一种适用于SSR-PCR的棉花干种子DNA快速简便提取方法

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提取植物DNA方法

提取植物DNA方法植物DNA的提取方法是将植物细胞中的DNA分离出来，以便进行进一步的研究。

以下是常用的植物DNA提取方法：1. CTAB法：CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）是一种表面活性剂，可以溶解脂质，破坏细胞膜，从而释放DNA。

首先，将植物样品粉碎，加入CTAB缓冲液中并进行润湿，然后加入蛋白酶，破坏细胞膜。

接下来，加入CTAB-蛋白酶混合液，室温静置，使DNA与CTAB结合。

之后，将混合液经过苯酚-氯仿提取，将DNA从其他组分中分离出来。

最后，使用异丙醇沉淀法将DNA沉淀，洗涤并溶解。

2. 硅胶柱法：硅胶柱法适用于小规模提取和纯化植物DNA。

首先，将植物样品粉碎，加入提取缓冲液中，并加入蛋白酶进行细胞壁降解。

接下来，将溶有脂质的提取液加载到硅胶柱上，使用重力流动分离DNA。

然后，使用洗涤缓冲液去除残余的污染物。

最后，使用低盐缓冲液将DNA从硅胶柱上洗脱，并收集纯化的DNA。

3. 高盐法：高盐法适用于粗提植物DNA。

首先，将植物样品细碎，加入高盐缓冲液中，其中含有高浓度的盐和蛋白酶。

高盐浓度可以破坏细胞膜，并使DNA 从蛋白质中解离出来。

然后，使用异丙醇沉淀法将DNA沉淀，洗涤并溶解。

4. 快速提取法：快速提取法是一种高效和便捷的方式，适用于大规模提取植物DNA。

首先，将植物样品经过快速研磨处理，将DNA释放到提取缓冲液中。

然后，使用聚乙二醇或盐酸沉淀方法使DNA沉淀，然后洗涤并溶解。

这些方法在植物科学研究中被广泛使用。

在选择提取方法时，需要考虑样品量、样品类型、实验目的和所需纯度等因素。

植物DNA的提取方法的选择也可以根据实验室设备和研究经验进行调整，以获得满意的结果。

需要注意的是，植物样品在提取DNA之前需要进行适当的贮存和处理。

样品应在低温下保存，以保持DNA的完整性。

此外，处理样品时要避免污染和酶解，以确保提取的DNA质量。

棉花DNA提取方法

棉花DNA 提取方法DNA 提取采用CTAB 法(Paterson et al., 1993),并稍加修改，具体步骤如下：(1)将1g 冻叶(或鲜叶)放入预冷的研钵中，加入液氮研磨。

分2次加入5ml 新鲜配制的提取缓冲液(表3-2)，转入10ml 的离心管中，涡旋混匀，冰浴保存10min 。

10000rpm 离心20min (4°C),弃于沉淀中加入3ml 65 C 预热的裂解缓冲液(表3-3)，并用，涡旋混匀，65C 水浴30min ；加入3ml 氯仿：异戊醇(24： 1)混合液，翻转50次以上， 10000rpm 离心20min (15C)，将上清转入10 ml 的离心管中，加0.6 体积的预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10min ，10000rpm ，离心10min (RT )，弃上清，于沉淀中加入2 ml 70%的乙醇洗涤，并转入5 ml 的离心管中，10000rpm 离心5min 。

倒掉上清液，通风干燥 20min ；(4) 加2 ml TE 缓冲液溶解，65C 培养10〜30min ，加等体积的氯仿：异戊醇(24 : 1)，缓慢翻转50次，混匀，室温静置5min ， 10000rpm 离心 10min ；(5) 上清液转入5ml 离心管中，加0.1体积的3M 醋酸钠(pH 5.2)，加等体积的异丙醇后翻转30次，放置30min ， 10000rpm 离心5min 。

弃上清液，加1 ml 70%乙醇洗DNA 小团，转入1.5 ml 的离心管中， 10000rpm 离心5min 。

弃上清液，自然通风干燥DNA 小团；(6) 加 200 l TE 缓冲液(10mM Tris/HCl(PH 8.0)，1mM EDTA(PH 8.0)，PH 8.0)溶解 DNA (4C ，30min 以上)，并保存。

(2)铜丝搅松(3)表3-2 DNA提取缓冲液配制Table 3-2 Extration solutions to extract DNA工作液Working Solution ml ml存储液Stock Solution0.35M Glucose34.68g 6.936g Glucose0.1M Tris.HCl5010.0 1.0M Tris.HCl(pH 8.0)5mM Na.EDTA5 1.00.5M EDTA(pH 8.0) 2% PVP10020.010% PVP 1%(V/V)P-Me5 1.0Liquid dd Water34068.0Total500ml100ml表3-3裂解缓冲液配制Table 3-3 Lysis solutions to extract DNA工作液Working Solution ml Ml存储液Stock Solution1.4M NaCl40.908g8.1816g Salt0.1M Tris.HCl5010 1.0M Tris.HCl(pH 8.0)20mM Na.EDTA2040.5M Na.EDTA(pH 8.0) 2%CTAB1002010% CTAB2% PVP1002010% PVP 1%(V/V)P-Me5 1.0Liquid dd Water22545Total500ml100ml。

