海洋底泥环境DNA提取与纯化方法比较研究
提取和纯化海洋中的天然产物
提取和纯化海洋中的天然产物海洋中蕴藏着丰富的天然产物资源，包括各种有益的化合物和生物活性分子。
提取和纯化这些海洋天然产物对于深入研究其性质、开发应用具有重要意义。
本文将介绍提取和纯化海洋中的天然产物的方法与技术，并探讨其在不同领域的应用。
一、提取方法提取海洋中的天然产物是研究其性质的关键步骤。
常用的提取方法包括溶剂提取、超声波提取和微波辅助提取等。
溶剂提取是一种常用的海洋产物提取方法。
该方法利用溶剂的溶解性质，将待提取物质从海洋样品中转移到溶剂中，然后通过蒸发或其他方法将溶剂去除，得到纯净的提取产物。
超声波提取是利用超声波的机械振动作用促进提取过程的一种方法。
超声波的高频振动能够提高提取效率，加速活性成分的释放和溶剂的渗透，从而提高提取产物的纯度和得率。
微波辅助提取是应用微波加热原理进行提取的方法。
微波通过分子的振动和摩擦发热，从而使溶剂迅速沸腾并穿透样品，从而实现快速提取的目的。
二、纯化方法提取获得天然产物后，为了更好地研究和应用，需要对其进行纯化。
常用的纯化方法包括色谱技术、结晶技术和萃取技术等。
色谱技术是一种常用的天然产物纯化方法。
其中包括柱色谱、薄层色谱和高效液相色谱等。
色谱技术通过溶液在不同材料上的吸附与解吸作用来分离和纯化目标化合物，具有高效、灵敏度高的特点。
结晶技术是利用物质在饱和溶液中的溶解度随温度、浓度的变化而发生结晶的现象进行纯化的方法。
通过调整溶剂的温度和浓度等条件，使目标化合物结晶出来，得到纯净的产物。
萃取技术是一种通过溶剂选择性地提取物质的方法。
常用的萃取方法有固相萃取、液液萃取等。
这些方法通过溶剂与目标化合物之间的亲和性来实现分离和纯化。
三、应用领域提取和纯化海洋中的天然产物在多个领域具有广泛的应用。
以下列举几个主要的应用领域：1. 药物研发：海洋中的天然产物具有丰富的生物活性物质，可作为开发新药物的重要来源。
通过提取和纯化海洋中的天然产物，研究其抗菌、抗肿瘤、抗炎等活性，为药物的研发提供了重要的基础。
环境DNA技术在水生生物监测中的应用研究
环境DNA技术在水生生物监测中的应用研究环境DNA（environmental DNA，简称eDNA）技术是一种利用环境中生物留下的DNA信息进行生物物种监测的新方法。
它通过分析环境中生物体排出的DNA残留物，可以非侵入性地检测和监测水生生物的种群分布、物种多样性和生态系统状况。
近年来，环境DNA技术在水生生物监测中得到了广泛应用，并取得了一系列重要研究成果。
环境DNA技术在物种鉴定方面有着很高的精确性和准确性。
传统的生物物种监测方法通常需要捕捉和采集样品，然后进行分子鉴定或形态学观察，费时费力且繁琐。
而环境DNA技术只需要从水样、沉积物或水生生物体表面等环境中提取DNA，利用分子生物学方法进行物种鉴定。
这种非侵入性的采样方法不仅节省了时间和成本，还可以避免对生物体的干扰和损害，尤其对于珍稀濒危物种的保护和调查具有重要意义。
环境DNA技术可以提供对水生生物种群动态变化的连续监测。
水生生物种群的数量和分布会受到环境因素的影响，如温度、水质和生境破坏等。
传统的监测方法往往只能提供快照式的信息，无法全面了解种群的动态变化。
而环境DNA技术可以通过对多个时点的样本进行分析，获得物种在时间和空间上的变化趋势，从而更好地评估生态系统的健康状况。
通过对不同时间和地点的水样进行eDNA分析，可以揭示河流或湖泊中鱼类、两栖动物等生物种群的季节性和年际性变化，为生态系统的管理和保护提供科学依据。
需要指出的是，虽然环境DNA技术有着很大的潜力，但其也存在一些挑战和局限性。
环境中的DNA会存在降解、稀释等问题，可能导致物种检测的错误和信息的不完整。
环境DNA技术还面临着技术标准化和统一评价的问题，需要建立更准确、可靠、可重复的分析方法和标准。
环境DNA技术的应用还需要充分考虑和解决伦理、法律和社会问题，确保其合法、安全和可持续发展。
环境DNA技术在水生生物监测中具有广阔的应用前景。
通过利用环境中的DNA信息，可以实现对水生生物的种群分布、物种多样性和生态系统状况的连续监测和评估。
环境DNA技术在水生生物监测中的应用研究
环境DNA技术在水生生物监测中的应用研究环境DNA（Environmental DNA，eDNA）技术是一种新兴的生物监测方法，可以非侵入性地检测环境中的生物物种。
它通过分析环境中的DNA片段，可以获取到现场物种的遗传信息，从而实现对水生生物多样性的快速评估及监测。
本文将重点介绍环境DNA技术在水生生物监测中的应用研究。
环境DNA技术可以用于水生生物多样性评估。
通过采集水样或者环境样品，提取其中的环境DNA，可以通过高通量测序技术分析获得大量种类信息。
与传统的物种调查方法相比，eDNA技术具有较高的灵敏度和准确性，在短时间内就能获得大量的物种信息。
eDNA技术还可以检测到一些难以直接观察到的物种，例如微小型水生生物、无脊椎动物等，从而更全面地了解水生生物多样性。
环境DNA技术可以用于检测水生生物的数量和分布。
水生生物的环境DNA浓度与种群大小呈正相关关系，通过测定水样中的环境DNA浓度，可以初步估计物种的丰度。
由于不同物种的环境DNA具有特异性，可以根据水样中不同物种的DNA丰度比例，推断不同物种的相对丰度。
通过采集不同位置的水样进行测定，可以绘制物种的分布图，进而研究水生生物的栖息地选择、迁移等行为。
环境DNA技术还可以用于监测水生生物的物种组成和群落结构。
通过比较不同时间或不同空间的水样中的DNA组成，可以揭示物种组成的变化趋势，从而研究水生生物的动态演变。
通过对不同水体的DNA组成进行比对，可以分析水体之间的相似性和差异性，进一步探究不同水体中生物群落的差异。
环境DNA技术还可以用于检测水生生物的生活史和行为习性。
一些水生生物在其生命周期的特定阶段会产生特定的DNA片段，通过分析水样中的环境DNA可以了解到物种的生活史信息，例如繁殖季节、洄游行为等。
一些生物的行为习性也会在其所处环境中留下特定的DNA信号，通过分析水样中的环境DNA可以获得他们的行为信息，例如觅食活动、迁移路线等。
环境DNA技术在水生生物监测中具有广泛的应用前景。
提取和纯化海洋中的藻类和海草
提取和纯化海洋中的藻类和海草海洋中的藻类和海草在生态系统中扮演着重要的角色，不仅对海洋生物多样性起到支撑作用，还具有很高的应用价值。
然而，在研究和利用过程中，如何高效地提取和纯化海洋中的藻类和海草成为了一个关键问题。
