20130423第4次_4章(1)

• 絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其相对分子质量可
高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活 性官能团，包括带电荷的阴离子（如-COOH）或阳离子（ 如-NH2）基团以及不带电荷的非离子型基团。 • 它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附 在胶粒的表面。 • 当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面
密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性 细菌的坚固；
酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和 它的厚度；
由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度 比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。
不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易程度也不同，由难 到易的大致排列顺序为：植物细胞＞真菌（如酵母菌）＞革兰氏 阳性细菌＞革兰氏阴性细菌＞动物细胞。
液中。
一、生物组织的破碎
许多酶存在于细胞内。 为了提取这些胞内酶， 首先需要对细胞进行 破碎处理。 1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶促破碎
非机械破碎
高 压 细 胞 破 碎 机
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
JY92-II D超声波 细胞粉碎机
细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致
(2) 部分纯化 (partially purified): 初步的纯化， 使用各钟 柱层析法。 (3) 均质酶 (homogeneous): 目标酶 的进一步精制纯化，可用 制备式电泳 或 HPLC。
Section 1 酶的提取
细胞发酵产生的酶有两种，一种是胞内酶， 必须对菌体进行破碎，将酶抽提到液相；另一种 是胞外酶，在发酵时酶已经透过细胞壁进入发酵
超速离心机的最大转速达 (2.5～12)×104 r/min，相对离心力可
以高达 5×105 g甚至更高。超速离心主要用于DNA、RNA、蛋白质 等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化；样品纯度的检测；
沉降系数和相对分子质量的测定等。
三、过滤与膜分离 过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质 分离的技术过程。
在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而 使酶与杂质分离 选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所 需的酶，从而使酶与杂质分离
有机溶剂沉淀法
复合沉淀法 选择性变性沉淀法
1、盐析(Salting Out)法
在盐浓度达到某一界限后，酶的溶解度随盐浓度升高
而降低，这称为盐析现象。
有机溶剂提取 可与水混溶的有机溶剂
2、酶提取过程的注意事项
pH的选择 ：首先考虑酶的稳定性；其次应远离等电点；一般选择
pH4-6为宜。 盐的选择：大多数酶在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度，一般选
择等渗盐溶液，如0.02-0.05 mol/L的磷酸缓冲液或0.15 mol/L的
NaCl等。 温度的选择：一般控制在0-4℃，如果酶比较稳定可以例外。 抽提液用量：常采用材料量的1-5倍。 其它：加入蛋白酶抑制剂，半胱氨酸或细胞色素C等，来稳定抽提 系统。
一、根据溶解度不同的分离方法
调整溶解度的分离方法是根据酶和杂蛋白质在溶解度性质上不同而
建立的一些方法。
沉淀分离方法 盐析沉淀法 分离原理 利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过 在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀， 从而使酶与杂质分离
等电点沉淀法
利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质 有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉 淀析出，从而使酶与杂质分离 利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量 的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离
酵母、霉菌、动物细胞、 滤纸、滤布、纤维 植物细胞、固形物等 多孔陶瓷、烧结金 属等 细菌、灰尘等 病毒、生物大分子等 生物小分子、盐、离子 微滤膜、微孔陶瓷 超滤膜 反渗透膜
微滤 超滤
0.2～2μm 20Å～0.2μm
反渗透 < 20Å
借助于一定孔径的高分子薄膜，将不同大小、不同形状和不同特
性的物质颗粒或分子进行分离的技术称为膜分离技术。膜分离所使 用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纤维素、赛璐玢以及尼龙等高分子 聚合物制成的高分子膜。有时也可以采用动物膜等。膜分离过程中， 薄膜的作用是选择性地让小于其孔径的物质颗粒或分子通过，而把 大于其孔径的颗粒截留。膜的孔径有多种规格可供使用时选择。 微滤 超滤 反渗透 电渗析 离子交换膜电渗析
（3）碱溶液提取
（4）有机溶剂提取
酶的主要提取方法
