胃癌患者外周血miR-183水平的临床意义

76上海交通大学学报（医学版）2017, 37 (1)1对象与方法1.1 研究对象①胃癌组：收集2013年1月—2014年6月上海交通大学医学院附属瑞金医院卢湾分院收治的76例胃癌患者血清样本，其中男性53例，女性23例，年龄27～85岁，中位年龄62岁。

所有患者均有明确的细胞学诊断，手术前未经任何放射治疗、化学治疗及内分泌治疗，手术后有完整的临床及病理资料。

排除严重肝肾疾病、内分泌代谢疾病及其他结缔组织病。

其中TMN分期Ⅰ期15例、Ⅱ期10例、Ⅲ期30例、Ⅳ期21例。

②对照组：选取同期26例体检正常者血清样本作为对照，其中男性16例，女性10例，年龄47～85岁，中位年龄59岁。

本研究获得医院伦理委员会批准，并征得患者及家属的知情同意。

2组性别和年龄经均衡性检验，差异无统计学意义，具有可比性。

1.2 方法1.2.1 主要试剂和仪器 TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；All-in-One TM miRNA qRT-PCR检测试剂盒、U6、miR-183引物购自美国GeneCopoeia公司；无水乙醇、甲醇、异丙醇、氯仿、盐酸均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2.2标本的采集和处理术前及术后5 d（未行化学治疗）清晨抽取空腹静脉血2 mL，迅速转入不含乙二胺四乙酸的普通试管中，在室温（22～25 ℃）下静置15～30 min，至血液完全凝固，吸取上清液至洁净的离心管中，4 ℃ 1 500×g离心5 min，吸取上清液，4 ℃12 000×g离心5 min，进一步去除残留的血细胞，离心后收集血清置于-80 ℃保存。

1.2.3总RNA的提取将收集的血清装入加有1 mL TRIzol的EP管，静置5 min，加氯仿0.2 mL，混匀静置5 min，4 ℃ 12 000×g离心15 min，吸取上清液，加入0.5 mL异丙醇，静置15 min，4 ℃ 12 000×g离心15 min，可见RNA沉淀，弃上清液，加75%乙醇1 mL混匀，4 ℃ 7 500×g离心5 min，弃上清液，加入无RNase水溶解RNA沉淀。

1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度[8]。

1.2.4 qRT-PCR检测miR-183的表达取总RNA 2 μg进行反转录，反应条件：16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃10 min。

取 2 μL反转录产物cDNA进行实时定量PCR 反应，反应条件：50 ℃预热2 min；95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃延伸1 min，共40个循环；95 ℃终延伸15 s。

以上各步骤中，反应体系以及试剂用量均严格按照说明书进行。

以U6作为内参，采用2-ΔΔC t比较各组间miR-183的水平差异[9]。

1.3 统计学方法采用Graghpad Prism 6统计软件进行分析。

组间比较采用Mann-Whitney U检验分析或非配对t检验，受试者工作特征（ROC）曲线用于分析miR-183在预测胃癌发生和转移时的敏感度及特异度。

P< 0.05表示差异具有统计学意义。

2结果2.1 miR-183在胃癌患者和对照组血清中的水平miR-183 在胃癌患者血清中的水平显著高于对照组血清（4.798±0.267 vs 0.904±0.067，P=0.000），有转移的患者（淋巴结转移或远处转移者）显著高于无转移患者（4.032±0.465 vs 5.152±0.316，P=0.045），见图1。

注：A. 胃癌患者组与正常对照组比较；B. 有转移的胃癌患者与无转移的胃癌患者比较。

图1胃癌患者与正常人群的miR-183水平Fig 1 Levels of miR-183 in the gastric cancer patients and normal controlAB2.2 miR-183 的水平与胃癌临床病理特征间的关系在胃癌患者外周血中，miR-183水平与患者年龄、性别、肿瘤分化程度无明显相关性（P>0.05）；与肿瘤浸润深度、有无淋巴结转移或远处转移及TNM分期有关（P<0.05）。

肿瘤浸润深度深、有淋巴结或远处转移、分期较晚的患者外周血miR-183表达水平较高（表1）。

772.3 miR-183预测胃癌发生的价值ROC 曲线分析结果显示，miR-183预测胃癌发生时，其ROC 曲线下面积（AUC ）为0.978（95% CI 为0.955～1.001，P =0.000）。

诊断界值为1.535时，敏感度为93.42%（95% CI 为0.853 1～0.978 3），特异度为92.31%（95% CI 为0.748 7～0.990 5）（图2）。

图2 miR -183预测胃癌发生的ROC 曲线Fig 2 ROC curve of miR-183 for predicting gastric cancer2.4 miR-183预测胃癌转移的价值为了进一步评价miR-183预测肿瘤转移的价值，ROC 曲线分析结果显示，miR-183在预测淋巴结或远处转移时，其AUC 值为0.643 （95% CI 为0.507～0.780，P =0.045）。

诊断界值为4.225时，敏感度为67.31%（95% CI 为0.529 0～0.796 7），特异度为58.33%（95% CI 为0.366 4～ 0.778 9）（图3）。