SSR标记在棉花遗传育种中的应用

ＳＳＲ标记在棉花遗传育种中的应用摘要SSR是建立在PCR基础上的分子标记，具有多态性高、重复性好、共显性、操作简单等优点，已在棉花研究中被广泛应用。

综述了SSR标记的原理与特点，以及其在棉花遗传图谱构建、功能基因及QTLs定位分析、标记辅助育种、种质鉴定及遗传多样性分析等方面的应用；展望了SSR分子标记技术广阔的应用前景。

关键词SSR；棉花；遗传育种SSR（Simple Sequence Repeats）标记即微卫星标记，是由1~6个核苷酸为单位串联重复而成，长度一般在200bp以下，两端为较保守的单拷贝序列。

通过重复次数不同及重复程度不完全相同而呈现多态性，呈孟德尔式遗传，共显性。

SSR标记广泛存在于基因组的不同位置，根据两侧相对保守的单拷贝序列设计引物，进行PCR扩增，经电泳、显色，便能测出不同个体在某个SSR位点上的多态性，在此基础上进行相应的分析。

棉花基因组中存在丰富的SSR标记，而且分布均匀，检测出的多态性频率较高，已广泛应用于遗传图谱构建、遗传多样性分析、种质鉴定、分子标记辅助选择等方面的研究。

1SSR的基本原理及特点微卫星DNA由两部分组成，即核心序列和两翼的序列，核心序列即前面所称“重复”的短序列，两侧一般是相对保守的单拷贝序列。

在PCR基础上的SSR 分析是根据微卫星DNA两翼区域的序列设计位点专一的引物，以总基因组为模板进行PCR扩增，扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶分离，用放射自显影、银染或荧光进行检测。

这种序列广泛分布于真核生物基因组，其重复次数的不同就产生了等位基因之间的多态性。

由于SSR两端多为相对保守的单拷贝序列，通过设计引物便可以PCR扩增，进行多态性检测。

与其他分子标记相比，SSR有以下优点：①共显性遗传，不易被自然选择和人工选择所淘汰，符合孟德尔遗传定律[1，2]；②多态性高，可通过PCR扩增呈现出来，试验程序简单，重复性高；③SSR序列的两侧序列较保守，在等位基因中多相同，便于重复利用已知引物；④易于检测、重复性好、可进行自动化分析，1个位点一般可在24h内完成，且可同时进行多位点的检测；⑤对DNA质量和数量的要求不高，仅需微量组织便能有效的分析鉴定。

棉花SSR标记种质资源纯度鉴定及遗传多样性分析

棉花SSR标记种质资源纯度鉴定及遗传多样性分析石建斌;周红;王宁;许庆华;乔文青;严根土【摘要】采用前期筛选出的26对SSR核心引物,对收集保存的58份棉花种质资源进行纯度检测和遗传多样性分析.结果显示,供试材料的纯度概率介于20％-90％,分子标记检测结果与田间表型相吻合,说明SSR纯度检测的准确度较高,可以作为进行快速检测棉花种质资源纯度的方法.共扩增出85种多态性基因型,每个标记检测到的基因型数在2-5,平均为3.27个,引物多态性信息量(PIC)介于0.073 7-0.928 1,平均为0.363 9.并利用NTsys-pc 2.10软件进行聚类分析,结果表明,58份种质资源的遗传相似系数(GS)变化范围为0.305 1-0.898 3,变幅为0.593 2,在GS=0.63水平上,将供试材料分为5大类,且这些资源材料的DNA聚类与其地理生态来源无关,而与材料的亲缘关系相关性较高,其聚类结果能更真实地反映种质资源间的遗传差异.【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2018(034)007【总页数】9页(P138-146)【关键词】棉花;种质资源;纯度鉴定;遗传多样性;聚类分析【作者】石建斌;周红;王宁;许庆华;乔文青;严根土【作者单位】中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室,安阳455000;中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室,安阳455000;中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室,安阳455000;中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室,安阳455000;中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室,安阳455000;中国农业科学院棉花研究所棉花生物学国家重点实验室,安阳455000【正文语种】中文棉花作为我国重要的经济作物，在推动国民经济的发展与人民生活水平的提高方面起着重要作用。