提取方法 盐溶液提取 酸l/L的盐溶 液 pH2～6的水溶液 pH8～12的水溶液 提取对象 用于提取在低浓度盐溶液中溶解度 较大的酶 用于提取在稀酸溶液中溶解度大， 且稳定性较好的酶 用于提取在稀碱溶液中溶解度大且 稳定性较好的酶 用于提取那些与脂质结合牢固或含 有较多非极性基团的酶
酶促法 酶分解作用 具有高度专一性，条件温和，浆液易分离， 非 溶酶价格高，通用性差 机 械 化学渗透法 改变细胞膜的渗透性 具一定选择性，浆液易分离，但释放率较 低，通用性差 法 渗透压法 渗透压剧烈改变 破碎率较低，常与其他方法结合使用
冻结融化法
干燥法
反复冻结-融化
改变细胞膜渗透性
破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物
加压膜分离 膜分离 电场膜分离
扩散膜分离
透析
根据膜材料和不同进料液的特性，商品应用的膜产品
通过细胞本身的酶系或外 加酶制剂的催化作用，使 细胞外层结构受到破坏， 而达到细胞破碎
自溶法 外加酶制剂法
分
类
作 用 机 理
固体剪切作用 液体剪切作用 液体剪切作用 固体剪切作用
适
应
性
珠磨法 机 械 法 高压匀浆法 超声破碎法 X-press法
可达较高破碎率，可较大规模操作，大分 子目的产物易失活，浆液分离困难 可达较高破碎率，可大规模操作，不适合 丝状菌和含有包含体的基因工程菌 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈， 不适合大规模操作 破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏感目 的产物不适合
酶提取
酶分离纯化 酶浓缩
酶贮存
离心分离，过滤分离，沉淀分 离，层析分离，电泳分离，萃 取分离，结晶分离等。
酶分离纯化不同阶段
酶的纯化过程，约可分为 三个阶段：
(1) 粗蛋白质 (crude protein): 采样 → 均质打 破细胞 → 抽出全蛋白， 多使用 盐析沉淀法；可以 粗略去除蛋白质以外的物 质。
在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大
小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法 和离心条件。
常速离心机又称为低速离心机, 其最大转速在8000 r/min以内， 相对离心力（RCF）在1×104 g 以下，在酶的分离纯化过程中，主 要用于细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离。也用于酶的 结晶等较大颗粒的分离。 高速离心机的最大转速为（1～2.5）×104 r/min ，相对离心力 达到 1×104～1×105 g ，在酶的分离中主要用于沉淀、细胞碎片和 细胞器等的分离。为了防止高速离心过程中,温度升高而造成酶的变 性失活,有些高速离心机装设有冷冻装置,谓之高速冷冻离心机。
三、酶溶液的絮凝、净化与脱色
絮凝：由于发酵液黏度较大，细胞表面电荷排斥以及
多糖蛋白质等大分子物质形成的水化层等给酶溶液的离 心或过滤带来困难；因此要用絮凝剂进行处理。絮凝剂 有无机（如醋酸钙和磷酸钙等），有机（如聚丙烯酰胺 等）和天然高分子（如壳多糖等）等多种类型。
絮凝
• 采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。
第四章
酶的提取与分离纯化(1)
酶的提取(extraction)与分离(separation, isolation)纯化(purification): 在适当的条件下将酶从细胞或其它含酶原 料溶解到溶剂（液）中，再与杂质分开，而
获得所需酶制品的技术过程。
酶的提取、分离纯化技术路线
细胞破碎 动物、植物或微生物细胞 发酵液
直接加入固体硫酸铵可以直接查“调整硫酸铵溶液饱和度计算表”。
2．等电点沉淀法
两性物质在其等电点时溶解度最低，因此可通过此方法使不同等 电点的物质分离。
3. 有机溶剂沉淀法（降低介电常数法）
有机溶剂之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有机溶剂的存在会 使溶液的介电常数降低。例如，20℃时水的介电常数为80，而82％ 乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子 间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的 分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏， 也使其溶解度降低而沉淀析出。
蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比较，
计算其破碎率。 导电率测定法
细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。导电
率随着破碎率的增加而呈线性增加 。
二、酶的提取
1、提取的主要方法
大多数酶蛋白是属于球蛋白，因此，可用稀盐，稀碱或稀酸的 水溶液进行抽提；抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的 溶解性 、稳定性以及有利于切断酶与其它物质的连结。 （1）盐溶液提取 （2）酸溶液提取
非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质
过滤
膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质
过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多
孔陶瓷、烧结金属和各种高分子膜等，可以根据需要选 用。
过滤的分类及其特性 (根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同 )
类别 粗滤 截留颗粒大小 > 2μm 截留的主要物质 过滤介质
最常用的是硫酸铵。盐浓度以饱和度表示，饱和盐溶液的饱和度为 100%。调整盐浓度有两种方法：加入饱和硫酸铵溶液（蛋白质溶液体积
不大时）和直接加入固体硫酸铵（蛋白质溶液体积较大时）。