慢病毒携带shRNA对乳腺癌HPA基因表达的抑制作用
小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定
小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定一、本文概述本文旨在探讨小鼠Zhangfei基因过表达和shRNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定。
我们将详细介绍Zhangfei基因在小鼠体内的功能和作用，以及其在生物学研究中的重要性。
接着，我们将阐述过表达和shRNA干扰技术在基因功能研究中的应用，并解释为何选择慢病毒载体作为本研究的工具。
在构建过表达慢病毒载体方面，我们将采用基因克隆技术将小鼠Zhangfei基因插入慢病毒载体，以实现目的基因的高效表达。
同时，我们将对构建的过表达载体进行严格的鉴定，包括PCR、测序和Western Blot等方法，以确保载体的正确性和有效性。
在构建shRNA干扰慢病毒载体方面，我们将设计并合成针对小鼠Zhangfei基因的特异性shRNA序列，并将其插入慢病毒载体以干扰Zhangfei基因的表达。
我们将对构建的shRNA干扰载体进行同样的鉴定步骤，包括PCR、测序和Western Blot等方法，以确保载体的正确性和有效性。
我们将对构建的过表达和shRNA干扰慢病毒载体进行功能验证，以评估其在小鼠体内对Zhangfei基因表达的调控效果。
本研究的成果将为进一步揭示Zhangfei基因的功能和机制提供有力的工具，并为相关疾病的治疗提供新的思路和方法。
二、材料与方法2 载体：慢病毒载体pLV-IRES-Puro和pLV-shRNA2购自Clontech 公司。
3 酶和试剂：限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA Marker、PCR 引物、PCR试剂等购自TaKaRa公司；胎牛血清（FBS）和DMEM培养基购自Gibco公司；脂质体转染试剂购自Invitrogen公司；RNA提取试剂盒和逆转录试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司；小鼠Zhangfei基因的cDNA序列通过PCR从小鼠cDNA文库中扩增得到。
4 仪器：PCR仪、凝胶电泳仪、超净工作台、离心机、细胞培养箱、荧光显微镜、倒置显微镜等。
RNA干扰和小 RNA在癌症中的作用机制研究
RNA干扰和小 RNA在癌症中的作用机制研究RNA干扰和小RNA在癌症中的作用机制研究近年来，癌症已成为全球医学界关注的一大问题，许多研究机构和学者都在研究癌症的治疗方法和机制。
其中，RNA干扰和小RNA在癌症中的作用机制引起了广泛的关注。
1. RNA干扰RNA干扰指的是在一些物种中发现的一种与后转录过程相关的现象，通常是通过使用双链RNA来触发这种干扰作用。
一些研究表明，RNA干扰可能有助于抵抗肿瘤的发生。
RNA干扰的基本原理是通过切割mRNA，并将其降解为短的非编码RNA序列。
这些非编码RNA序列通常被称为siRNA （small interfering RNA）或shRNA（short hairpin RNA）。
这些RNA序列结合到RISC（RNA诱导沉默复合体）中，并引导RISC 到靶标的mRNA，从而切割靶标的mRNA，并阻止其进一步翻译成蛋白质。
最近的一些研究表明，RNA干扰还可能参与调节一些在癌症细胞中异常表达的基因。
例如，一些TRAIL基因在癌症中表达异常，这可能导致细胞抗凋亡能力的提高，从而导致癌症的生长和扩散。
然而，在一些研究中发现，使用RNA干扰将TRAIL的表达抑制，可以抑制癌细胞的生长和扩散。
2. 小RNA小RNA是指长度在20-30个核苷酸之间的RNA序列。
小RNA通常分为miRNA（microRNA）和siRNA（small interfering RNA）两类。
miRNA在基因表达调控中发挥了重要作用。
研究表明，miRNA可以通过下调调控基因的mRNA表达量来抑制基因的表达，从而影响细胞的生长、凋亡和分化等功能。
miRNA在癌症的发生和发展中也发挥了重要作用。
一些miRNA的表达异常可能导致细胞凋亡的下调，从而导致癌细胞的生长和扩散。
例如，一些miRNA在癌症中表达下调，这可能抑制一些细胞凋亡途径的活性，从而导致癌症的生长和扩散。
siRNA可以通过RNA干扰作用来抑制基因的表达。
shRNA对乳腺癌细胞VEGF-C表达的抑制作用
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年 第 3 6 卷第 3 期
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［ 要 ］ 目的 ： 立 高 效 稳 定 的 造 血 相 关 的 Ｐ Ｘ相 互作 用 蛋 白质 （ Ｐ Ｐ 小 干 扰 Ｒ Ａ（ｉ Ｎ 细胞 导 入 方 法 ， 测 摘 建 Ｂ Ｈ Ｉ） Ｎ ｓ Ａ） Ｒ 检 Ｈ Ｉ 的表 达 对肿 瘤 细 胞 生长 增 殖 的 影 响。方法 ： 建 人 Ｈ Ｉ ＰＰ 构 Ｐ Ｐ慢病 毒 ｓ Ｎ 干扰 载体 ， 重组 质 粒 转染 人 胚 肾 ２ ３ ｉ Ａ Ｒ 将 ９Ｔ 细 胞 ， 通 过 实 时 定 量 Ｒ — Ｃ 及 Ｗｅｔｒ ＴＰＲ ｓ ｎ印 迹 分 析 检 测 Ｌ ｎｉ Ｈ１ Ｐ Ｐ ｓ Ｎ 的干 扰 效 果 ； 将 Ｌ ｎｉ Ｈ１ ＨＰＰ ｅ ｅ ｔ Ｈ Ｉ ｉ Ａ — Ｒ ｅ ｔ Ｉ — ｓ Ｎ 与 ４个 包 装 质 粒 共 同 转染 ２ ３ ｉ Ａ Ｒ ９ Ｔ细胞 ， 装 成 慢 病 毒 后 ， 染 宫 颈癌 Ｈｅ ａ和 肝 癌 Ｈｅ Ｇ 包 感 Ｌ ｐ ２细 胞 ， 嘌呤 霉 素 筛 经
慢病毒携带shRNA对内皮细胞组织因子表达的抑制作用
表 达 。结 论 ：成 功 构 建 了携 带人 基 因 的 Ｒ Ａ 慢 病 毒 栽体 ， 病 毒 携 带 的 短 发 夹 干扰 Ｒ Ａ 能 干 扰 内 Ｎｉ 慢 Ｎ
皮 细胞 中 的表 达 ， 为 血栓 栓 塞性 疾病 的 防 治提 供 一 种 有 效 的 方 法 。 可
［ 键 词 ］ 组 织 因子 ； Ｒ Ａ ； 慢 病 毒 栽 体 关 Ｎｉ 【 中图 分 类号 ］ Ｒ ４； ６ ５ ７ ［ 献标 识 码 ］ Ａ ［ ３ Ｒ ０ ９ ２ 文 文章 编 号 ］ ｌ ７ ． ３ ７（ ０ ８ ０ ．６ ２ ０ ６ ２７ ４ ２ ０ ） ８０ ８ ．６
慢病 毒 携 带 ｓＲ Ａ对 内皮 细 胞 组 织 因子 表 达 的抑 制 作 用 ｈＮ
熊石 龙 ，王 前 ，郑 磊 ，包 杰 ，黄 宪 章 ，刘 竞 争 ，曾 方银 ，裘 宇 容
