2018年秋细胞工程【1117】西南大学网络与继续教育学院课程考试试题卷答案

答：植物体细胞杂交是在原生质体培养技术的基础上，借用动物细胞融合方法发展起来的一门新型生物技术。植物体细胞杂交的过程包括原生质体的制备，原生质体融合的诱导，杂种细胞的筛选和培养，以及杂种植株的再生与鉴定等环节。下面以烟草和大豆的体细胞杂交为例，简要介绍植物体细胞杂交的过程。
原生质体制备选取烟草植株上的幼嫩叶片和培养好的大豆细胞，用酶解法制备原生质体。烟草的原生质体呈绿色，大豆的无色，在显微镜下很容易将二者区别开来。
5.简述真核生物细胞周期调控的分子机理。
答 ：真核生物细胞中存在有复杂的调节细胞周期的关键分子，它们通过相互制约或偶联形成复杂而精确的细胞周期调控网络。在这些关键分子中，cyclin(细胞周期蛋白)和CDK(cyclin-dependent kinase，周期蛋白依赖激酶)是两类主要的调控分子。细胞周期运行的动力主要来自CDK，其活性则主要通过cyclin调节。CDK的活性还受另外一类蛋白质的负向调节，这类蛋白质被称为CKI(cydin-dependent kinase inhibitor，周期蛋白依赖激酶抑制子) 。因此，科学家形象地把CDK比作引擎，而cyclin则是油门，CKI是刹车(吴家睿，2002)。
植物细胞周期的调控主要有两类CDK(CDK-a、CDK-b)和两类细胞周期蛋白(CycB、CycD) 。在环境或激素等外界条件作用下，CycD基因首先表达生成CycD，在相关调节因子的帮助下，CycD与CDK-a结合形成CDK-a-CycD复合体使CDK-a活化，进而对Rb(G1期限制点调控分子)磷酸化，使细胞通过“限制点”进入分裂周期。当细胞进入分裂周期后，则由CDK-b与CycB以及相关的调节蛋白完成从S期到M期的调控。
在继代培养中不断选择那些疏松性好、细胞状态好的细胞不断继代培养，才能获得大量均匀一致、疏松易碎、适合于建立悬浮细胞系的愈伤组织。另外，缩短继代培养的时间间隔，可以有效提高疏松愈伤组织的诱导Hale Waihona Puke 。②悬浮系的建立与继代培养
在培养初期，悬浮细胞培养物可能呈现黏稠状，影响细胞生长，因此每隔3天左右要更换一次新鲜培养基。连续继代培养一段时间后，这种情况可自行消失。
二：论述题（请选择1道题作答，共16分）
1. 现有小鼠及其骨髓瘤细胞、破伤风杆菌抗原，设计一个实验无限生产破伤风杆菌单克隆抗体，并说明实验中使用的技术的应用价值及意义。
2. 如果有一品质和产量不好的植物，希望通过转基因的方法转入能改良其品质和产量的基因，请根据细胞工程中农杆菌介导的方法阐述其转基因的原理、方法、步骤及可能出现的问题等。
为了保持悬浮细胞一直处于一个相对稳定的良好状态，一般每隔1～2周甚至更短的时间就要继代一次。每次继代时均要进行选择，筛选细胞生活力好的细胞继代，淘汰过大和生理状态不好的细胞和细胞团。筛选方法一般采用蔗糖梯度离心法，有时为了简便也可采用过滤法。
③ 悬浮细胞的生长动态
悬浮培养系统中，细胞数量随着培养时间的变化，其扩增生长呈S形曲线。在细胞接种最初的时间内细胞很少分裂，经过一个延迟期(lagphase)，然后进入指数生长期(exponential growth phase)和细胞迅速增殖的直线生长期(linear growth phase)，接着是细胞增殖减慢的减缓期(progressive decelerational phase)和停止生长的静止期(stationary phase )。静止期的细胞数量和质量均会下降，如果继代不及时，长期处于停止期的细胞往往会出现死亡和生活力下降，从而影响整个悬浮细胞系的状态。因此，在通常情况下，当细胞生长进入减缓期时就要及时继代。
动物细胞培养条件在无菌、无毒的环境；培养基营养含有葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素、动物血清等（添加一定量的抗生素，定期更换培养液）；温度在 36.5+（-）0.5度；气体环境有O2和CO2（95%空气和5% CO2 ）。