本文将从提取方法和纯化技术两个方面进行探讨，以期为相关领域的研究工作者提供一定的参考。
一、提取方法提取海洋中的藻类和海草是研究和利用它们的前提，合理选择提取方法可以提高提取效率。
下面将介绍几种常见的提取方法。
1. 机械提取法机械提取法是一种简单、快速的提取方法，适用于一些体积较大的海藻和海草。
具体操作步骤为将样品与溶液混合后，通过振荡或研磨等机械方式将目标物质从样品中分离出来。
机械提取法的优点是操作简便，但也存在着对目标物质的破坏和杂质的混入等缺点。
2. 化学提取法化学提取法是利用溶剂来提取目标物质，通过类似溶解、析出、共沉淀等化学方式将目标物质从样品中分离出来。
常用的溶剂有正己烷、乙酸乙酯、乙醇等。
化学提取法的优点在于可选择合适的溶剂对不同种类的藻类和海草进行提取，提取效果较好。
但需要注意的是，选择溶剂时要考虑其对样品的溶解性和选择性。
3. 超声提取法超声提取法是利用超声波的作用来破碎细胞壁，促进目标物质的溶出。
超声提取法操作简单、速度快，对样品的破坏较小，并可提高提取效率。
但超声提取法的功率、时间和温度等参数的选择需要根据不同的藻类和海草进行优化。
二、纯化技术提取藻类和海草后，往往需要对目标物质进行纯化，以获得更纯净的化合物。
下面将介绍几种常见的纯化技术。
1. 薄层层析法薄层层析法是一种常用的分离和纯化技术，可通过不同物质在固定相和移动相之间的差异来进行分离。
薄层层析法操作简单、快速，并具有较高的分离效率和纯化度。
但也存在着样品量较小、操作技巧要求较高等缺点。
2. 柱层析法柱层析法是利用固体填充物对混合溶液进行分离的一种方法，可分为凝胶柱层析、吸附柱层析和离子交换柱层析等多种类型。
利用DNA测序技术和环境DNA研究海洋生物群落的物种多样性和时空变化
利用DNA测序技术和环境DNA研究海洋生物群落的物种多样性和时空变化标题：利用DNA测序技术和环境DNA研究海洋生物群落的物种多样性和时空变化摘要：近年来，随着DNA测序技术的快速发展和环境DNA（eDNA）的广泛应用，研究海洋生物群落的物种多样性和时空变化变得更加准确和高效。
本文综述了DNA测序技术和eDNA在海洋生物多样性研究中的应用和优势，并探讨了其在研究海洋生物群落的时空变化方面的潜力。
此外，本文还讨论了DNA测序技术和eDNA研究存在的局限性，并提出了未来需要解决的挑战和应用前景。
1. 引言海洋生物群落的物种多样性和时空变化对于了解海洋生态系统的结构与功能具有重要意义。
然而，传统的生物多样性研究方法往往受限于样品获取的困难和物种鉴定的复杂性等问题，限制了对海洋生物群落的深入研究。
近年来，随着DNA测序技术的快速发展和环境DNA（eDNA）的广泛应用，研究海洋生物群落的物种多样性和时空变化变得更加准确和高效。
2. DNA测序技术在海洋生物多样性研究中的应用2.1 传统方法与DNA测序技术的对比传统的海洋生物多样性研究方法主要依靠目测鉴定和基于形态学特征的分类学方法。
这些方法不仅需要对海洋生物具有深入的知识和经验，而且在处理大样本量时存在着时间和资源的限制。
相比之下，DNA测序技术能够通过分析生物体内的DNA序列来获取物种信息，从而避免了传统方法存在的局限性。
2.2 规模化DNA测序技术的优势随着高通量测序技术的发展，规模化的DNA测序方法已经成为研究海洋生物多样性的重要工具。
通过对样本DNA进行测序，研究人员可以快速、准确地鉴定和分类多个物种的遗传信息。
这种高通量测序技术可以同时测序多个样本的DNA，大大提高了样本处理的效率和扩展了研究的规模。
2.3 元转录组分析在海洋生物多样性研究中的应用元转录组分析是一种通过测序和分析生物体中转录本的方法来了解其基因表达情况的技术。
在海洋生物多样性研究中，元转录组分析可以帮助研究人员了解海洋生物群落的功能与结构，以及其对环境变化的响应。
环境DNA技术在水生生物监测中的应用研究
环境DNA技术在水生生物监测中的应用研究环境DNA（Environmental DNA，简称eDNA）技术是一种新兴的生物监测技术，通过分析从环境中提取的DNA分子，可以非侵入性地检测到水生生物的存在和物种多样性。
本文将介绍eDNA技术在水生生物监测中的应用研究。
eDNA技术在水生生物物种检测方面具有显著的优势。
传统的水生生物监测往往依赖于传统的采样和鉴定方法，这些方法费时费力且对生物群落组成的检测有限。
而eDNA技术通过分析水体中存在的DNA，可以同时检测到多种物种，无需对具体物种进行识别，大大提高了物种检测的效率和准确性。
通过与已知物种DNA序列进行匹配，可以实现对水体中不同物种的定量分析和生物多样性评估。
eDNA技术在水生生物监测中可以检测到远程或隐蔽生物。
一些水生生物种群分布范围广泛，但难以直接观测或捕捉，例如某些鱼类、两栖动物和海洋生物。
使用eDNA技术可以通过分析水体中存在的该物种的DNA来判断其存在。
这对于监测这些远程或隐蔽生物的分布和数量具有重要意义，有助于了解物种生态习性、种群动态等信息。
eDNA技术在水生生物监测中还可以提供关于生物群落动态变化和生态系统健康状态的信息。
通过长期监测水体中不同物种的eDNA浓度、物种丰度和物种组成等指标，可以对生物群落的结构和功能进行评估和预测。
这对于水生生物种群的保护和生态系统的管理有着重要的意义。
eDNA技术在水生生物监测中具有广阔的应用前景。
通过非侵入性地分析水体中存在的DNA，可以实现对水生生物物种的快速、高效和准确的监测。
这对于保护水生生物多样性、管理生态系统以及预防和控制外来物种的扩散都具有重要意义。
不同环境中土壤微生物总DNA的提取与纯化
收稿日期:2007210201基金项目:中央公益性科研院所基本科研业务专项(2007hzslJ011)作者简介:吴红萍(19822),男,江西萍乡人,硕士研究生,研究方向为资源微生物开发和利用。
3为通讯作者。
不同环境中土壤微生物总DNA 的提取与纯化吴红萍1, 郑服丛23(11海南大学环境与植物保护学院, 海南儋州 571737;21中国热带农业科学院环境与植物保护研究所, 海南儋州 571737) 摘要:采用SDS 高盐缓冲液抽提法提取了林地、厂区、菜地3种不同环境中土壤微生物总DNA ,结果表明,该方法可以从土壤微生物中提取到长度大于2311kb 的DNA ;不同环境中提取的DNA 产量和纯度都存在一定的差异,每克干土的DNA 提取量介于53155～579193μg 之间,其中以处于原始状态的丛林提取量最高。