shRNA对乳腺癌细胞VEGF-C表达的抑制作用的开题报告
shRNA对乳腺癌细胞VEGF-C表达的抑制作用的开题报告
题目: shRNA对乳腺癌细胞VEGF-C表达的抑制作用
背景：
乳腺癌是目前全球最常见的女性恶性肿瘤之一。
VEGF-C是一种重要的血管生成因子, 在乳腺癌的生长和转移中发挥着重要作用。
研究表明, VEGF-C水平的升高与乳腺癌细胞的侵袭和转移有关。
因此, 抑制VEGF-C的表达可能有利于抑制乳腺癌的发展和转移。
研究内容:
本研究将采用shRNA技术, 合成几个不同的VEGF-C shRNA序列, 并转染到乳腺癌细胞中, 从而实现对VEGF-C表达的抑制。
之后, 通过Western blot和实时荧光定量PCR等方法检测VEGF-C蛋白和mRNA的表达情况, 以评估shRNA对VEGF-C表达的抑制效果。
同时, 利用Transwell和Matrigel划痕实验等方法探究shRNA对乳腺癌细胞侵袭和转移能力的影响, 进一步证明shRNA能否抑制乳腺癌的发展和转移。
意义：
本研究将为研究VEGF-C在乳腺癌中的作用提供新思路, 并为乳腺癌的治疗提供新的治疗策略。
通过shRNA技术的应用, 可以实现对基因的针对性调节, 进一步深化对乳腺癌发生和发展机制的理解, 为治疗乳腺癌提供新的思路和方法。
RNA干扰技术抑制乳腺癌SKBr3细胞HER2的表达
RNA干扰技术抑制乳腺癌SKBr3细胞HER2的表达【摘要】构建含表皮生长因子受体2基因(HER2)的短发夹状双链RNA(shRNA)重组质粒,体外观察对人乳腺癌细胞SKBr3的HER2 mRNA及蛋白表达的影响。
方法利用分子克隆技术,将含HER2的双链DNA,与经双酶切后的载体pSilencer连接,构建重组质粒,在脂质体的介导下转染高表达HER2的乳腺癌细胞系SKBr3。
分析HER2 mRNA的表达,Western blot检测蛋白的表达,MTT法测定细胞增殖情况。
结果酶切鉴定证实重组质粒构建成功,转染后能明显抑制HER2 mRNA及蛋白的表达,抑制细胞的增殖。
结论构建的重组质粒能有效地降低人乳腺癌细胞HER2的表达,抑制细胞的增殖,为HER2高表达预后不良的乳腺癌基因治疗提供新策略。
【关键词】 RNA干扰受体表皮生长因子乳腺肿瘤瘤细胞培养的基因表达表皮生长因子受体2(HER2)在包括乳腺癌在内的多种上皮源性肿瘤中过度表达,与乳腺癌的发生、发展、预后等关系密切[1],是极具发展前途的基因治疗靶位。
约有30％乳腺癌患者伴随有HER2及其基因产物的过表达,HER2过表达是乳腺癌病人不良预后的重要标记物。
RNA干扰是近年来发展起来的基因阻断技术,它通过将双链NA)导入细胞后,在Dicer酶的作用下产生有活性的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),与该段RNA同源mRNA产生特异性降解,从而导致特异基因表达抑制的转录后基因沉默现象。
笔者采用RNA干扰(RNAi)技术抑制人乳腺癌细胞株SKBr3细胞HER2的表达,探讨利用质粒表达载体体内合成siRNA的方法能否有效介导肿瘤细胞出现RNAi，从而为乳腺癌的基因治疗提供新策略。
1材料和方法材料细胞株SKBr3细胞(人乳腺癌细胞株，湖南远泰生物技术有限公司)。
主要试剂逆转录酶、TaqDNA聚合酶(立陶宛MBI公司);质粒美国Ambion公司);限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ和T4DNA连接酶、100 bp DNA ladder(大连宝生物技术公司);RMPI 1640培养基、Trizol 和Lipofectamine 2000(美国Invitrogen公司);MTT(美国Sigma公司);鼠抗人HER2单克隆抗体(美国R&D公司);TMB Western Blot 试剂盒(美国KPL公司)。
慢病毒介导shRNA稳定干扰P210_bcr_abl_基因表达的体内外研究
文章编号（Article ID）：1009－2137（2012）05－1090－05·论著·慢病毒介导shRNA稳定干扰P210bcr/abl基因表达的体内外研究朱玉峰，王元占*，孟凡义1南方医科大学南方医院实验动物研究中心，1血液病科，广东广州510515摘要P210bcr/abl融合基因在慢性髓系白血病（CML）发生、发展中起重要作用。
针对P210bcr/abl融合基因的小分子抑制剂（如伊马替尼）治疗CML非常有效，但容易产生耐药性。
P210bcr/abl基因的融合区为RNA干扰其表达提供了一个特异性靶点。
本研究通过病毒载体建立能同时表达P210bcr/abl shRNA和P210bcr/abl基因的BaF3细胞系，并探讨慢病毒介导的shRNA对P210bcr/abl基因表达的作用。
用荧光显微镜检测慢病毒对BaF3细胞的感染率，用台盼蓝拒染法检测细胞的增殖能力；用RT-PCR和Western blot分别检测P210bcr/abl mRNA和蛋白的表达。
结果发现，P210bcr/abl shRNA能使BaF3-P210bcr/abl细胞中的P210bcr/abl mRNA及蛋白表达明显下降，并且能增强BaF3-P210bcr/abl细胞对伊马替尼的敏感性，与不表达P210bcr/abl shRNA的BaF3-P210bcr/abl细胞相比，伊马替尼对该细胞系的IC50下降50%以上。
将该细胞由尾静脉移植到受致死剂量照射的裸小鼠体内，移植该细胞的小鼠生存期较移植BaF3-P210bcr/abl细胞的小鼠生存期明显延长。
结论：稳定表达针对P210bcr/abl基因融合区的shRNA可能增强CML常规治疗的效果。
关键词慢性髓系白血病；P210bcr/abl融合基因；RNA干扰；慢病毒载体中图分类号R733．72；Q7文献标识码AStable Interference on P210bcr/abl Gene Expression by Lentiviral Vector-delivered shRNA In Vitro and In VivoZHU Yu-Feng，WANG Yuan-Zhan*，MENG Fan-Yi1Experimental Animal Research Center，1Department of Hematology，Nanfang Hospital，The Southern Medical University，Guangzhou510515，Guangdong Province，China*Corresponding Author：WANG Yuan-Zhan，Associate Senior Scientist．Tel：（020）61641041．E-mail：yydws@fimmu．