随着棉花产业的持续发展，新品种审定速度快、数量多，而骨干亲本数量有限且反复利用导致棉花品种的遗传差异越来越小。

一种适于SSR-PCR的大豆叶片微量DNA简便提取方法

ＳＲＰＲ的ＤＮ快速提取方法，利用一种新的磨样技巧和减少ＤＳ —ＣＡＮＡ提取步骤的方法，以大豆叶片为样品对传统ＣＡＢ法进行改进。结果表明：新的提取方法与传统ＣＴＴＡＢ法相比，具有提取速度快、试剂费用低和不需在
ＡｓｅｈｏｆＥｘｒｃｉｎＥａｙＭｔｄｏｔａｔｎｇＴｉｙＤＮＡｒｍｆｏ
ｔｏｂａａｅｏＳＰＣＲｈｅＳｙｅｎＬｅｖｓｆｒＳＲ—
ＸＩＨａＥｏ，ＣＨＥＮｅｚｎ，ＦＥＮＧｎｇｑｎＸｕ — ｈｅＹｏ — ｉｇ，ＣＨＡＮＧＥ，ＦＡＮＧｎ — ｉｇ，ＷＡＮＧＹｉｇｙｎＬｕ，ＺＨＡＮＧＳｈａ — ｕａｇｏｇｎ（ｐｒｍｅｔｏｌｎｃｅｃｎｃｎｌｇ，ｅｊｇＵｎｖｒｉｆＡｇｉｕｔｒ，ｅｊｇ１２０，ｉａＤｅａｔｎｆＰａｔＳｉｎｅａｄＴｅｈｏｏｙＢｉｎｉｅｓｔｏｒｌｕｅＢｉｎ０２６Ｃｈｎ）ｉｙｃｉ
液氮中磨样等优势。提取的ＤＮＡ可用于大豆ＳＲＰＲ分析。Ｓ —Ｃ关键词：ＤＮＡ；提取方法；大豆文献标识码：Ａ文章编号：１０— １６２０）卜０６—３０２３８（０７００２０
中图分类号：Ｑ０５３
ｑｉｉｇｌｕｄｎｔｏｅｏｐｌｅｉｅｔｅｓｍｐｅｈｎｃｎｅｔｏａｕｒｉｉｉｒｇｎｔｕｖｒｚｈａｌｓｔａｏｖｎｉｎｌＣＴＡＢｍｅｈｄ，ａｄｔｅＤＮＡｅｉｅｎｑｔｏｎｈｄｒｖｄ

一种快速简便的植物病原真菌基因组DNA提取方法

植物病理学报ＡＣＴＡＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡＳＩＮＩＣＡ３５（４）：３６２－３６５（２００５）一种快速简便的植物病原真菌基因组ＤＮＡ提取方法刘少华１’２，陆金萍２，朱瑞良１，戴富明２（１华东师范大学生命科学学院，上海２０００６２；２上海市农业科学院植物保护研究所上海市设施园艺重点实验室，上海２０１１０６）摘要：尿素提取法是最新报道的一种植物拟南芥基因组ＤＮＡ的提取方法，但是还没有应用于植物病原真菌ＤＮＡ的提取。

本研究采用改进的４种不同的方法（尿素提取法、ＣｒＡＢ提取法、氯化苄提取法以及ＳＤＳ—ＣＴＡＢ提取法），分别对５种分类地位不同的植物病原真菌（草莓疫霉病菌、西瓜蔓枯病菌、草莓炭疽病菌、西瓜枯萎病菌和水稻纹枯病菌）的基因组ＤＮＡ进行提取和比较。

结果表明，尿素提取法和ＳＤＳ－ＣｒＡＢ法均能提取到所有５种真菌的基因组ＤＮＡ，而尿素提取法提取ＤＮＡ的效率更高、质量更好，操作步骤更为快速简单。

关键词：植物病原真菌；基因组ＤＮＡ；尿素提取法ＡｒａｐｉｄａｎｄｓｉｍｐｌｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｆｏｒｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｕｎｇｉＬＩＵＳｈａｏ．ｈｕａｌ”，ＬＵＪｉｎ—ｐｉｎ９２，ＺＨＵＲｕｉ—ｌｉａｎ９１，ＤＡＩＦｕ—ｍｉｎ９２（１ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ｔｈｅＥａｓｔＣｈｉｎａＮｏｒｍａｌｕＩｌｉｖｅｒｓ时，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０００６２，Ｃｈｉｎａ；２ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＳｈａｎｇｈａｉＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＳｈａｎｇｈａｉＫｅｙＬａｂｏｆＰｒｏ．ｔｅｃｔｅｄＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１１０６，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＵｒｅａｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｈａｓｂｅｅｎｒｅｃｅｎｔｌｙｒｅｐｏｒｔｅｄａｓａｍｅｔｈｏｄｏｎｌｙｆｏｒｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ，ｗｈｉｃｈｈａｓｎｏｔａｐｐｌｉｅｄｉｎｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｏｆｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｕｎｇａｌＤＮＡ．Ｉｎｔｈｉｓｐａｐｅｒ，ｆｏｕｒｋｉｎｄｓｏｆｅｘｔｒａｃ—ｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ（ｍｏｄｉｆｉｅｄｕｒｅａ，ＣＴＡＢ，ｂｅｎｚｙｌｃｈｌｏｒｉｄｅａｎｄＳＤＳ—ＣＴＡＢ）ｗｅｒｅａｐｐｌｉｅｄｔｏｅｘｔｒａｃｔｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｏｆｆｉｖｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｕｎｇｉ（Ｐ缈ｔｏｐｈｔｈｏｒａｆｒａｇａｒｉａｅ，Ｄｉｄｙｍｅｌｌａｂｒｙｏｎｉａｅ，Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍｆｒａ—ｇａｄａｅ，Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍｆ．ｓｐ．ｃｕｃｕｍｅｒｉｒｕｍ，Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｏｌａｎｉ）ａｎｄｔｈｅｙａｒｅａｓｓｅｓｓｅｄｏｎｓｉｍｐｌｉｃｉｔｙ，ｒａ－ｐｉｄｉｔｙａｎｄｅｆｆｉｃａｃｙ．ＲｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｕｒｅａｍｅｔｈｏｄｈａｄｂｅＲｅｒｅｆｆｉｃａｃｙ，ｓｉｍｐｌｅｒ，ｍｏｉｌｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔｐｒｏｃｅ—ｄｕｒｅａｎｄｂｒｏａｄｅｒａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｆｕｎｇｉ；ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ；ｕｒｅａｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ文章编号：０４１２－０９１４（２００５）０４－０３６２－０４国内外用于真核生物基因组ＤＮＡ提取的方法很多，植物病原真菌基因组ＤＮＡ提取主要借鉴植物基因组ＤＮＡ的提取方法，然而，有些方法试剂昂贵或者步骤繁琐。