粗提的土壤微生物DNA 采用酚氯仿和柱式腐殖酸去除剂进行纯化,纯化后的土壤微生物DNA 可以用于PCR 扩增,使用细菌16SrDNA 基因的引物可以扩增到相应的片段。
关键词:SDS ;土壤微生物;DNA 提取;PCR 扩增中图分类号:S154134 文献标识码:A 文章编号:1002-8161(2008)01-0012-05Extraction and purif ication of total D NA of soilmicroorganisms in different environmentsWU Hong 2ping 1,ZHEN G Fu 2cong 23(11College of Environment and Plant Protection ,Hainan U niversity ,Danz hou ,Hainan 571737,China ; 21Environment and Plant Protection Institute ,Chinese Academy ofT ropical A gricultural Sciences ,Danz hou ,Hainan 571737,China )Abstract :In this experiment ,the total DNA of soil microorganisms from forest land ,factory area and vegetable plot were extracted by high salt buffer solution of SDS extraction method 1The results showed that the extracted DNA length of soil microorganisms was over 2311kb by this method 1The DNA amount and purity of different soil microorganisms were different ,the extracted DNA amount was 531552579193μg per gram dry soil ,and the extracted DNA amount of soil mi 2croorganisms in original forest was the highest 1The crude extracted DNA of soil microorganisms was purified by phenol 2chloroform and column humic acid ,then purified DNA could be used as templates for PCR amplification ,and corresponding fragments could be amplified by using primers of bacterial 16S rDNA gene 1K ey w ord :SDS ;soil microorganisms ;DNA extraction ;PCR amplification 土壤是微生物的大本营,土壤微生物在生物地球化学循环中扮演着非常重要的角色,对地表生态系统乃至全球都存在重要影响。
海洋生物化学成分的提取与分离方法研究
海洋生物化学成分的提取与分离方法研究海洋生物具有丰富多样的化学成分，其中许多有着重要的医药和抗菌作用。
为了进一步挖掘和利用海洋生物的潜力，研究者们致力于寻找高效准确的提取和分离方法。
本文将介绍几种常用的海洋生物化学成分提取与分离方法，并着重讨论它们的优缺点。
一、萃取法萃取法是一种常见的提取海洋生物化学成分的方法。
它通过将海洋生物样品与适当的溶剂接触，使目标成分从样品中转移到溶剂中。
常用的溶剂有乙醇、甲醇、醚类等。
优点是操作简单，提取效果较好，适用于大规模样品的提取。
然而，萃取法存在着溶剂挥发、萃取效率低等问题。
二、超声波辅助提取法超声波辅助提取法是利用超声波的物理效应促进海洋生物化学成分的提取。
它通过超声波的振荡作用破坏细胞结构，使目标成分溶解于溶剂中。
相比传统的提取方法，超声波辅助提取法具有提取效率高、时间短、操作简便等优点，适用于提取复杂样品中的海洋生物成分。
三、色谱法色谱法是一种常用的海洋生物化学成分分离方法。
它通过样品溶液在固定相和流动相的相互作用下，分离出不同的化学成分。
常用的色谱方法包括气相色谱、液相色谱和高效液相色谱等。
这些方法可以根据样品的特性选择合适的色谱材料和检测方法，实现目标成分的有效分离。
四、质谱法质谱法是一种基于化学成分的质量-电荷比进行分析和鉴定的方法。
它利用质谱仪器对海洋生物样品中的化学成分进行分离和检测。
质谱法可以提供化合物的分子质量信息，帮助确定其结构和组成。
常用的质谱方法包括质子质谱、电喷雾质谱以及飞行时间质谱等。
综上所述，海洋生物化学成分的提取与分离方法包括萃取法、超声波辅助提取法、色谱法和质谱法等。
每种方法都有其独特的优缺点，研究者可以根据目标成分的特性和实验条件的不同选择合适的方法或者将多种方法进行结合，以实现更好的提取和分离效果。
通过不断探索和改进这些方法，我们相信能够发掘出更多有益的海洋生物化学成分，为医药和抗菌领域的研究提供有力支持。
一种海洋贝类生物沉积物总dna的高效提取方法
一种海洋贝类生物沉积物总dna的高效提取方法海洋贝类生物是海洋生态系统的重要组成部分，其沉积物中含有丰富的DNA序列信息，对研究海洋生物的遗传多样性和进化历史具有重要意义。
然而，由于海洋贝类生物体积较小，样本提取DNA的难度相对较大。
因此，本文旨在探讨一种高效提取海洋贝类生物沉积物总DNA的方法。
1.样品收集和预处理首先，需要收集海洋贝类生物沉积物样品，并进行必要的预处理步骤。
预处理步骤包括样品的质控以及去除外源性DNA污染物。
质控可以通过显微镜观察样品中是否存在异物、以及确定质量是否适合DNA提取。
去除外源性DNA污染物可以通过丙酮处理样品，以去除表面附着的DNA。
2.DNA提取目前常用的DNA提取方法有差异离子表面层析法（SDS）、酚-氯仿法（PCI法）等，然而这些方法由于样品特殊性导致提取效率较低。
因此，需改进现有的DNA提取方法。
一种比较高效的提取海洋贝类生物沉积物总DNA的方法是：利用磁珠吸附技术结合PCR进行提取。
具体步骤如下：（1）样品准备：将已去除异物和外源性DNA污染物的沉积物样品放入含有酶解缓冲液的离心管中，离心沉淀后取上清液。