动物细胞培养技术的应用主要：（1）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。（2）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。（3）用于检测有毒物质。（4）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据
生长素进入细胞后，一部分以游离状态存在，另一部分则与氨基酸结合形成生长素一氨基酸复合体。与生长素结合的氨基酸主要为天冬氨酸，也有谷氨酸。2，4-D、NAA、IAA是常用的3种生长素，前两种为化学合成生长素，IAA为生物合成生长素，植物细胞本身也具有合成IAA的能力。研究认为，与细胞分裂素相似，生长素的复合体形式是钝化形式，而游离形式才具有诱导和调控作用，培养效果与游离生长素的含量成显著正相关。2，4-D在进入植物体后，能够持续地以游离形式存在，与氨基酸的结合量很少。但IAA进入细胞后大多与氨基酸结合形成复合物，游离形式很少。NAA则介于二者之间(表)。因此，不同生长素可能具有不同的作用方式。
接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长，因此，根据培养目的的不同，悬浮细胞的起始密度一般可在每毫升(0.5-2.5)×105个细胞间进行调整。如果只是一般继代培养，则可适当选择低密度接种，以延长培养周期，减少继代培养的操作。但如果希望在较短时间内获得大量活跃生长的细胞，则可适当提高接种密度，这样可缩短继代培养时间。起始密度通常通过细胞计数的方法确定。
原生质体融合取等量的烟草和大豆的原生质体混合后，加入聚乙二醇溶液。在显微镜下观察，可以看到原生质体相互黏集在一起。隔一段时间后，加入高钙、高pH的溶液，这时原生质体才开始融合。原生质体融合包括膜融合和核融合两个过程。诱导融合只能诱导细胞膜的融合，两个核的融合是在杂种细胞第一次有丝分裂时进行的。
杂种细胞的筛选和培养烟草与大豆的原生质体融合后，将原生质体转移到适当的培养基上培养，使原生质体再生出细胞壁。这时，在细胞混合物中，不仅有烟草—大豆杂种细胞，还有烟草细胞、大豆细胞、烟草—烟草细胞、大豆—大豆细胞。杂种细胞的筛选，可以用机械方法，也可以用生理学或遗传学的方法。以机械方法为例，根据两种亲本细胞在形态、色泽上的差异，将细胞分别接种在带有小格的培养皿中，每个小格中约放1～3个细胞。在显微镜下找出杂种细胞，并且标定位置。等杂种细胞分裂成细胞团时，转移到培养皿中，培养成愈伤组织。
近年来的研究还证明，植物激素对生长发育的调控是通过复杂的信号转导途径实现的，不同的生长素均具有各自独立的生长素受体。这些研究指出，尽管不同生长素在离体培养中具有类似的作用，但它们调控细胞生长与分化的途径和方式可能存在较大差异。对于各种生长素作用方式和调控途径的深入了解，将对离体培养中器官分化的有效调控具有重要意义。
植物激素是离体培养中所必需的条件，因此，与植物激素相关的基因表达被认为是启动细胞脱分化的关键。在细胞脱分化和促进细胞分裂的过程中，PSKα可能介导了与生长素和细胞分裂素密切相关的信号转导途径。
6、简述动物细胞培养技术的原理、方法和应用价值。
答：动物细胞培养就是从动物机体内取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。
杂种植株的再生与鉴定杂种植株的再生是指从愈伤组织培养出杂种植株的过程。由于烟草和大豆分别属于茄科和豆科，二者的原生质体融合后，至今只能长成杂种愈伤组织，还不能分化，因此谈不上杂种植株的再生和鉴定。对于能够再生出杂种植株的，如烟草—海岛烟草、白菜—甘蓝、胡萝卜—羊角芹等，长出的植株究竟是不是杂种，还需要经过鉴定才能确定下来。杂种植株的鉴定方法有形态学方法、生化方法(如电泳)、细胞学方法(如染色体组型分析)、分子生物学方法(如分子杂交)等