comAbstract P210bcr/abl fusion gene is indispensable for generation and progression of chronic myeloid leukemia（CML）．Small molecule inhibitors，such as imatinib，are effective for P210bcr/abl gene mediated CML，but drug resistance may occur．The unique fusion junction of P210bcr/abl gene is an attractive target for therapeutic intervention using RNA interference（RNAi）．This study was purposed to constructed the BaF3cell line by viral vector which can stably express P210bcr/abl shRNA and P210bcr/abl mRNA at the same time，and investigate the effect of lentiviral-victor-delivered shRNA on P210bcr/abl gene expression．The infective rate of lentiviral vector on BaF3cells with P210bcr/abl gene was assayed by fluorescent microscopy；the cell proliferation ability was determined by trypan blue exclusion；the P210bcr/abl mRNA and protein expressions were detected by RT-PCR and Western blot respectively．The results found that stable expression of the P210bcr/abl shRNA resulted in obvious inhibition of P210bcr/abl mRNA and protein expression and increased sensitivity of these P210bcr/abl gene transformed Ba/F3cells to imatinib．The IC50to imatinib in these cells decreased＜50%as compared with Ba/F3-P210bcr/abl cells which did not express P210bcr/abl mRNA．The survival time of the lethal dose irradiated mice induced by intravenous injection of these Ba/F3cells was longer than the other group induced by Ba/F3-P210bcr/abl．It is concluded that stable expression of shRNA targeting the P210bcr/abl gene fusion junction may potentiate the effects of conventional therapy for CML．Key words CML；P210bcr/abl gene；RNA interference；lentiviral vectorJ Exp Hematol2012；20（5）：1090－1094慢性髓系白血病（chronic myelogenous leu-kemia，CML）是累及骨髓造血干细胞的一类恶性肿瘤，表现Ph染色体或P210bcr/abl基因阳性是CML患者的分子遗传学特征［1，2］。
慢病毒表达载体研究全长组织因子对乳腺癌的作用
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的迁 移并对其生长速 度产生了一定 的影 响。在肿瘤细胞 中下调 ｆ ｌ Ｔ Ｆ的表达 ，能在一定 程度上抑制肿 瘤细胞 的迁移和生 长 。结论 慢病毒表达载体在 ｆ ｌ Ｔ Ｆ的表 达对 乳腺 癌细胞 的影 响中得 到成功应用 ， ｆ ｌ Ｔ Ｆ可作为抑制肿瘤细胞 生长和迁移 的
靶分子 ，下调 ｆ ｌ Ｔ Ｆ的表达或许能为乳腺癌的临床治疗 开辟 一条新的途径 。
胞周期 的影 响 ，蛋 白印迹法检测 ｆ ｌ Ｔ Ｆ过表达和下调表达 的效果 ，结合 ＭＴ Ｓ 方法检测 ｆ ｌ Ｔ Ｆ 对 细胞增殖 的影 响。结果 ｆ ｌ Ｔ Ｆ
siRNA和shRNA：通过基因沉默抑制蛋白表达的工具
siRNA和shRNA：通过基因沉默抑制蛋白表达的工具RNA干扰（RNAi）是有效沉默或抑制目标基因表达的过程，该过程通过双链RNA（dsRNA）使得目标基因相应的mRNA选择性失活来实现的。
RNA干扰由转运到细胞细胞质中的双链RNA激活。
沉默机制可导致由小干扰RNA（siRNA）或短发夹RNA（shRNA）诱导实现靶mRNA的降解，或者通过小RNA（miRNA）诱导特定mRNA翻译的抑制。
这篇综述将重点介绍shRNA和siRNA是如何导致蛋白质表达抑制的。
通过几种蛋白的活性（下面讨论），通过短反义核酸（siRNA和shRNA序列）锁定细胞mRNA，从而实现其随后的降解。
这反过来阻断了该蛋白的进一步表达/聚集，导致其水平的下降，最终实现抑制作用。
[放大]图1.siRNA和shRNA结构。
（A）siRNAs是短的RNA双链，在3‘端有两个碱基的游离。
（B）shRNA由正义链和反义链通过环状序列隔开共同组成。
（C） shRNA构建用于插入表达载体。
源自 [1, 2] 。
背景调控途径的发现和组成元件早在1984年人们就发现反义RNA能够抑制基因的表达。
1993年，Nellen和Lichtenstein提出了一个模型来解释这个观察。
然而，直到1998年，Fire等人发表了在线虫RNA干扰的结果，他们发现双链RNA在抑制基因表达方面实际上比单链RNA更有效。
最终确定小RNA 途径涉及的蛋白质组分有许多与RNA 干扰途径一样。
表一总结了RNA 干扰机制的主要元件。
它们包括锁定靶基因的双链RNA （siRNA 或shRNA ）、Dicer 酶，Argonaute 蛋白家族的蛋白质（具体来说是Ago-2）、Drosha 、RISC 、TRBP 和PACT 。
