微生物可行性报告

利用植物内生真菌研制抗肿瘤药物

姓名：夏慧颖学号：0220 班级：食品072

1.产品意义和经济效益

近年来,随着各种各样的癌症和对药物具有抗性的病原菌的出现,人类的健康受到严重的威胁。目前针对各种癌症疾病，主要采用手术、化疗、放疗、生物治疗等综合措施，但其疗效难以令人满足。人们更加渴望获得更多新型、疗效更为显著的药物。

紫杉醇作为肿瘤治疗的优良药物已被世人接受,对卵巢癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤具有突出的疗效,。传统靠砍伐红豆衫树木生产紫杉醇已决无可能;而人工种植红豆衫生产紫杉醇, 也遇到成本、生产周期长等一系列难题。所以目前市场上紫杉醇奇缺, 奇贵。1993年,美国蒙大拿州立大学Strobel从短叶紫杉(Taxus breviforlia)分离到一株内生真菌,它能与宿主植物产生同一产物———肿瘤治疗剂紫杉醇,扩大了药用微生物资源的范围,从而植物内生菌的研究开始迅速发展，为微生物生产紫杉醇带来了一线曙光, 并掀起了从内生菌寻找药物先导化合物的热潮。

植物内生菌是一种新的微生物资源,广泛分布于低等植物和高等植物。近年来通过内生菌途径得到的活性物质不仅种类繁多,而且有许多未开发的新化合物,其中一些化合物在抗菌、抗肿瘤、抗病毒等方面有较高的活性,引起广大科学工作者的重视。这对于从天然药用植物中提取有用产物带来的资源短缺、生态平衡破坏,甚至物种灭绝将起到有效缓解作用,也为植物资源的合理利用提供了参考。

2.国内外研究进展

最早提出内生菌概念的是Bary,此后大约100年间,内生菌的研究进展缓慢。直到1993年Stierle等从短叶红豆杉的韧皮部分离得到一株能产生紫杉醇的内生真菌一安德氏紫杉霉, 发现其发酵产物中也能分离出紫杉醇,.随后不断有新的研究报道推出。

2000年, 南京大学等研究发现传统中药青篙内生菌印能够产生新的生物活性物质。国外，Wagenaar等从来源于传统中药雷公藤的内生真菌的培养液中分离出种新的生物碱,并且它们均是具有细胞毒作用的细胞分裂抑素, 实验结果表明它们对多种人肿瘤细胞有很强的抑制作用;同时该项目组成员于2001年从濒临灭绝的薄荷Dicerandra frutescens中分离出的内生菌能产生3种新的具有抗肿瘤活性的二聚物.1999-2003年, 我国学者张玲琪等分别从植物长春花、桃儿七等植物中分离到产抗癌药物长春新碱和鬼臼毒素类似物的内生菌, 从美登木叶中分离到株球毛壳菌, 从该菌的发酵产物中提取出抗癌活性物质球毛壳甲素A。[2]近几年,南京师范大学陈双林等从银杏坛树叶中分离得到一株内生真菌, 经鉴定为刺盘

饱, 应用薄层层析、显色反应及分光光度法对该菌的发酵产物进行了初步分析, 结果表明该真菌能够产生黄酮类化合物。[2]李桂玲等也从药用植物南方红豆杉、、三尖杉和香榧中分离到25株内生真菌对人口腔上皮癌细胞KB和人白血病HL-60细胞具有显著的抑制活性[5]。李洁等从爵床Rostellularia procum bens中分离到2株有较强抗癌活性的细菌YIM 56081和YIM 56077,活性检测表明,2株菌的代谢产物均具有较强的抗癌活性,作者对其进行了形态学特征、生长及生理生化特性、化学分类和系统发育等方面的研究;泰国学者从藤黄属植物中分离出5种内生真菌,并对这些内生真菌产生的65种次生代谢产物活性进行了测定,其中有11. 1%的代谢产物具有抗人肺癌NCI2H187细胞活性,有12. 7%的代谢产物抗人口腔表皮样癌KB细胞。[6]

时至今日，已从云南红豆杉、、西藏红豆杉、、中国红豆杉、南方红豆杉等红豆杉植物树皮中先后分离出多个产紫杉醇或其类似物的内生真菌菌株。我国也从东北红豆杉、尹根、茎、叶中分离获得种内生真菌, 经形态学和ITS分析, 确认分别属于子囊菌亚门的3个属和半子囊菌亚门的23个属, 表明东北红豆杉内生真菌具有丰富的物种多样性, 其中有4个菌种能产紫杉醇。[4]目前，从药用植物内生菌中寻找到的抗肿瘤活性成分至少10种以上,主要有萜类(紫杉醇、紫杉烷等)、生物碱类(长春新碱、细胞松弛素等)、鬼臼毒素类、黄酮类等。[6] 3.生产工艺流程