（2）磁珠吸附：将磁珠与样品上清液混合，使其充分接触。
磁珠的选择应具有良好的亲和性和吸附效率，适合吸附小分子DNA。
（3）磁珠分离：利用外磁场的作用，使磁珠快速沉降到离心管底部，同时带走样品中的DNA。
（4）DNA洗涤：对磁珠进行多次洗涤，以去除非特异性吸附的杂质。
（5）洗脱DNA：将洗脱缓冲液加入到离心管中，将DNA从磁珠上脱附下来。
（6）DNA纯化：利用纯化试剂盒对提取得到的DNA进行纯化，去除离心管中残留的蛋白质等杂质。
3.DNA浓度和质量的检测DNA提取后，需要对提取得到的DNA样品进行浓度和质量的检测。
可以通过比色法或荧光法检测DNAA260/A280比值确定DNA的纯度，以及利用凝胶电泳测定DNA的大小和分子量。
总结：通过上述改进的高效提取海洋贝类生物沉积物总DNA的方法，可以提高提取效率和纯度，并且消除外源性DNA污染物的影响。
利用环境DNA技术研究海洋物种的多样性和分布
利用环境DNA技术研究海洋物种的多样性和分布Title: 利用环境DNA技术研究海洋物种的多样性和分布摘要：环境DNA技术（eDNA）是一种近年来兴起的非侵入性方法，通过分析环境中的DNA来研究海洋物种的多样性和分布。
本文综述了环境DNA 技术的基本原理、样品采集和处理方法，以及在海洋物种多样性和分布研究中的应用。
同时，讨论了环境DNA技术的优势、限制和未来发展方向。
本研究认为，环境DNA技术为海洋生物多样性保护、生态系统管理和渔业资源评估提供了一种新的高效工具。
关键词：环境DNA，物种多样性，分布，海洋，采样方法一、引言海洋生物多样性是海洋生态系统稳定性和可持续性的重要指标。
传统的海洋生物多样性研究通常依赖于直接观察和物种计数，但这种方法繁琐耗时，同时对于难以观察到的物种或者短期内发生变化的物种难以提供准确的数据。
近年来，环境DNA技术的出现为海洋生物多样性研究带来了新的机遇。
二、环境DNA技术的基本原理环境DNA是指生物体在生活历程中排放的各种碎片DNA，如皮肤脱落、鳞片、粪便、尿液等。
环境DNA技术即通过采集和分析环境中的DNA 来推断物种的存在与分布。
这一技术的基本流程包括样品采集、DNA提取、PCR扩增和测序分析。
三、环境DNA样品采集和处理方法环境DNA样品的采集是影响环境DNA分析结果的关键环节。
常见的样品类型包括水体、沉积物、水母网和海洋生物体的表面。
采集样品时需注意避免外源性DNA污染和DNA降解。
在样品采集后，对其进行预处理如滤膜筛选、浓缩等手段以提高环境DNA的浓度，随后进行DNA四、环境DNA技术在海洋物种多样性研究中的应用1. 物种鉴定：环境DNA技术可以通过分析样品中的DNA序列信息来推断物种的存在与分布情况。
2. 多样性评估：通过分析环境DNA样品中的DNA序列多样性指标，可以对物种多样性进行评估和比较。
3. 物种分布模型：基于环境DNA数据，可以利用生物信息学和地理信息系统方法对物种的分布模型进行建立和预测。
底泥水体中适用于PCR的不同形态DNA的提取方法
底泥水体中适用于PCR的不同形态DNA的提取方法冯凌;罗义【期刊名称】《生态毒理学报》【年(卷),期】2010(005)002【摘要】提出直接从环境河流底泥和表层水体中同时提取不同形态DNA(胞内、胞外、染色体和质粒DNA)的有效方法.利用该方法提取了海河典型区域底泥的胞外DNA和胞内DNA及水体中细菌染色体DNA和质粒DNA.结果表明,NaH2PO4提取的胞外DNA分子量大于1kb,提取率40%～72%,没有共提取胞内DNA.胞内DNA提取的分子量均大于23.1kb,细菌质粒DNA与染色体DNA同时分离.16S rDNA与sul2扩增验证提取方法可靠性.16S rDNA扩增结果显示所有胞外DNA呈阴性,胞内DNA呈阳性.质粒DNA和染色体DNA的16S rDNA扩增显示,染色体DNA结果显阳性,质粒DNA呈阴性,sul2的结果相反.【总页数】7页(P280-286)【作者】冯凌;罗义【作者单位】南开大学环境科学与工程学院,环境污染过程与基准教育部重点实验室,天津,300071;南开大学环境科学与工程学院,环境污染过程与基准教育部重点实验室,天津,300071【正文语种】中文【中图分类】X502【相关文献】1.DNA不同提取方法对养殖池塘底泥细菌多样性PCR-DGGE检测的影响 [J], 王宇;林文辉;王亚军;毕晔;石存斌;吴淑勤2.1种适用于转基因玉米PCR检测的DNA快速提取方法 [J], 戴军;汪海;朱莉;黄大昉;郎志宏3.一种适用于太湖底泥基因组DNA的提取方法 [J], 朱艳霞;邱业先;钱玮4.养殖池塘底泥水体中适用于TaqMan荧光定量PCR的不同DNA提取方法 [J], 佘容;郝中香;罗丹;林华;张凤枰;廖红;陈世界;刘耀敏;杨苗5.一种适用于PCR扩增的甜菜干种子DNA快速提取方法的研究 [J], 吴则东;王茂芊;胡珅;马龙彪;王华忠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
天津海底淤泥微生物DNA的提取方法研究
天津海底淤泥微生物DNA的提取方法研究张国刚;任毅鹏;马成仓;多立安;满良【摘要】[目的]探索一种快速、高效提取海底淤泥中微生物DNA的最佳方法,为开展海底淤泥微生物的分子生物学研究奠定基础.[方法]分析了不同DNA提取液浓度和不同的腐植酸去除方法对淤泥中微生物DNA提取的产率、纯度的影响,探讨天津市海底淤泥中微生物DNA提取的最佳方法.[结果]海底淤泥用焦磷酸钠和氢氧化钠混合浸提剂提取腐植酸后,再用蒸馏水洗去浸提液,用4ml DNA提取液提取,所得DNA的产率及纯度均优于对照组.[结论]该试验结果为海底淤泥微生物的分子生物学研究奠定了基础.