术语描述 siRNA 小干扰（siRNA ），有在3’端有两个碱基的游离，可激活RNA 干扰，通过与目标mRNA 互补结合序列特异性地实现mRNA降解。
shRNA 短发夹RNA （shRNA ） ，包含一个环结构，可加工成siRNA ，也可通过与目标mRNA 互补结合序列特异性地实现靶mRNA 降解.Drosha 是一种核糖核酸酶III 的酶，可加工细胞核中的前体-miRNA和shRNA 。
慢病毒向量在基因治疗中的应用
慢病毒向量在基因治疗中的应用随着科技的不断发展，基因治疗逐渐成为医学领域的一项重要技术。
基因治疗是一种以基因为靶点，通过改变特定基因的表达或功能，达到治疗特定疾病的效果。
其中，载体是基因治疗的重要组成部分之一。
而慢病毒向量作为一种常用的基因载体，在基因治疗中的应用愈发广泛。
一、慢病毒向量基础慢病毒向量是一种能将目标基因有效插入到患者染色体的病毒。
其属于反转录病毒，其遗传物质RNA到DNA的反向转录过程在自然界中是常见的。
通过科学家的改造和控制，慢病毒向量能够转录低毒性的反向转录酶，并可在细胞内转录为可重复插入到染色体特定位点的基因序列。
这使它成为理想的基因治疗载体。
与其他常用载体（如腺病毒、质粒等）相比，慢病毒向量更加可靠，不会随着细胞分裂而被“丢失”，因此能长久地维持需要治疗的基因。
二、慢病毒向量在基因治疗中的优势1.高效性慢病毒向量的高效性是其在基因治疗中得以广泛应用的一个重要原因。
研究表明，慢病毒向量能够有效地将基因传递到细胞内，并在细胞内稳定地表达。
此外，慢病毒向量还可以传递大量的基因序列，这使得慢病毒向量能够处理较为复杂的遗传治疗问题。
2. 致病性低与其他病毒种类相比，慢病毒向量的致病性极低。
因此，慢病毒向量应用于人体更为可靠。
此外，慢病毒向量的表达效果与细胞类型的差异较小，因此适用于不同类型的细胞和组织。
3. 免疫耐受性慢病毒向量具有免疫耐受性，这使得基因治疗能够持续较长时间。
对于治疗复杂疾病的情况，这种优势尤为明显。
三、1.遗传病治疗慢病毒向量在治疗遗传病方面具有广泛的应用前景。
一些遗传性疾病由于缺失或突变了某些基因，导致其合成的蛋白质不足或功能异常，出现一系列问题。
而慢病毒向量能够稳定地将目标基因插入到患者体内，以恢复其失去或异常的功能，从而达到治疗的效果。
目前，像丙型肝炎、癌症等有一定遗传素质影响的疫苗治疗都利用了慢病毒载体。
2.造血干细胞移植造血干细胞移植是一种可以治疗像贫血、再生障碍性贫血等疾病的方法。
shRNA下调MTDH基因表达抑制乳腺癌细胞上皮-间质转化的开题报告
shRNA下调MTDH基因表达抑制乳腺癌细胞上皮-间质转化的开题报告一、课题背景乳腺癌是世界上最常见的女性恶性肿瘤之一，占女性恶性肿瘤发病的25%。
乳腺癌发生和发展是一个多基因、多步骤的过程，涉及多个通路和分子的参与。
近年来，研究表明，乳腺癌细胞的上皮-间质转化（EMT）是导致肿瘤转移和耐药的重要机制之一。
因此，寻找和研究影响乳腺癌细胞EMT的分子，具有重要的研究意义和临床应用价值。
马赛克瘤蛋白（MTDH）是一种媒介细胞凋亡和细胞周期调节的分子，在调节肿瘤发展和肿瘤细胞EMT中起着重要作用。
研究表明，MTDH的高表达与肿瘤恶性转移和预后不良密切相关。
因此，抑制MTDH的表达可能是一种治疗乳腺癌的新策略。
二、研究目的本研究旨在探究shRNA下调MTDH基因表达对乳腺癌细胞EMT的影响，为乳腺癌的治疗提供新思路和实验依据。
三、研究内容1.构建shRNA干扰质粒载体：将shRNA序列克隆到合适的质粒载体上，以实现对MTDH基因的RNA干扰作用。
2.稳定转染乳腺癌细胞株：采用转染技术将构建好的shRNA干扰质粒转染到乳腺癌细胞中，筛选出稳定转染的细胞株，并鉴定其MTDH基因表达下调的效果。
3.检测EMT相关指标：通过Western blot和实时荧光定量PCR等方法，检测MTDH基因表达下调后细胞EMT相关标志物表达的变化，如E-cadherin、N-cadherin、vimentin和β-catenin等。
4.细胞功能实验：检测MTDH基因表达下调后乳腺癌细胞的细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化，以及与机体免疫系统的互作情况。
四、预期结果本研究预期通过shRNA下调MTDH基因表达，抑制乳腺癌细胞EMT 的发生和发展，从而抑制肿瘤的转移和复发。
同时，也为乳腺癌的治疗提供新思路和实验依据。
五、研究意义本研究不仅可以深入探究MTDH在乳腺癌发生发展中的作用机制，还有望为寻找乳腺癌治疗的新策略和靶向药物提供理论和实验基础，具有较高的临床应用价值。
慢病毒介导RNAi下调LMP2A基因表达抑制EB病毒相关胃癌细胞的体外生长
慢病毒介导RNAi下调LMP2A基因表达抑制EB病毒相关胃癌细胞的体外生长王芳军;高昳;刘兵团;王文平;刘鹏飞【摘要】背景:EB病毒(EBV)与多种人类肿瘤,如Burkitt淋巴瘤以及鼻咽癌、胃癌等上皮性肿瘤相关.病毒编码的潜伏膜蛋白2A(LMP2A)存在于部分EBV相关胃癌(EBVaGC)中,与肿瘤发生、发展密切相关.目的:应用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)技术抑制LMP2A基因表达,探讨下调LMP2A对EBVaGC细胞体外生长的影响.方法:构建慢病毒载体pGCSIL-LMP2A-shRNA-LV和阴性对照载体并转染EBVaGC 细胞株GT38,以real-time PCR和蛋白质印迹法检测慢病毒载体的抑制效率,CCK-8实验、克隆形成实验和流式细胞术检测GT38细胞的细胞生长、细胞周期和细胞凋亡.结果:GT38细胞转染LMP2A-shRNA-LV后,LMP2A mRNA和蛋白表达分别下调65.4%和50.8%,进而导致细胞体外增殖受抑,克隆形成能力降低,G0/G1期细胞比例增加,细胞凋亡率增高,与转染阴性对照慢病毒载体和未予转染慢病毒的GT38细胞相比,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:慢病毒介导的RNAi技术能高效抑制LMP2A基因表达,进而抑制EBVaGC细胞的体外生长,诱导G0/G1期阻滞,促进细胞凋亡.LMP2A可作为EBVaGC基因治疗的潜在靶点.