3.1材料

3.1.1 植物材料。成熟健康云南红豆杉植株

3.1.2 培养基。马铃薯葡萄糖培养基马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂20 g,水1 000ml。[7] 3.2植物内生真菌分离、培养

先用自来水将所采集的红豆杉植物组织表面冲洗干净,晾干水分后分别切取根、茎和叶,采用下述方法进行表面消毒[6]:浓度0. 1%升汞漂洗(10~30 s)→无菌水冲洗数次→浓度75%酒精漂洗(30~60 s)→无菌水冲洗数次。在无菌操作条件下取根、茎和叶,切成0. 2 cm×0.2 cm长段(片),接种于加青霉素的PDA培养基中,在(28±1)℃条件下置于温箱静置培养3~7 d。同时将上述经表面灭菌的材料不经任何处理直接接种于加青霉素的PDA培养基中,在(28±1)℃条件下置于温箱培养,检查表面消毒是否彻底。

对内生真菌,取切口处新长出的菌丝,及时转接至新鲜PDA培养基上。培养数日后,观察菌落的形态及其菌落边缘的整齐情况,并作相应的记录。对菌株编号后,转至新鲜箱斜面培养基上,于28℃培养箱中培养5~7 d,然后放入4℃冰箱保存。

拮抗菌活性测定采用对峙培养法。在超净工作台上进行无菌操作:将直径6 mm的供试病

原真菌的菌块接种于PDA培养基的培养皿中央,再用直径6mm的打孔器在生长7 d左右的内生真菌菌落边缘制备菌饼,并接种于PDA平板上距中心2 cm处同一直线的2点上,对照不接筛选菌,28℃下培养72 h,测量各筛选菌菌落边缘和病原菌菌落边缘之间的抑菌距离,选择拮抗作用明显的菌进行复筛或鉴定。试验重复2次,每次设3个重复。[7]

3.3提高植物内生真菌代谢活性

对能产生紫杉醇的内生真菌——树状多节孢孢子进行一系列的诱变、筛选，获得突变衍生株NCEU-1，其紫杉醇产量为314.07μɡ/L.

利用原生质体诱变获得遗传稳定、高产菌株UL04-5，其紫杉醇产量提高到418.24μɡ/L。

采用双亲灭活原生质体融合方法改良的菌种，其紫杉醇产量可达468.62μɡ/L。[5]

4. 效益分析

我国药用植物种类丰富,其中蕴涵有丰富的可用内生菌资源。目前已从47科83属120余种药用植物中分离出内生菌。这些研究发现掀起了一场从药用植物中分离内生菌的热潮,并且通过利用植物内生菌进行发酵生产得到了某些重要的天然药物,为解决某些药用植物生长缓慢、资源紧缺等引起的药源匮乏和生态破坏问题提供了新思路。将内生菌的研究与药用植物研究相结合,应用生物组合化学的方法进行活性成分的筛选和研究,发现有特色的新的高效先导化合物,提高药用植物活性成分的含量和产量,对推动药用植物的研究开发及中药资源的可持续利用具有重要意义。

5. 参考文献

[1]《植物内生菌活性成分研究进展》邓义熹, 张亚雄，涂璇——安徽农业科学, 2009年 24期

[2]《药用植物内生菌研究概况》崔宇,郑春英,刘松梅，吴丹——黑龙江医药, 2007年 01期

[3]《产生物活性物质植物内生菌的研究进展》李海燕，刘丽——天然产物研究与开发, 2004年 05期

[4]《药用植物内生菌的生物多样性及活性成分》黄宝康，秦路平——药学实践杂志, 2006年 04期

[5]《药用植物内生菌在天然药物开发中的应用》乔卿梅，程茂高，王长林——郑州牧业工程高等专科学校学报, 2008年 01期

[6]《抗肿瘤药用植物及其内生菌活性代谢产物的研究》李端,郭利伟,郭伟云,李延兰——安徽农业科学, 2009年 16期

[7]《云南红豆杉内生菌的分离及拮抗植物病害菌的筛选》郑法新,程璐,李侠,房保海——安徽农业科学, 2009年 24期

[8]《内生菌与天然产物》黎万奎,胡之璧——中国天然药物,2005 ,3

[9]《植物内生菌资源》姜怡,杨颖，陈华红，李文均，徐丽华，刘志恒——微生物学通报, 2005年 06期