棉种质量安全之真实性和纯度SSR分子检测研究进展

棉种质量安全之真实性和纯度SSR分子检测研究进展作者：王飞来源：《种子科技》2018年第12期摘要：目前我国棉花品种多、乱、杂现象较为严重，对棉农收益和棉花品质造成不利影响。

田间种植鉴定已不能完全满足棉种质量管控的需求。

SSR检测技术可以从分子水平给予每个棉花品种唯一的“身份证明”，成为棉种鉴定较先进的技术和发展趋势。

简要介绍了SSR分子检测在棉花品种鉴定中的研究进展，同时探讨了SSR分子检测技术还存在的一些问题，希望对以后的研究有所参考。

关键词：棉种;SSR分子检测;品种鉴定;研究进展文章编号： 1005-2690（2018）12-0108-02 中图分类号： S562 文献标志码： B长久以来，棉种的纯度与真实性鉴定停留在一些传统方法上，如田间种植鉴定法，其需要投入大量的物力、人力，且时效性差，易受人为和环境的影响，制约了对棉种的质量管控。

随着分子生物学技术的发展，利用SSR分子检测技术进行品种真伪与纯度鉴定已成为发展趋势，国际植物新品种权保护联盟在分子测试指南中，将构建DNA指纹数据库的标记方法确定为SSR[1]。

1 SSR分子标记原理SSR（简单重复序列，Simple Sequence Repeat）是由几个核苷酸组成的短序列首尾连接重复多次构成，在作物DNA中串联重复排列[2]。

每个SSR侧翼序列通常是同一作物品种中相对保守的单拷贝序列，由该序列可设计出一对互补寡聚核苷酸引物，再经过SSR-PCR扩增，其产物通过电泳检测可显示出不同品种间重复次数的差异。

2 研究进展2.1 检测体系的优化SSR分子技术鉴定棉种的真实性和纯度的一般步骤分为棉种DNA提取、PCR扩增、PAGE凝胶电泳及银染。

在棉种DNA提取方法上，宋国立等[3]提出了改良的CTAB法，该法能够较好地去除DNA中的棉酚、单宁等物质。

高文伟等[4]采用改良的SDS-CTAB法，不需要多次酚-氯仿抽提，得到了高质量的棉花DNA，是一种高效简洁的DNA提取法。

种子企业应用SSR分子标记鉴定棉花品种真实性和种子纯度

利用SSR分子标记鉴定棉花品种真实性和种子纯度在企业中的应用黄殿成1王飞2刘建功1,2 刘金海1 周关印1,2 李根源1 张西岭1(1中国农业科学院棉花研究所，河南安阳455001；2中棉种业科技股份有限公司，郑州450001)中文摘要：本文阐述利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度的基本原理，剖析中棉种业科技股份有限公司利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度的实践过程，指出利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度在企业中发挥的作用。

品种真实性和种子纯度是种子质量最重要的指标。

传统的通过田间小区种植利用形态特征鉴定种子纯度的方法，具有周期长、易受环境和人为因素影响、属于事后控制等缺陷，与种子企业需要快速检验结果的要求不相适应，难以有效消除种子企业的质量风险。

近年来，随着分子生物学技术的迅速发展，利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度的技术逐步成熟，中棉种业科技股份有限公司（以下简称中棉种业）在利用分子标记鉴定棉花品种真实性和种子纯度的反复实践中，逐步形成了自己的检验规程，在企业经营中发挥了较好作用。