表1 miR-183 的水平与胃癌患者临床病理特征间的关系（x —±s ）Tab 1 Relationship between miR-183 level and the clinicopathological characteristicsof gastric cancer patients (x —±s)年龄 ≤62岁41 4.854±0.364 0.821＞62岁354.732±0.398性别 男53 4.505±0.329 0.104女235.473±0.425肿瘤分化程度 分化好19 4.126±0.5110.184分化差575.022±0.309浸润深度 T1～T220 3.899±0.515 0.043T3～T4565.119±0.303淋巴结转移 无24 4.032±0.4650.045有525.152±0.316远处转移 无52 4.210±0.304 0.003有246.072±0.432TNM 分期 I ～Ⅱ25 3.774±0.424 0.006Ⅲ～Ⅳ515.300±0.318图3 miR -183预测胃癌转移的ROC 曲线Fig 3ROC curve of miR-183 for predicting gastric cancer metastasis3 讨论研究发现miRNA 通过发挥类似于癌基因或抑癌基因的功能，调节肿瘤发生、发展[10-12]。

如成年型B 细胞慢性淋巴细胞白血病患者常有miR-15a 和miR-16a 基因簇的缺失或表达下调，提示miRNA 可以起到抑癌基因的作用[13]；肺非小细胞癌CL1-0中，上调的miR-372通过作用于靶基因的肿瘤抑制基因同源物2（LATS2）而促进肿瘤的发生[14]；miR-31在肺癌细胞中通过直接作用于LATS2和蛋白磷酸酶2A 亚基B 的异构体R2-α（PPP2R2A ），抑制肺癌的发生[15]。

不同肿瘤的miRNA 谱往往不同[16]。

Laios 等[17]发现，与原发性卵巢癌组相比，复发性卵巢癌组中有60个miRNA 水平变化>2倍，其中上调最为明显的是miR-223，下调最为明显的是miR-9，推测在复发性卵巢癌中miR-9为肿瘤抑制基因，并且提出miR-223和miR-9可能成为复发性卵巢癌重要的标志物。

Hu 等[18]检测了55例进展期卵巢癌患者96个miRNA 的水平，发现miR-200a 与卵巢癌生存率相关。

大量研究证实，miRNA 在乳腺癌[19]、肝癌[20]、胃癌[21]、胰腺癌[22]、结直肠癌[23]等多种恶性肿瘤中表达失调。

miRNA 谱的特异性为肿瘤的筛查、诊断、治疗提供了新的思路[24]。

2008年，Mitchell 等[5]首次发现miRNA 能以一种非常稳定的形式存在于人体血浆中，其主要来自组织细胞的主动分泌过程[5]，成熟的miRNA 在细胞内被脂质或脂蛋孙 颖，等 胃癌患者外周血miR-183水平的临床意义78上海交通大学学报（医学版）2017, 37 (1)白包被成外切酶体（exosome），分泌至胞外并进入血液，去掉包被，释放出miRNA发挥其生物学功能。

Chen等[6]通过高通量测序技术（Solexa技术）对血清中miRNA进行了分析，在健康男性和女性血清中分别发现了100余种和90余种miRNA。

且血清或血浆在部分极端条件（如高温、极低或极高的pH环境、多次冻融等）下，miRNA仍能保持稳定[5,7]。

外周血miRNA的水平不存在明显的性别差异，也不存在显著的个体差异[6]，便于设定参照值以进行检测对比。

如弥漫性大B细胞淋巴瘤患者血清中miR-21的水平明显上调，且miR-21水平上调还预示了较高的无复发生存率[25]；非小细胞肺癌患者长生存率组和短生存率组之间血清中有11种miRNA表达水平相差5倍以上，其中与生存率显著相关的4种miRNA为miR-486、miR-30d、miR-1和miR-499[26]；晚期结直肠癌患者血浆中miR-29a和miR-92a水平较高，其联合检测能够提高对结直肠癌诊断的敏感度和特异度[27]。

这些特征都暗示了血清、血浆中的miRNA可作为生物学标志物的可能性和可行性，并且血清/血浆miRNA作为肿瘤标志物的检测具有取材方便、创伤小、可连续体外检测的优点，是肿瘤诊断和随访的理想方法。

miR-183是保守进化的miRNA族成员（miR-183、miR-96和miR-182），定位于人染色体的第7对染色体（7q32），在肿瘤中多发挥类似原癌基因作用，通过反向调节肿瘤抑制基因和/或控制分化或凋亡基因从而促进肿瘤发生[28]。

如miR-183在结肠癌[29]、乳腺癌[30]等肿瘤中水平上调，在肝癌Huh7细胞系中通过下调程序性细胞凋亡因子4（PDCD4）的表达，拮抗TGF-β1介导的细胞凋亡[31]。

前期研究中，本课题组采用实时定量PCR法检测了胃癌组织与相应癌旁组织中miR-183的水平，结果显示胃癌组织中miR-183水平明显高于相对应癌旁正常组织，其水平与淋巴结转移、远处转移及肿瘤浸润程度有关，与性别、年龄、肿瘤大小、分化程度无关。