%[Objective] To explore a rapid and high-efficient method to extract microbial DNA from the seabed sludge of Tianjin, so as to lay foundation for studying the molecular biology of microorganism in the sludge. [ Method] The influence of different DNA extracting concentration and different humic acid removal methods on the yield and purity of microbial DNA from sludge was analyzed to explore the best extraction method. [ Result] The humic acid was extracted from seabed sludge with the mixed sodium pyrophosphate and sodium hydroxide, and then the extracting solution was washed by distilled water, and then extracted with 4 ml of DNA extracts, the yield and purity of DNA were better than the control plot. [ Conclusion ] The experimental results lay a foundation for studying the molecular biology of microorganism in the seabed sludge.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2012(040)024【总页数】3页(P11932-11933,11945)【关键词】海底淤泥;腐植酸;DNA纯度;DNA提取;PCR扩增【作者】张国刚;任毅鹏;马成仓;多立安;满良【作者单位】天津师范大学生命科学学院,天津300387;天津师范大学生命科学学院,天津300387;天津师范大学生命科学学院,天津300387;天津师范大学生命科学学院,天津300387;天津师范大学生命科学学院,天津300387【正文语种】中文【中图分类】S917.1海底淤泥是海洋微生物重要的生存场所，海洋微生物在长期的适应与进化过程中，必须形成适应这些极端环境的生理和代谢机制［1］。
提取和纯化海洋中的天然产物
提取和纯化海洋中的天然产物海洋是地球上最广阔的自然资源之一，其中包含着丰富多样的生物质。
这些生物在海洋中生长，具备了独特的适应能力，因此产生了许多珍贵的有机分子。
这些天然产物具有广泛的应用领域，包括药物开发、食品工业、化妆品等。
为了利用这些天然产物，需要进行提取和纯化的过程，以获取高纯度和高质量的活性成分。
本文将介绍提取和纯化海洋中的天然产物的方法和技术。
一、提取方法在提取天然产物的过程中，需要选择适当的提取方法，以保留生物活性成分并去除无关物质。
常用的提取方法包括溶剂提取、超声波辅助提取、酶解提取等。
1. 溶剂提取法溶剂提取法是最常用的提取方法之一。
它利用溶剂的选择性溶解性质，将目标物质从固体或液体基质中分离出来。
在海洋中的天然产物提取中，醇类、酯类等有机溶剂常被使用。
这些溶剂可以通过不同的萃取工艺，如浸提、渗漏等方式，将有机物质从海洋生物中萃取出来。
2. 超声波辅助提取法超声波辅助提取法是近年来发展起来的一种新型提取技术。
它利用超声波的机械作用和声化学效应，能够加速提取物质的转移和扩散过程。
在海洋天然产物的提取中，超声波能够破坏细胞壁，促进细胞内物质的释放，提高提取效率。
3. 酶解提取法酶解提取法是利用酶的生物催化作用，将生物材料中的有用组分释放出来。
在海洋天然产物的提取中，可以使用特定的酶来降解生物材料中的蛋白质、多糖等组分，以提取目标物质。
这种方法不仅具有高效率和高选择性，还能够保持天然产物的活性。
二、纯化技术提取出的海洋天然产物中常常包含着多种复杂的化合物，需要进行纯化才能得到纯净的化合物。
纯化技术主要包括色谱法、结晶法、膜分离法等。
1. 色谱法色谱法是一种基于物质在固相和液相之间的差异性分离原理的方法。
常用的色谱技术包括薄层色谱、柱层析、高效液相色谱等。
通过控制流动相和固定相的组成和条件，可以实现对海洋天然产物的分离和纯化。
2. 结晶法结晶法是通过溶剂的蒸发或降温，使溶解物质逐渐结晶出来。
环境样品总DNA的提取与纯化
环境样品总DNA的提取与纯化无论我们是用DGGE，T‐RFLP还是用Metagenomics等非培养手段研究特定环境中微生物的群落演替，丰度或功能基因，首先摆在我们面前的问题是如何有效提取环境样品总DNA。
环境样品总DNA的提取关系到后续试验的成败及实验结果的可靠性。
本文将结合我在metagenomic研究过程中所积累的教训谈谈环境样品总DNA 的提取、纯化及纯度检测，以加快后来人对此了解并少走些不必要的弯路。
(1) 总DNA的提取a 样品采集样品的采集及保存是DNA提取的第一步，这里面最主要的我认为有以下两点：1) 避免人源污染。
这个不多说，微生物无处不在。
采样的器具都要高温灭菌，采样过程中要戴手套。
有兴趣的可以看看PLoSone上面发的一篇database中序列污染的文章：Abundant Human DNA Contamination Identified in Non‐Primate Genome Databases。
2) 样品的迅速处理保存。
很多时候我们的样品并非来自实验室周围，比如牛的瘤胃样品，热泉样品，重金属污染土壤样品。
这个时候就涉及到样品的运输，如果有条件最好用液氮冻了运输，没有条件可以将装有样品的容器至于干冰泡沫箱中。
带回实验室之后要尽快处理，特别是固体样品，迅速用预冷缓冲液 (多为PBS)重悬，离心收集沉淀。
分装成小份，冻存于液氮或者‐80 o C冰箱中，避免反复冻融。
如果后续用间接法提取总DNA的话，此处需要收集菌体，采取的策略是稀释之后的差速离心，这里不做详谈。
b 提取方法的选择总DNA的提取按照处理样品方式的不同划分为直接提取法和间接提取法。
顾名思义，直接提取法就是直接对样品进行裂解，释放其中的DNA；间接提取法则是先分离样品中的微生物，后对微生物进行裂解。
两种方法的适用范围不同，各自都有优缺点。
直接提取法的优缺点：直接提取法多用在提取固体样品(如土壤、污泥、湖泊沉积物等) 总DNA的试验中。