%Background:Epstein-Barr virus (EBV)is associated with various human lymphoid and epithelial malignancies such as Burkitt'slymphoma,nasopharyngeal carcinoma and gastric carcinoma. LMP2A,a virus-encoded latent membrane protein is expressed in a portion of EBV-associated gastric carcinoma (EBVaGC)and has been shown to be related with the tumorigenesis and progression of EBVaGC. Aims:To explore the effect of LMP2A silencing on growth of EBVaGC cells in vitro by using alentivirus-mediated RNA interference (RNAi)to inhibit LMP2A gene expression. Methods:A lentivirus vector pGCSIL-LMP2A-shRNA-LV and a negative control vector were constructed and transfected into the EBVaGC cell line GT38. Real-time PCR and Western blotting were used to determine the inhibitory effect of the lentivirus vector;CCK-8 assay,colony formation assay and flow cytometry were employed to assess the cell growth,cell cycle and apoptosis of GT38 cells. Results:In GT38 cells transfected with LMP2A-shRNA-LV,the expression level of LMP2A mRNA was decreased by 65. 4%,and that of LMP2A protein was reduced by 50. 8%;the cell proliferation was inhibited,the colony formation ability was suppressed,the percentage of cells in G0 / G1 phase and apoptotic rate were increased when compared with those transfected with negative control vector or without transfection (P < 0. 05). Conclusions:Lentivirus-mediated RNAi is effective for silencing LMP2A gene expression,subsequently inhibiting the growth of EBVaGC cells,inducing G0 / G1 phase arrest and enhancing cell apoptosis in vitro. LMP2A is supposed to be a potential target for gene therapy of EBVaGC.【期刊名称】《胃肠病学》【年(卷),期】2017(022)012【总页数】6页(P711-716)【关键词】潜伏膜蛋白2A;EB病毒感染;胃肿瘤;RNA干扰;慢病毒感染;细胞增殖;细胞凋亡【作者】王芳军;高昳;刘兵团;王文平;刘鹏飞【作者单位】东南大学医学院附属江阴医院消化内科 214400;东南大学医学院附属江阴医院消化内科 214400;东南大学医学院附属江阴医院消化内科 214400;东南大学医学院附属江阴医院消化内科 214400;东南大学医学院附属江阴医院消化内科 214400【正文语种】中文EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)为人类γ疱疹病毒，可长期存在于人体细胞内但不产生任何症状[1]。
慢病毒介导shRNA靶向下调Cx26表达对人高侵袭性肝癌细胞上皮间质转化及侵袭的影响
慢病毒介导shRNA靶向下调Cx26表达对人高侵袭性肝癌细胞上皮间质转化及侵袭的影响阳洁;覃贵慧;陈军泽【摘要】目的：探讨慢病毒介导shRNA靶向下调缝隙连接蛋白26（Cx26）表达对人高侵袭性肝癌细胞上皮间质转化（EMT）及侵袭的影响。
方法用慢病毒介导Cx26-shRNA感染SK-Hep-1细胞并用嘌呤霉素筛选稳转细胞。
荧光定量PCR和Western blot检测干扰效率。
光镜观察细胞形态改变。
Western blot检测EMT 上皮标志物E-cadherin、间质标志物vimentin的蛋白表达水平。
Transwell侵袭实验检测细胞侵袭能力变化。
结果成功建立稳定下调Cx26表达的SK-Hep-1细胞（shRNA-Cx26组），与感染EGFP空载体（shRNA-control组）及未感染的SK-Hep-1细胞（blank-control组）比较，其Cx26 mRNA和蛋白表达均明显降低（P<0.01），间质细胞形态转变为上皮细胞形态，E-cadherin蛋白表达明显增多、vimentin蛋白表达明显减少（P<0.01），体外侵袭能力也显著降低（P<0.01）。
结论靶向下调Cx26表达能抑制人高侵袭性肝癌SK-Hep-1细胞的EMT和体外侵袭。
%Objective To explore the effect of lentivirus-mediated shRNA interference of Cx26 on epithelial-mesenchymal transition (EMT) and invasion of highly invasive human hepatocellular carcinoma cells in vitro. Methods SK-Hep-1 cells were infected with the lentivirus for delivering Cx26 shRNA, and the stably transfected cells were selected by puromycin. The interference efficiency of shRNA-Cx26 was assessed with real-time PCR and Western blotting. The morphological changes of the transfected SK-Hep-1 cells were observed microscopically, and