1 利用SSR分子标记鉴定品种真实性和种子纯度的基本原理生物的基因组中，特别是高等生物的基因组中含有大量的重复序列，根据重复序列在基因组中的分布形式可将其分为串联重复序列和散布重复序列。

其中，串联重复序列是由相关的重复单位首位相连、串联排列而成的。

目前发现的串联重复序列主要有两类：一类是由功能基因组成(如编码rRNA和组蛋白基因)；另一类是由无功能的序列组成。

根据重复序列的重复单位的长度，可将串联重复序列分为卫星DNA、微卫星DNA、小卫星DNA等。

微卫星DNA又叫简单重复序列，指的是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复多次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下。

研究发现，微卫星中重复单位的数目存在高度变异，这些变异表现为微卫星数目的整倍性变异或重复单位序列中的序列不完全相同，可表现出多个位点的多态性。

适用于SSR—PCR试验的水稻基因组DNA提取方法的比较

适用于SSR—PCR试验的水稻基因组DNA提取方法的比较摘要:为了寻找操作简便､耗时短､成本低的适用于简单重复序列-聚合酶链式反应(SSR-PCR)试验的水稻基因组DNA提取方法,试验以3种类型的水稻样品(叶片､米粒､米粉)为材料,比较了十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法､试剂盒法､蔗糖法､碱法4种基因组DNA提取方法对水稻基因组DNA提取质量的影响｡结果表明,CTAB法提取的叶片､米粒和米粉的基因组DNA含量最高,其次为试剂盒法提取的叶片､米粉和碱法提取的米粉的基因组DNA含量｡通过4种方法得到的水稻基因组DNA纯度均不高,但不影响后续的SSR-PCR试验｡SSR-PCR结果表明,CTAB法､试剂盒法和碱法提取的3种样品类型的水稻基因组DNA的扩增均表现出了良好的重复性｡其中试剂盒法的提取成本最高,CTAB法耗时最长｡整体而言,碱法是最适合水稻SSR-PCR试验的基因组DNA提取方法,且以米粉为提取材料时效果最佳｡关键词:水稻;基因组DNA;提取方法水稻(Oryza sativa L.)是世界上三大粮食作物之一,中国的稻田面积占世界稻田面积的22%[1]｡在水稻和其他大多数作物中,以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术为基础的分子标记分析如简单重复序列(Simple sequence repeat,SSR)标记由于其具有多态性好､可靠性高､技术简单､价格便宜和DNA模板使用量低等优点,在分子生物学技术中得到了广泛的应用｡DNA提取是SSR-PCR 分析的前提｡在这一研究中,往往要对几十个乃至几百个样品提取的基因组DNA 进行SSR分析｡这就需要进行大量的DNA提取工作,而常规DNA提取过程比较复杂,是分子标记分析效率提高及成本降低的关键性因素[2]｡事实上,针对SSR的PCR技术对DNA质量的要求不是很高,运用一些简单快速的方法获得的基因组DNA就可以满足其需要｡因而发展简便快速提取基因组DNA的方法就显得尤为重要｡目前,国内外已建立了多种基因组DNA的提取方法,这些方法因所研究的对象和目的不同而有一定的差异,主要是十六烷基三甲基溴化铵(Cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)法､碱法和蔗糖法等,并且多数方法是基于叶片的基因组DNA提取为前提[3-7],所以基于种子基因组DNA的提取方法也日益受到研究者的重视[8],但基于米粉的基因组DNA提取方法却鲜有报道｡试验比较了以3种类型的水稻样品(叶片､米粒､米粉)为材料的4种基因组DNA提取方法(CTAB法､试剂盒法､蔗糖法､碱法)提取的基因组DNA浓度和质量,并分析了SSR-PCR检测结果,试图找出操作简便､耗时短､成本低的水稻基因组DNA提取方法｡1 材料与方法1.1 材料水稻品系为K478､K480､K482,由湖北省农业科学院粮食作物研究所提供;将试验里进行基因组DNA提取的样品类型分为3类:A,正常条件下发芽7 d的水稻幼嫩叶片样品;B,单株种子样品;C,1粒去壳的水稻种子经植物球磨仪研磨后所得到的米粉样品｡1.2 DNA提取方法1.2.4 方法4 参考植物基因组DNA提取试剂盒的操作手册里提取与纯化基因组DNA的有关方法,将3种样品进行相关处理,得到可以用做PCR模板的材料溶液｡2 结果与分析2.1 核酸蛋白检测仪检测水稻基因组DNA纯度与含量2.2 SSR-PCR扩增以4种方法提取不同材料类型的3个水稻品系DNA为模板,选取2对SSR引物RM336和RM297扩增水稻的DNA样品,结果见图1､图2｡从图1､图2可见,4种方法提取的水稻基因组DNA大多数都扩增出了电泳条带,虽然不同样品的质量及浓度明显不同,而且所有样品都存在不同程度的污染现象,但这些因素显然没有对PCR扩增造成明显的影响｡引物RM336和RM297扩增的带型在某些样品间存在一定差异,能够反映出这些样品的基因型不同,说明4种方法提取的水稻基因组DNA完全能满足SSR-PCR分析的需要,可用于种子真实性和纯度的快速鉴定｡其中CTAB法､碱法和试剂盒法提取不同材料类型的水稻基因组DNA扩增结果都得到了较好地重复,说明这3种方法提取的水稻基因组DNA用于SSR-PCR试验结果稳定;而蔗糖法的扩增成功率则低于其他3种方法,说明蔗糖法提取的水稻基因组DNA含量偏低｡