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第54卷第3期2014年5月大连理工大学学报Journal of Dalian Universit y of Technolo gyVol.54,No.3Ma y 2014文章编号:1000-8608(2014)03-0272-06海洋底泥环境DNA 提取与纯化方法比较研究王晓辉*1,2,3,4, 黄李淑馨2,4, 白凤武1, 杜昱光5(1.大连理工大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116024;2.中国科学院大连化学物理研究所,辽宁大连 116023;3.大连大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116622;4.中国科学院大学,北京 100049;5.中国科学院过程工程研究所,北京 100190)摘要:为了探索有效的海洋底泥宏基因组DNA 提取与纯化方法,分别采用CTAB 结合SDS法㊁CTAB 结合玻璃珠法㊁SDS 结合蛋白酶K 法和SoilMaster TM 试剂盒法提取海洋底泥宏基因组DNA ,用柱式腐殖酸清除试剂盒法与电洗脱法纯化宏基因组DNA ,并对宏基因组DNA 的产量与纯度进行评价.结果表明:SDS 结合蛋白酶K 法提取率最高,DNA 片段完整;SoilMaster TM 试剂盒法与CTAB 结合SDS 法次之;CTAB 结合玻璃珠法有严重降解;电洗脱法可以得到高纯度㊁大于42kb 宏基因组DNA 片段.因此,SDS 结合蛋白酶K 法和电洗脱法提取纯化海洋近海底泥宏基因组DNA 优于其他方法.关键词:宏基因组DNA ;提取;纯化;海洋底泥中图分类号:Q781文献标识码:Adoi :10.7511/dll g xb201403002收稿日期:2013-07-08; 修回日期:2014-03-10.基金项目: 八六三 国家高技术研究发展计划资助项目(2012AA021205-2); 十二五 国家科技支撑计划资助项目(2013BAB01B01);中国科学院知识创新工程重要方向课题资助项目(KSCX2-EW -G -5).作者简介:王晓辉*(1981-),女,博士生,讲师,E -mail :wan g xiaohui@.0 引 言海洋约占地球表面积的70%,具有高盐(3.5%)㊁高压(>100MPa )㊁低温㊁低光照㊁寡营养等特点,以及无光照和局部高温(400ħ)等极端环境.据估计海洋微生物接近3.67ˑ1030种[1],而可培养微生物仅占0.001%~0.1%[2],人们对于绝大多数不可培养微生物几乎一无所知.宏基因组学(meta g enomics )技术为人类从海洋天然宝库中寻找新型功能生物活性物质和工业酶制剂提供了新的方法,为海洋微生物资源的开发和利用开辟了一个新领域.目前海洋底泥宏基因组DNA 提取主要有两种方法:一种是直接对环境样品进行微生物宏基因组DNA 的提取,称直接裂解法(direct l y sis extraction method ),也称原位裂解法;另一种是间接裂解法,即微生物细胞抽提法(bacterial extraction method ),先分离黏附在土壤㊁沉积物等样品中的微生物细胞,然后提取宏基因组DNA.间接裂解法所制备的宏基因组DNA 较直接裂解法纯度高㊁片段大,然而DNA 的产量及基因组信息的广泛性不如直接裂解法[3].直接裂解法常采用高温(>60ħ)裂解,并加入去污剂及螯合剂,如十二烷基硫酸钠(SDS )㊁十六烷基三甲基溴化铵(CTAB )㊁乙二胺四乙酸(EDTA )等,特定环境样品也加入蛋白酶K ㊁溶菌酶,并结合研磨㊁冻融等物理措施.虽然这些裂解策略得到的宏基因组DNA 质量相对较低,但是可获取多样化的不可培养微生物的基因信息,便于后续宏基因组文库构建及功能基因筛选.本研究中海洋底泥样品含有腐殖酸㊁重金属离子等杂质,水分㊁盐分含量高,黏稠度高并含有少量的贝壳碎片,严重影响宏基因组文库构建的后续操作,如PCR 反应㊁酶切㊁连接等,因此对宏基因组DNA的纯化显得尤为重要.目前常用的纯化方法包括氯化铯密度梯度超速离心㊁脉冲电泳法㊁透析和过滤法[4]等,然而以上任何一种方法都不可能完全适用于所有的环境DNA除杂,在实际操作中应结合样品情况选择一种或多种纯化方法进行组合纯化.鉴于此,作者分别采用CTAB 结合SDS法㊁CTAB结合玻璃珠法㊁SDS结合蛋白酶K法㊁SoilMaster TM试剂盒法及柱式腐殖酸清除试剂盒法和电洗脱法提取纯化海洋底泥宏基因组DNA,并比较其提取与纯化效果,以期获得有效提取纯化海洋底泥宏基因组DNA的方法,为后续构建宏基因组文库,筛选新型工业生物催化剂奠定基础.1材料和方法1.1材料样品采自中国辽宁大连渤海海域近海底泥6~100m(123ʎ371'E,39ʎ697'N),样品采集后迅速装入无菌保鲜袋冻存于-20ħ冰柜,运回实验室后转至-80ħ.1.2方法1.2.1宏基因组DNA提取(1)CTAB结合SDS法参照Brad y法[5],称取1.0g近海底泥样品,加入70ħ预热的1.5mL裂解缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl,100mmol/L Na2EDTA, 1.5mol/L NaCl,1%CTAB,2%SDS,p H8.0),振荡器上充分混匀;70ħ水浴2h,每隔30min 混匀一次;2h后冷却至室温,12000g,4ħ离心10min,重复一次;上清液加入0.7体积的异丙醇,室温放置30min后,12000g,4ħ离心30min;沉淀加入1.0mL预冷的70%乙醇, 12000g,4ħ离心10min;风干,溶于50μL无菌水,4ħ保存备用.(2)SDS结合蛋白酶K法参照Zhou等法[6],称取近海底泥1.0g,加入1.35mL DNA提取液(100mmol/L Tris-HCl,100mmol/L EDTA,100mmol/L Na3PO4, 1.5mol/L NaCl,1%CTAB,p H8.0)与10μL 蛋白酶K(10m g/mL),37ħ,225r/min振荡30min;加入0.15mL10%SDS,65ħ水浴2h,每隔15~20min上下颠倒混匀;12000g,4ħ离心10min;取上清液,用等体积氯仿-异戊醇(24ʒ1)抽提2次,12000g,4ħ离心20min;沉淀加入1.0mL预冷的70%乙醇,12000g,4ħ离心10 min;风干,溶于50μL无菌水,4ħ保存备用.(3)SoilMaster TM试剂盒法具体见E p icentre公司SoilMaster TM DNA Extraction Kit,按照操作说明进行. (4)CTAB结合玻璃珠法参照Huan g等法[7],称取1.0g近海底泥于1.5mL无菌离心管,加入0.5mL磷酸盐提取缓冲液,40μL20%SDS,加入与近海底泥等重玻璃珠.