the protein expressions of E-cadherin and vimentin were detected using Westernblotting. The effect of Cx26 interference on the invasiveness of SK-Hep-1 cells was determined by Transwell invasion assay. Results Compared with SK-Hep-1 cells infected with empty EGFP vector and uninfected cells, the cells transfected with shRNA-Cx26 showed significantly reduced mRNA and protein expressions of Cx26 (P<0.01), which resulted in obvious morphological conversion from mesenchymal cells to epithelial cells. shRNA-Cx26-transfected cells showed significantly increased E-cadherin protein expression (P<0.01) but decreased vimentin expression (P<0.01) with obviously attenuated invasive ability in vitro (P<0.01). Conclusion Targeted down-regulation of Cx26 expression can inhibit the EMT and invasion of SK-Hep-1 cells in vitro.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2014(000)012【总页数】5页(P1743-1747)【关键词】缝隙连接蛋白26;肝癌;上皮间质转化;侵袭;shRNA【作者】阳洁;覃贵慧;陈军泽【作者单位】广西医科大学药学院药理学教研室，广西南宁 530021;广西医科大学药学院药理学教研室，广西南宁 530021;广西医科大学第一临床医学院，广西南宁 530021【正文语种】中文肝癌是临床恶性程度高、预后极差的常见肿瘤之一。
沉默乙酰肝素酶联合那屈肝素对肺癌细胞的抑制作用及其机制
沉默乙酰肝素酶联合那屈肝素对肺癌细胞的抑制作用及其机制庄喜兵;袁素娟;张琪;吕名鹤;程韵枫;乔田奎【期刊名称】《癌变.畸变.突变》【年(卷),期】2022(34)6【摘要】目的:研究慢病毒转染沉默乙酰肝素酶(HPA)联合那屈肝素(nadroparin)的协同抗肿瘤作用,并探讨其潜在的分子机制。
方法:以肺癌A549细胞系为研究对象,探讨利用慢病毒介导沉默HPA和/或联合那屈肝素处理后对A549细胞的影响。
抑制试验共设6组,分别为空白对照组(A549细胞)、阴性对照组(转染阴性对照shRNA序列)、沉默HPA组(转染HPA shRNA)、空白对照+那屈肝素组、阴性对照+那屈肝素组和shRNA+那屈肝素联合组。
分别采用CCK-8检测各组细胞活力,酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞培养液中转化生长因子(TGF-β1)含量,体外侵袭实验(transwell)检测各组细胞迁移和侵袭能力的差异,Western blot检测各组细胞TGF-β信号通路中主要蛋白TGF-β1、磷酸化Smad2/3、锌指E盒结合同源框1(ZEB-1)、锌指转录因子SNAIL、TWIST相关蛋白、E钙黏蛋白(E-cadherin)、N 钙黏蛋白(N-cadherin)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达情况。
结果:通过慢病毒转染shRNA,成功建立了HPA沉默的A549细胞株。
与2个对照组相比,各组细胞经沉默HPA和/或联合那屈肝素处理后,CCK-8检测结果显示,单独抑制HPA或那屈肝素处理可轻微抑制细胞活力,而联合处理会显著抑制细胞活力(P<0.05);单独处理后TGF-β1的表达减少(P均<0.05),联合组TGF-β1表达减少更显著(P<0.05);单独HPA沉默或那屈肝素均能抑制细胞迁移和侵袭能力,两者联合时效果更显著(P<0.05)。
Western blot同样证实了HPA沉默或那屈肝素均可不同程度诱导TGF-β1、p-Smad2/3、ZEB-1、TWIST、SNAIL、N-cadherin和MMP-2表达下调(P均<0.05),E-cadherin表达上调(P<0.05),且联合处理组效果更显著(P<0.05)。
慢病毒介导shRNA靶向ZNF217抑制胶质瘤细胞生长、迁移和侵袭
慢病毒介导shRNA靶向ZNF217抑制胶质瘤细胞生长、迁移和侵袭罗起胜;栗学玉;黄海能;邓元央;黄华东;符黄德;罗琨祥;李传玉;覃成箭;韦展亮【摘要】目的：探讨癌基因ZNF217对胶质瘤U251细胞迁移、侵袭以及增值的影响以及相应的分子机制。
方法构建shRNA-ZNF217慢病毒干扰载体，在将其包装成成熟的慢病毒后感染胶质瘤U251细胞。
Western blot检测ZNF217干扰效率。
利用transwell、Boyden、MTT和流式细胞仪分别检测细胞迁移、侵袭、增殖以及细胞周期能力的改变。
western blot检测相应基因表达改变。
结果与对照细胞相比，ZNF217基因在慢病毒shRNA-ZNF217作用下，其表达水平在胶质瘤U251细胞中显著下调。
Transwell和Boyden结果显示，在抑制ZNF217表达后细胞迁移和侵袭能力也明显下降。
此外，MTT和流式细胞仪分析结果表明，细胞的增值和周期转化能力也明显降低。
机制分析显示，在抑制ZNF271表达后，磷酸化的PI3K/AKT以及癌基因C-Myc和间质标志物N-Cadherin活性减低，而上皮标志物E-Cadherin活性增高。
结论 ZNF217在胶质瘤中通过激活PI3K/AKT 上调C-Myc基因以及调控上皮向间质转化相关基因（Epithelial–mesenchymal transition EMT）从而促进细胞生长、迁移和侵袭。
