达eGFP的质粒一起转染HzAM1细胞,分析dsRNA对eGFP表达的抑制作用.结果显示,由egfp基因转录的长dsRNA能有效抑制HzAM1细胞内eGFP的表达,而且该抑制作用表现为剂量依赖效应.但是抑制作用并不彻底,在高剂量的dsRNA处理下,仍有部分细胞内能观察到eGFP的表达.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)011【总页数】4页(P130-133)【关键词】RNA干扰;美洲棉铃虫细胞;体外转录;绿色荧光蛋白;昆虫【作者】赵淑玲;梁昌镛;李敏;王海花;张高瞻【作者单位】扬州大学生物科学与技术学院,扬州225009;扬州大学生物科学与技术学院,扬州225009;扬州大学生物科学与技术学院,扬州225009;扬州大学生物科学与技术学院,扬州225009;扬州大学生物科学与技术学院,扬州225009【正文语种】中文RNA干扰(RNA interference，RNAi)是近年来发现在细胞中基因表达沉默的现象[1，2]。

在昆虫细胞中，长段的双链RNA(dsRNA)能通过RNAi从而使得靶基因表达沉默，但是这种长dsRNA对哺乳动物细胞的基因表达干扰是无效的[3]，而大约21 bp的小双链干扰RNA(small/short interference RNA，siRNA)却能沉默包括昆虫和哺乳动物以及其他多类生物细胞的基因表达[4]。

RNAi是一种进化上相对保守的生命现象，其包含多步骤的生化过程:首先通过RNase III核酸内切酶(命名为Dicer)的作用将长dsRNA切割成siRNA。

小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达

小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体的构建及其在鼠巨噬细胞中的表达作者：李娜, 朱道银, 帖儒修, 王瑜伟【摘要】目的: 构建小鼠胞内病原体抗性基因1（Ipr1）基因与EGFP基因融合表达载体, 观察小鼠Ipr1基因在小鼠巨噬细胞株中的表达。

方法: 从C57BL/6J小鼠胸腺组织提取总RNA, 以RT PCR法调取Ipr1基因编码序列, 克隆至pEGFP C1载体中, 筛选阳性克隆作PCR、酶切及测序鉴定后得到pEGFP Ipr1, 脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株, 以空质粒pEGFP C1转染组作为对照。

采用RT PCR法检测Ipr1的RNA水平表达及用激光共聚焦显微镜观察融合蛋白的表达及细胞内定位。

结果: 扩增出小鼠Ipr1基因编码序列, 经PCR、酶切及测序鉴定证明得到正确的重组质粒pEGFP Ipr1, 脂质体瞬时转染小鼠巨噬细胞株得到了成功表达, Ipr1基因表达产物定位于细胞核内。

结论: 成功地调取小鼠Ipr1基因, 构建了小鼠Ipr1基因与EGFP基因融合表达载体并在小鼠巨噬细胞株得到了成功表达。

Ipr1编码蛋白定位于细胞核内, 提示其是一种调节蛋白。

【关键词】 Ipr1基因结核病绿色荧光蛋白定位[Abstract]AIM: To construct an eukaryotic expression vector containing the fusion gene of mouse Ipr1 and EGFP andto study its expression in murine macrophage . METHODS: The coding sequence of Ipr1 gene was amplified from the total RNA of C57BL/6J mouse thymus by RT PCR. The gene was cloned into pEGFP C1 and the recombinant plasmid was identified by PCR, restrict endonuclease digestion and sequencing. Then the pEGFP Ipr1 was transiently transfected into . The expression of Ipr1 gene and fusion protein was detected by RT PCR and laser scanning confocal microscopy. RESULTS: The whole coding sequence of Ipr1 was successfully amplified. The recombinant plasmid was identified by PCR, restrict endonuclease digestion and sequencing. The fusion protein was successfully expressed in the targeted cells and its localization was in nucleus. CONCLUSION: The eukaryotic expression vector pEGFP Ipr1 has been successfully constructed. The fusion protein can be expressed in murine macrophage and located in nucleus.[Keywords]Ipr1 gene; tuberculosis; pEGFP C1; location结核病位居单一病原体引起患者死亡的传染病之首, 全球每年死亡200余万人。