用涡旋振荡器混匀2min,68ħ水浴2h,每隔15min上下颠倒混匀.12000g,4ħ离心15min,将上清液转移至另一无菌离心管,加入50μL 5mol/L KAc和0.2mL PEG8000,-20ħ放置15min,12000g,4ħ离心15min.沉淀用50μL 2ˑCTAB重悬,68ħ水浴1h.加入等体积氯仿-异戊醇(24ʒ1),轻柔混匀,静置5min,12000g, 4ħ离心15min.将上清液转移至另一新无菌离心管,加入等体积异丙醇,混匀,室温放置15 min,12000g,4ħ离心10min.70%乙醇洗涤2次,风干,溶于50μL无菌水,4ħ保存备用.1.2.2宏基因组DNA纯化(1)柱式腐殖酸清除试剂盒法采用柱式腐殖酸清除试剂盒(北京天恩泽)进行纯化,具体操作参见试剂盒说明书. (2)电洗脱法参照Brad y法[5],DNA粗提液1%低熔点琼脂糖凝胶电泳,20V,16h.将凝胶两侧含DNA Marker及相邻部分目的胶条切下,于溴化乙锭中染色约2h,而后与未切除部分拼接,用刀片将目的DNA胶条切下,将凝胶转移至预先处理好的透析袋(MWCO10000)中,加入1ˑTAE溶液直至有充足的缓冲液与凝胶接触.用透析袋夹将袋夹紧,避免存留气泡.把透析袋泡在盛有1ˑTAE 的水平电泳槽中,7.5V/cm的电压电洗脱4h,电极反转同样电压电洗脱1min,将透析袋中的溶液转移至1.5mL的无菌离心管中,加入0.1372第3期王晓辉等:海洋底泥环境DNA提取与纯化方法比较研究体积3mol/L NaAc(p H5.2)和2.5体积无水乙醇,室温放置30min,在13000g㊁4ħ下离心15 min.70%乙醇洗涤2次,风干,溶于适量无菌水, 4ħ保存备用.1.2.3宏基因组DNA电泳检测采用常规1%琼脂糖凝胶电泳检测.提取宏基因组DNA的电泳条件:普通琼脂糖(生工生物工程(上海)股份有限公司,简称生工,上海),100V,1h;16S rDNA 扩增的电泳条件:普通琼脂糖(生工,上海),120 V,30min;电洗脱纯化DNA的电泳条件:20cm 长低熔点琼脂糖凝胶(生工,上海),20V,16h.1.2.4 宏基因组DNA定量和纯度检测采用HD-21C-B型核酸蛋白检测仪检测不同方法提取的宏基因组DNA的吸光度(A260/A280与A260/ A230)及提取量.1.2.5 PCR扩增16S rDNA PCR引物分别为F27(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3')和R1492(5'-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3')[8],由生工合成.PCR反应条件:95ħ预变性2min,95ħ变性30s,55ħ退火30s,72ħ延伸1.5min,30个循环;最后72ħ延伸10min. 2结果与分析2.1海洋底泥宏基因组DNA提取对于同一样品而言,环境DNA提取方法的好坏,取决于宏基因组DNA总量以及DNA片段的完整性.本文采用CT AB结合SDS法㊁CTAB结合玻璃珠法㊁SDS结合蛋白酶K法㊁SoilMaster TM试剂盒法4种方法提取海洋近海底泥宏基因组DNA样品,每种方法做了3次重复.结果如图1所示:4种方法所得土壤DNA电泳后均呈现单一的带,相对分子质量均在23kb以上.其中SDS 结合蛋白酶K法提取的DNA效果最显著,既保持了宏基因组DNA片段的完整性,又得到浓度高的环境DNA.CTAB结合SDS法提取所得DNA量相对于SDS结合蛋白酶K法低很多,同时有拖尾现象,说明其完整性遭到破坏.SoilMas-ter TM试剂盒法提取的DNA片段较完整,但浓度较低,片段长度小.CTAB结合玻璃珠法提取的海洋底泥宏基因组DNA严重降解.M核酸相对分子质量标准;1~3CTAB结合SDS法; 4~6SDS结合蛋白酶K法;7~9SoilMaster TM试剂盒法; 10~12CTAB结合玻璃珠法图1不同方法提取的海洋底泥宏基因组DNA Fi g.1 The marine sediment meta g enomic DNA extractedb y different methods综上所述,SDS结合蛋白酶K法为提取海洋底泥宏基因组DNA最佳方法.2.2海洋底泥宏基因组DNA纯度检测DNA纯度可通过A260/A280和A260/A230来评价.A260/A280在1.8~1.9时,DNA纯度较高,小于这个范围则可能含有蛋白质㊁腐殖酸等有机物,而大于这个范围则可能含有RNA.与此同时,干净的DNA其A260/A230应不小于2.0,小于这个范围则可能含有无机盐离子.表1中4种提取方法获得环境DNA纯度均未达到要求,需进一步纯化,但SDS结合蛋白酶K法提取DNA产量最大,确定SDS结合蛋白酶K法为提取海洋底泥样品最佳方法.表1海洋底泥宏基因组DNA产量与纯度比较Tab.1 Amount and p urit y of meta g enomic DNA from marine sediment sam p les方法A260/A230A260/A280DNA产量/(n g㊃μL-1) SoilMaster TM试剂盒法CTAB结合SDS法CTAB结合玻璃珠法SDS结合蛋白酶K法0.870.780.740.851.391.381.091.62412.6365.2375.4545.8 2.3海洋底泥宏基因组DNA电洗脱纯化在粗提物中,DNA含量与提取物颜色成正比关系:黑褐色越深,DNA含量越高.电洗脱纯化中,因紫外照射的DNA对后期建库阳性克隆效率有影响,因此纯化过程中只将DNA Marker和部分目的胶条进行溴化乙锭染色观察,而后与目的胶条拼接来获取所需宏基因组DNA进行后续472大连理工大学学报第54卷实验(见图2).M 核酸相对分子质量标准;粗提宏基因组DNA图2 电洗脱法纯化海洋底泥宏基因组DNAFi g .2 The p urified marine sediment meta g enomicDNA b y electroelution分别以粗提宏基因组DNA 及电洗脱法与柱式腐殖酸清除试剂盒法纯化后的DNA 为模板,进行16S rDNA 扩增,纯化后DNA 长度与理论值一致,而以粗提宏基因组DNA 为模板无法得到扩增产物,说明纯化效果较好(见图3).