%Objective To explore the role of ZNF217 in regulating cell proliferation, migration and invasion in glioma cells. Methods A lentivirus-mediated shRNA-ZNF217 vector was infected into glioma U251 cells, and the interference efficiency was examined by Western blotting. MTT assay, flow cytometry, Transwell assay, and Boyden chamber assay were used to analyze the changes in cell proliferation, migration and invasion. Western blotting was used to detect the changes in ZNF217-related genes in the cells. Results shRNA-ZNF217transfection significantly inhibited the expression of ZNF217 in U251 cells and suppressed the cell migration, invasion, growth, and cell cycle transition. ZNF217 knockdown downregulated the expression of pPI3, pAKT, C-Myc, and the mesenchyme biomarker N-cadherin, and stimulated the expression of the epithelium biomarker E-cadherin. Conclusion ZNF217 promotes cell migration, invasion, and growth by activating PI3K/AKT signal to upregulate C-Myc and by modulating the genes associated with epithelial-mesenchymal transition in glioma cells.【期刊名称】《南方医科大学学报》【年(卷),期】2015(000)007【总页数】5页(P1024-1027,1033)【关键词】ZNF217;胶质瘤;shRNA【作者】罗起胜;栗学玉;黄海能;邓元央;黄华东;符黄德;罗琨祥;李传玉;覃成箭;韦展亮【作者单位】右江民族医学院附属医院神经外科，广西百色 533000;右江民族医学院附属医院神经外科，广西百色 533000;右江民族医学院附属医院神经外科，广西百色 533000;右江民族医学院附属医院神经外科，广西百色 533000;右江民族医学院附属医院神经外科，广西百色 533000;右江民族医学院附属医院神经外科，广西百色 533000;右江民族医学院附属医院神经外科，广西百色 533000;右江民族医学院附属医院神经外科，广西百色 533000;右江民族医学院附属医院神经外科，广西百色 533000;右江民族医学院附属医院神经外科，广西百色533000【正文语种】中文神经胶质瘤简称胶质瘤，是发生于神经外胚层的肿瘤。
慢病毒载体在RNA干扰中的应用
慢病在周期性和非周期性细胞干细胞受精卵以及分化毒在宿主细胞内能以病毒rna为模板在自身反的后代细胞中表达shrna实现在多种类型的细胞转录酶的作用下合成cdna再以此cdna为模板和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性沉合成双链dna经环化后通过病毒整合酶作用整默为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地合在宿主细胞的染色体上并长期表达
shRNA抑制外源绿色荧光蛋白在肝癌细胞株中的表达
shRNA抑制外源绿色荧光蛋白在肝癌细胞株中的表达闫歌;黄爱龙;唐霓;张秉强;向明确;蒲丹【期刊名称】《重庆医科大学学报》【年(卷),期】2003(28)6【摘要】目的 :构建绿色荧光蛋白 (GFP)的短发夹状RNA(shRNA) ,观察其在哺乳动物细胞中抑制外源GFP的表达。
方法 :设计、合成含GFP编码基因片段 ,中间被4个bp间隔的反向重复序列 ,与转录载体 pTZU6 +1连接 ,构建pshRNA—GFP 重组质粒 ,与pEGFP -C1共转染肝癌细胞株HepG2和SMMC - 772 1,检测其对GFP表达的影响。
结果 :pshRNA—GFP对共转染的 pEGFP -C1中的绿色荧光蛋白有明显的抑制作用 ,抑制率达 70 %～ 85 %。
结论 :构建的 pshRNA—GFP重组质粒能有效地抑制GFP在哺乳动物细胞中的表达。
【总页数】4页(P681-684)【关键词】RNA干扰;绿色荧光蛋白;短发夹状RNA【作者】闫歌;黄爱龙;唐霓;张秉强;向明确;蒲丹【作者单位】重庆医科大学病毒性肝炎研究所【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.siRNA抑制外源绿色荧光蛋白在neuro-2a细胞株中的表达 [J], 张小勤;李峰;赵艳;彭映基;潘玉春;孟和;崔芳岩2.shRNA表达质粒抑制耐阿霉素的人乳腺癌细胞株(MCF-7/AdrR)绿色荧光蛋白表达的研究 [J], 干惠珠;张桂珍;张凤春;卜丽莎;杨绍娟;高申;郑德明3.增强型绿色荧光蛋白与单纯疱疹病毒Ⅰ型胸苷激酶共表达质粒载体构建及在肝癌细胞株HepG2表达的研究 [J], 唐勇;刘作金;周世骥;蒋金伟;刘长安4.shRNA表达载体特异性抑制人脑胶质瘤细胞BT325绿色荧光蛋白基因的表达[J], 赵澎;张亚卓;孙梅珍5.shRNA抑制SGC7901胃癌细胞绿色荧光蛋白基因的表达 [J], 马晋平;詹文华;汪建平;彭俊生;高劲松;朱孝峰;殷勤伟因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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慢病毒携带shRNA对乳腺癌HPA基因表达的抑制作用cancer. Methods: The HPA genes were chosen as target gene, 3 pairs expression vectors of recombinant lentivirus carried shRNA were constructed according to the sequence designed principle of interfering RNA (RNAi) were transfected in MDA-MB-231 cell of breast cancer. Western