2.3 4种DNA提取方法的成本分析3 小结与讨论SSR分子标记具有数量丰富､多态性高､结果稳定可靠等优点,因此在作物品种纯度鉴定[13]､遗传多样性分析[14]等方面得到了日益广泛的应用｡虽然SSR分子标记技术对模板DNA纯度和含量的要求不高,但是高质量的DNA是检测结果稳定可靠并有较高重复性的有力保障｡目前,DNA提取方法种类繁多,有传统的SDS 法､CTAB法,简化后的碱法和蔗糖法等,但在效率上仍然有改进的空间｡尤其是对大批量的水稻样品进行SSR分析时,需要寻找一种操作简便､耗时短､成本低且又能保证扩增质量的最适水稻基因组DNA提取方法｡因此有必要在现有基础上进一步简化和比较各种提取方法｡通过比较CTAB法､试剂盒法､蔗糖法､碱法提取的水稻基因组DNA,发现以CTAB法提取的水稻叶片､米粒和米粉的水稻基因组DNA含量最高,其次是试剂盒法提取的叶片､米粉和碱法提取的米粉的水稻基因组DNA含量较高,反映出最大限度地使水稻样品均匀分散而得到的米粉样品成为了提取DNA最佳的材料形态｡同时发现4种方法提取的DNA纯度均不高,其中以试剂盒法和CTAB法较好,原因可能是碱法和蔗糖法在提取DNA时只保留了裂解组织､DNA沉淀和溶解等主要步骤,而摒弃了蛋白质和有机物清除等中间步骤,导致提取的DNA中存在蛋白质､糖类､有机物小分子等物质的污染,进而降低了纯度｡SSR-PCR结果显示,CTAB法､试剂盒法和碱法提取不同类型材料的DNA扩增结果都得到了很好地重复,说明这3种方法提取的DNA用于SSR试验结果稳定｡但其中试剂盒法的提取成本很高,提取每100个样品的成本高达572.08元,远远高于其余3种方法;而CTAB法耗时很长,提取每个样品的时间是耗时最短的碱法的7倍左右｡综上可知,碱法提取水稻基因组DNA是4种方法中性价比最高的方法,尤其以米粉作为材料提取DNA效果最佳｡该方法制备模板操作时间短､效率高､重复性好､成本低,并且制备过程无需使用有机溶剂,可避免有机试剂对人体的毒害作用｡因此,用碱法快速地从大量样本中提取水稻基因组DNA进行PCR扩增,可广泛地应用于水稻基因组DNA分子标记相关的科学试验及生产实践中｡参考文献:[1] 盖钧镒.作物育种学各论[M].北京:中国农业出版社,2006.27-33.[2] XIN Z, VELTEN J P, OLIVER M J, et al. High-throughput DNA extraction method suitable for PCR[J]. Bio Techniques,2003,34(4):820-826.[3] 桑贤春,何光华,张毅,等.水稻PCR扩增模板的快速制备[J].遗传,2003,25(6):705-707.[4] 汪秀峰,杨剑波,向太和,等.一种叶片直接用作PCR扩增的新方法及其应用[J].中国水稻科学,2002,16(1):67-70.[5] 邱福林,王和和,陈洁,等.用于水稻突变体大量筛选的DNA 微量快速提取法[J].中国水稻科学,2006,20(3):329-332.[6] IKEDA N, BAUTISTA N S, YAMADA T, et al. Ultra-simple DNA extraction method for marker-assisted selection using microsatellite markers in rice[J]. Plant Molecular Biology Reporter, 2001,19(1):27-32.[7] COLLARD B C Y, DAS A, VIRK P, et al. Evaluation of ‘quick and dirty’ DNA extraction methods for marker-assisted selection in rice(Oryza sativa L.)[J]. Plant Breeding,2007,126(1):47-50.[8] GAO S, MARTINEZ C, SKINNER D, et al. Development of a seed DNA-based genotyping system for marker-assisted selection in maize[J]. Molecular Breeding,2008,22(3):477-494.[9] 彭锁堂,颜启传,王学德,等.水稻单粒种子DNA提取及RAPD程序优化研究[J].上海交通大学学报(农业科学版),2002, 20(1):34-41.[10] 楼巧君,陈亮,罗利军.三种水稻基因组DNA快速提取方法的比较[J].分子植物育种,2005,3(5):749-752.[11] 闫双勇,苏京平,王胜军,等.一种同时适用于水稻种子和叶片的简单快速提取方法[J]. 中国稻米,2011,17(5):11-13.[12] 宋丰顺,倪大虎,陆徐忠,等.水稻单粒种子DNA的快速制备及PCR分析[J].安徽农业科学,2007,35(21):6371-6372.[13] 苏顺宗,黄玉碧,杨俊品,等.利用SSR鉴定水稻杂交种子纯度的研究[J].种子,2003,22(1):23-25.[14] 王金花,罗文勇,陈建伟,等.应用SSR和ISSR标记分析栽培香稻品种的遗传多样性[J].分子植物育种,2005,3(1):37-42.。