与试剂M BM5000DNA Marker ;1~3电洗脱法纯化16S rDNA 扩增结果;4~6试剂盒法纯化16S rDNA 扩增结果;7~9粗提宏基因组DNA 16S rDNA 扩增结果图3 以纯化后的DNA 为模板扩增的16SrDNA 琼脂糖电泳结果Fi g .3 A g arose electro p horesis of am p lified 16S rDNAwith p urified DNA as tem p late盒法相比(见图4),电洗脱法纯化获取DNA 收率和纯度高㊁浓度较大,其A 260/A 280为1.8908,A 260/A 230为2.2014(见表2),可满足后续建库筛选工业酶制剂要求.因此,针对海洋底泥样品,应选用电洗脱法对其进行纯化.M 1Fosmid 对照DNA ,42kb ;1电洗脱法纯化DNA ;2试剂盒法纯化DNA图4 试剂盒法与电洗脱法纯化宏基因组DNA 电泳结果Fi g .4 Electro p horesis ofp urifiedmeta g enomicDNA p urified b y kit and electroelution表2 海洋底泥宏基因组DNA 不同纯化方法的比较Tab.2 Com p arison of different p urification methods ofmeta g enomic DNA from marine sediment样品A 260/A 230A 260/A 280纯化前试剂盒法纯化电洗脱法纯化0.85001.16022.2014 1.62001.82351.89083 结 语环境DNA 的提取和纯化是构建宏基因组文库㊁获取环境微生物资源的关键所在.宏基因组DNA 提取方法主要有直接裂解法和间接裂解法.据报道[9-11],间接裂解法至少需要10~100g 样品量才能满足后期建库需求.本研究海洋底泥样品采集困难,确定1.0g 海洋底泥提取环境宏基因组DNA.基于海洋底泥微生物多样性的特性,海洋底泥样品中含有大量腐殖酸与重金属离子,水分㊁盐分含量高,黏稠度高并含有少量的贝壳碎片等杂质,运用现有DNA 提取技术到底能回收环境中多少类型微生物的核酸信息仍不清楚[12].选用温和的提取方法,环境中大部分革兰氏阴性细菌能被裂解,而革兰氏阳性细菌几乎不能被裂解;572 第3期王晓辉等:海洋底泥环境DNA 提取与纯化方法比较研究采用剧烈的提取方法,有可能获得环境中革兰氏阳性细菌的信息,但所得的环境DNA又将被严重剪切,无法满足构建大片段环境宏基因组文库的要求[13].不可避免地,在构建环境宏基因组文库过程中环境DNA的损失将直接导致 基因遗漏 现象发生,因此,本研究将物理法㊁化学法与酶法相结合,比较4种直接裂解环境DNA提取方法.其中化学与物理结合法即CTAB结合玻璃珠法提取DNA样品严重降解,可能由于玻璃珠等对样品完整性有一定破坏.SoilMaster TM试剂盒法虽然裂解效果明显,然而其样品浓度较低,离心柱式的收集方式影响DNA片段收率.化学法即采用CTAB结合SDS法能获取一定收率DNA,但DNA片段降解严重.因此,化学与酶法相结合即SDS结合蛋白酶K法提取海洋底泥DNA效果最佳.评价一种DNA提取方法是否有效,一般需从以下几个方面考虑:DNA是否发生降解且所提取的片段是否完整;能否去除样品中大量存在的影响后续实验的物质,如腐殖酸㊁腐殖酸类似物㊁酚类化合物和重金属离子等[11].其中又以腐殖酸和腐殖酸类似物的抑制作用最明显,它们主要通过干扰裂解㊁使核酸降解或非特异性吸附和抑制酶活性方式起作用.基于海洋底泥样品的特点,环境DNA纯化主要是去除腐殖酸与无机盐成分.根据后续实验建库筛选酶制剂要求,纯化后的DNA需要满足DNA纯度和收率高与完整性好等要求.试剂盒法简单,然而纯化效果不明显,离心柱收集影响了DNA的收率,同时破坏了DNA 的完整性.电洗脱法步骤相对烦琐,但低压㊁长时间(10h以上)的电泳利于DNA与杂质充分分离.电洗脱纯化中将Marker和部分目的条带切除染色观察,避免紫外照射对目的DNA影响.整个过程操作温和,极大地保护了宏基因组DNA 片段的完整性.根据建库需求,选择电洗脱法对环境DNA进行纯化效果最佳,纯化后的环境DNA 其A260/A280为1.8908,A260/A230为2.2014,片段均大于42kb,为后期构建海洋底泥宏基因组文库筛选具有潜在工业生产与应用价值新型生物催化剂奠定基础.参考文献:[1]Whitman W B,Coleman D C,Wiebe W J.Prokar y otes:the unseen ma j orit y[J].Proceedin g s ofthe National Academ y of Science,1998,95(12):6578-6583.[2]Amann R I,Ludwi g W,Schleifer K H.Ph y lo g enetic identification and in situ detection ofindividual microbial cells without cultivation[J].Microbiolo g ical Reviews,1995,59(1):143-169.[3]Martin-Laurent F,Phili pp ot L,Hallet S,et al.DNA extraction from soils:old bias for newmicrobial diversit y anal y sis methods[J].A pp liedand Environmental Microbiolo gy,2001,67(5):2354-2359.[4]Roh C,Villatte F,Kim B G,et p arativestud y of methods for extraction and p urification ofenvironmental DNA from soil and slud g e sam p les[J].A pp lied Biochemistr y and Biotechnolo gy,2006,134(2):97-112.[5]Brad y S F.Construction of soil environmental DNAcosmid libraries and screenin g for clones thatp roduce biolo g icall y active small molecules[J].Nature Protocols,2007,2(5):1297-1305. 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