动物细胞培养通常选择动物胚胎或幼龄动物的组织、器官，它们细胞增殖能力强，分裂旺盛，分化程度低，容易培养。
在进行动物细胞培养时，用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是蛋白质。动物细胞培养适宜的PH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶(7.2-8.4)的活性较高。通常使用液体悬浮培养。
3. 简述超低温保存的概念及常用的超低温保存方法。
答：-80℃以下低温下，活细胞的物质代谢和生命活动几乎完全停止，而恢复到常温后，植物仍能进行正常的生命活动的离体保存方式称为超低温保存。常用保存方法：冷冻诱导保护性脱水的超低温保存和玻璃化处理的超低温保存。
4.简述体细胞杂交中杂种细胞的选择方法，及杂种植株的鉴定方法。
7、建立细胞悬浮培养体系有哪些关键环节？如何调控？
答：
二、论述建立细胞悬浮培养体系，一般采用愈伤组织作为起始细胞来源，以愈伤组织为起始细胞的悬浮培养技术，其关键主要包括愈伤组织诱导、悬浮系的建立与继代培养、细胞生长状态调控等几个环节。
①愈伤组织诱导
以愈伤组织作为细胞悬浮培养的细胞来源，首先就必须诱导出适宜的愈伤组织。诱导愈伤组织，首先必须选择适宜的植物外植体材料其次，培养基的附加成分对建立疏松易散的愈伤组织具有较大的影响，特别是生长素的浓度至关重要。除了生长素外，配合一定浓度的细胞分裂素也是十分必要的。还需附加一定浓度的水解酪蛋白、脯氨酸、谷氨酰胺等有机物质。培养基的蔗糖浓度也会影响愈伤组织的形态。
2.简述体细胞无性系诱变的方法及突变体筛选方法。
答：体细胞无性系变异的表示方法主要有两种：一种是Chaleff（1981）提出的以R0、R1、R2、…分别代表体细胞无性系变异的当代和自交以后的世代；另一种是由Larkin和Scowcroft（1983）提出的以SC1、RC2、RC3、…来分别代表体细胞无性系变异的当代和自交以后的世代.现在,这两种表述方式在体细胞无性系变异研究中均有应用.离体条件下的体细胞无性系变异的筛选有以下一些明显的优点：（1）由于筛选可以在离体条件下进行,从而可以在小空间内对大量个体进行选择.（2）细胞突变体的筛选可以在几个细胞周期内完成,且不受季节限制,因此筛选效率高.（3）因为试验是在人工设计的培养条件下进行的,因此诱变和筛选条件可以根据需要进行调节和控制,从而提高了试验的重复性.（4）由于变异是在单细胞水平上进行的,因此,一个突变体就是来自一个细胞,不会有非突变细胞的干扰,避免了整体植株水平上无性变异常呈现出的嵌合体,因而可以省去变异分离的麻烦.（5）在细胞培养系统中,理化诱变剂可较均匀地接触细胞,因此可以引起培养细胞相对较高频率地发生突变,增加了选择机会.一、体细胞变异诱导材料的选择选择起始材料需根据试验目标确定,一般需考虑以下几方面的问题：其一,目标性状的可行性.体细胞突变的频率虽然较高,但对于某一个体来讲,变异的性状是个别的,因此选择综合性状良好的植物品种材料,通过诱变改变个别不良性状,是体细胞突变系选择的目的.其二,必需充分考虑试验植物的细胞培养技术水平,只有对起始材料有良好的培养技术,才有可能制定完满的诱变及选择方案.如果起始细胞的培养技术不成熟,不能再生整株,则不能进行后续的各项操作.其三,适当的细胞类型亦是提高体细胞突变系筛选效率的重要条件.二、培养细胞的自发变异离体培养的植物细胞会出现较高频率的自发变异,离体培养中体细胞自发突变所产生的变异往往比较稳定,没有人工诱变的后续干扰,有利于分离和选择.育种家们应用自发突变的这些优点,已选育出一些新品种,如美国RNA植物技术公司已从番茄体细胞无性系变异中选育出新品种,台湾的育种家也从甘蔗体细胞无性系再生植株变异中选育出新品种