利用SSR标记鉴定抗虫三系杂交棉邯杂301的纯度

利用SSR标记鉴定抗虫三系杂交棉邯杂301的纯度摘要：三系杂交棉邯杂301在黄河和长江流域得到了大面积的推广，目前生产上仍然采用鉴定周期长，不能及时反映杂交种纯度，难以指导生产应用。

本研究利用ssr分子标记技术，从196对引物中筛选到3对在双亲间表现稳定多态性的引物，可以快速准确的鉴定出该品种的杂交种纯度。

与常规方法相比，准确率达到98%以上。

关键词：棉花； ssr；杂交种纯度中图分类号：s562 文献标识码：a由邯郸市农业科学院培养成功的国审棉邯杂301三系杂交棉在长江和黄河流域得到了大面积推广，杂种优势在生产上表现的十分明显，其不但产量高、品质好，且抗虫抗病能力强，深受棉农喜爱。

在种子生产过程中，由于播种、收获和脱绒等诸多环节的存在，以及部分不良农户掺假使假，造成种子混杂，给棉花生产带来巨大损失；亲本选育世代长短一定程度上影响品种基因型纯合度，使杂交种植株间从表型或者基因型上产生差异。

目前，ssr分子标记已经广泛应用小麦[1]、大麦[2]和棉花[3]等农作物杂交种纯度鉴定，为广大科研工作者所认可，是一种成本较小、程序简便、结果可靠的实用技术。

1 材料和方法1.1 供试材料三系杂交种邯杂301 种子及其亲本（恢复系父本♂和不育系母本♀）均由本课题组提供。

1.2 试验方法1.2.1 dna提取采用宋国立改良ctab法提取dna，dna用te溶液溶解，利用1%琼脂糖凝胶电泳和nanodrop 2000c检测后稀释到100ng/ul备用。

1.2.2 ssr及其产物检测ssr引物根据潘兆娥[2/3]研究结果，参考http：//网站中提供的引物信息，从196对引物中筛选出分布于不同染色体上、带型清晰、在双亲间表现出稳定多态性的3对引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

pcr 反应体系为20ul，其中2x tag master mix 10ul，rnase free water 8ul，模板1ul，上下游引物各0.5ul（20um）。

一种鉴定常规棉花品种真实性的SSR分子标记方法[发明专利]

专利名称：一种鉴定常规棉花品种真实性的SSR分子标记方法专利类型：发明专利
发明人：艾先涛,李雪源,王俊铎,郑巨云,梁亚军,龚照龙,郭江平,王欣怡,买买提·莫明,吐尔逊江,多力坤,赵鑫,赵志
信,帕孜莱姆
申请号：CN201710174080.6
申请日：20170322
公开号：CN107312827A
公开日：
20171103
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明属于生物技术领域，公开了一种鉴定常规棉花品种真实性的SSR分子标记方法，包括：样品的制备；以基因组DNA为模板，用26对SSR核心引物进行PCR扩增，将PCR产物进行8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到待检测样品的电泳图谱；将每份待检测样品的电泳图谱与得到的标准样品的电泳图谱进行比较，如待检测样品与标准样品的谱带组成或带型一致，则待检测种子与标准种子为同一品种，得出待检测种子的真实性。

本发明结果稳定可靠、操作简单、经济高效，相比形态学鉴定法具有高效准确、省时省力、不受季节限制等优点，展示了较好的应用前景，更好地服务于生产实践中常规棉花品种真实性的鉴定和评价。

申请人：新疆农业科学院经济作物研究所
地址：830091 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市沙依巴克区南昌路403号
国籍：CN
代理机构：北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：汤东凤
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ｏｏｄｑａｉ．ｎａａｉｆｅｎｅｆＳＲ— ＣＲ．ｈｓａｉｎｆｃｉｅＤＮＡｘｒｃｉｎｍｅｈｄｐｏｉｅｆｏｕｌａｄｃｎｓｔｙｔｅｄｏＳＰｇｙｔｓｈＴｉｐｄａｄｅｅｔｒｖｅｔａｔｔｏｒｖｄｓａｏ
分子植物育种，００年，８卷，５期，９１９６页２１第第第８—８
ＭｏｅｕａＰａｔｒｅｉｇ２０Ｖｏ．，．，８ — ８ｌｃｌｒｌｎＢｅｄｎ，０１，１Ｎｏ５９１９６８
技术改进
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ＤＯＩ１３６／ｂ．０．０：０．９９ｍｐ０８００９８１
ＡｂｔａｔＩｉｓｕｙａｓｒｃｎｔｓｔｄ．ｎｉｒｖｄＳｅｈｄｆｒｈｍｐｏｅＤＳｍｔｏｏＤＮＡｘｃｉｎｆｏｃｔｎｄｙｓｅｓｓｄｖｌｐｄＴｈｅ仃ａｔｍｏｔｒｅｄｅｅｏｅ．ｅｏｒｏｗａ
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ＬｉｅＺｈｏｅｕｆｎｇ ‘ ａｐｉＸｕＺｉｈｃｕＺｈａｇａｎｎ
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ＫｅａｏａｏｙｏＣｒｐＢｉｌｇ，ｌｇｆｒｎｍｙＳａｄｎｙＬｂｒｔｒｆｏｏｏｙＣｏｌｅｏＡｇｏｏ，ｈｎｏｇＡｇｉｕｔｒｅｒｃｌｅＵｎｖｒｉ，ｉｌ２７０８ｕｉｅｓｔＴａ’ ｌ１１ｙａ，
Ｃｏｒｓｏｄｎｔｏ，ｄｕ０＠１３ｃｍｒｅｐｎｉｇａｈｒｓａ１６６．ｕｏ
ＤＡ，合棉花ＳＲＰＲ反应对ＤＮＡ质量的要求。本研究为棉花ＳＲ分析建立了一种快速、便的干Ｎ符Ｓ－ＣＳ简种子ＤＮＡ提取方法，ＳＲ标记在棉花遗传育种研究中的应用奠定了基础。为Ｓ关键词棉花，干种子，ＤＳ法，ＮＡ提取，Ｓ－ＣＳＤＳＲＰＲ
ห้องสมุดไป่ตู้
ＤＮＡ提取是植物分子生物学研究的重要技术ｗｏｇｅ等（９３发明了从水稻和小麦中用半粒种子ｎｓｔ９）
环节之一，高质量ＤＮＡ的提取是保证实验结果可提取ＤＮＡ，ｄｎｌ（９４、ａｇ等（９８、琦Ｍｃｏａｄ等１９）Ｋｎ１９）魏靠性和重复性的关键。最常见的植物提取基因组超等（０９￣Ｓａｚｄ（００也相继从花生、豆、２０）ｈｈａｉ２１）大
１ＳｎｏｇＥｎｉｅｒｎｓａｃｎｅｏｈａｄｎｇｎｅｉｇＲｅｅｒｈＣｅｔｒｒｆＯｐｅｌｎｓｕｔｒ，ｈｎｏｇＸｉｑｕＳｅｃｅｃｎＰａｔｓｅＣｕｌｅＳａｄｎｎｉｅｄＳｉｎｅ＆ＴｅｈｏｏｙＣｏ，ｄＤｅｈｕ２３０；ｔｔＴｉｕｃｎｌｇ．Ｌｔ．ｚｏ，５２０２Ｓａｅ
摘
要
利用改良的ＳＤＳ法提取棉花干种子的基因组ＤＮ所得基因组ＤＡ，ＮＡ经分光光度计、脂糖凝琼
胶电泳和随机ＳＲ引物扩增效果检测，结果表明利用改良的ＳＳＤＳ法直接所提取棉花干种子的基因组
ｑｌｔｕａｉｙＯｆＤＮＡｂａｎｄｆｏ３ｏｔｎｕｔｖｒｓｅｌａｅｎｔｒｓｏｅＥｐｐｎｏｆＢｉＰｈｔｍｅｅｎａｙｏｔｉｅｒｍ２ｃｔｏｃｌｉａｓｗａｖａｕｔｄｉｅｍｆｔｈｅｄｒｏｏｏｔｒａｌ —
ｏｎａｉｅａｐｉｔｆＲｃｔｎｈｒｄｔａｄｂｅｄｎｅｅｒｈｆｕｄｔｎｆｒｈｐｌａｉｎｏＳｉｏｏｅｅｉｎｒｅｉｇｒｓａｃ．ｏｏｔｃｏＳｎｙＫｅｗｏｄＣｏｏＤｒｅｄ，ＳｔｏＤＮＡｘｒｃｉｎＳＰｙｒｓｔｎ，ｙｓｅｓＤＳｍｅｈｄ，ｅｔａｔ，ＳＲ．ＣＲｏ
一
种适用于ＳＲＰＲ的棉花干种子ＤＳ —ＣＮＡ快速简便提取方法
刘峰１赵佩２徐子初・张娜： ’
１山东省开放式植物组培工程技术研究中心，山东鑫秋种业科技有限公司，德州，５２０２作物生物学国家重点实验室，２３０；山东农业大学农学院泰安，７０８２１１通讯作者．ｄｕ０＠１３ｃｍｓａｌ６６．ｏ