Blot was used to detect the expression level of HPA gene in vitro, and the breast cancer model was constructed for vivo verification, and then the expression level of HPA gene was detected by using immunohistochemistry. Results: In vitro experiment, both of the HPA-shRNA-1 group and HPA-shRNA-2 group effectively inhibited the expression of HPA gene in MDA-MB-231 cells of breast cancer. In vivo experiment, the expression of HPA gene of HPA-shRNA-2 group was obviously lower than that of negative group and blank group. The difference of positive rate between HPA-shRNA-2 group and blank group was statistically significant (x 2=12.504, P <0.05). And these results revealed that the expression of HPA gene in HPA-shRNA-2 group could be down-regulated in vivo experiment. Conclusion: The HPA is chosen as the targeting point to construct recombinant lentiviral vector carried shRNA, and the results of vitro and vivo experiment reveals that the expression of HPA gene can be down-regulated in the two groups. This result verifies that the new method can provide new targeting point for targeted therapy of breast cancer.[Key words] Breast cancer; HPA; shRNA; MDA-MB-231 cell; Immunohistochemistry; Western Blot[First-author’s address] Department of The First Surgery, Affiliated Hospital of Chengde Medical University, Chengde 067000, China.作者简介陈国利,男,(1980- ),硕士研究生，主治医师。
承德医学院附属医院外一科，从事乳腺癌基础与临床研究。
收稿日期：2017-04-28e103242.Gao YQ,Pan BC,Sun W,et al.Anxiety symp-tomsamong Chinese nurses and the associated factors: a cross sectional study[J].BMC Psychi-atry,2012,12:141.张兴贵,郑雪.青少年学生大五人格与主观幸福感的关系研究[J].心理发展与教育,2005,21(2):98-103.Kaufman SB,Quilty LC,Grazioplene RG,et al.Openness to experience and intellect differentially predict creative achievement in the arts and sciences[J].J Pers,2016,84(2):248-258. Sampaio A,Soares JM,Coutinho J,et al.The bigfive default brain: functional evidence[J].Brain Struct Funct,2014,219(6):1913-1922.曾进辉.体育锻炼与大学生人格特征的关系研究[J].重庆科技学院学报,2007(5):193-194.ConnVS.Anxiety outcomes after physical acti-vity interventions:meta-analysis findings[J].Nurs Res,2010,59(3):224-231.金胜真.体育锻炼对大学生焦虑情绪影响的元分析[J].体育研究与教育,2015(2):67-73.*基金项目：承德市科学技术研究与发展计划项目(20151029)“探讨以HPA为靶点治疗乳腺癌可行性”①承德医学院附属医院外一科 河北 承德 067600②承德医学院附属医院小儿内科 河北 承德 067000③承德市平泉县医院药剂科 河北 平泉 067500④承德市隆化县医院外二科 河北 隆化 068150*通讯作者：chenguoli1015@[9] [10] [11] [12] [13] [14] [15]学术论著乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，也是导致女性死亡主要肿瘤之一，且呈逐年上升趋势，严重威胁女性的身心健康，甚至生命安全。
目前的研究认为，乳腺癌是全身性疾病，病因尚不清楚，可能与乳腺良性疾病、雌激素、孕激素、环境因素以及生活方式等有一定关系，乳腺癌目前的治疗方案与以往大不相同，目前以手术切除为主，配合放化疗和内分泌治疗以及生物治疗的个体化综合治疗。
尽管乳腺癌患者5年生存率明显提高，但是乳腺癌的复发和转移仍然是导致患者死亡的主要原因，因此乳腺癌的复发转移是急需攻克的难题。
乙酰肝素酶(heparanase，HPA)是目前发现的一种能裂解硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的β-D糖苷内切酶，HPA通过降解细胞外基质和诱导血管生成促进乳腺癌的复发转移[1]。
本研究以HPA基因为靶点构建HPA短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)重组慢病毒表达载体，通过体内、体外实验研究靶向抑制乳腺癌HPA基因表达的可行性，为乳腺癌的基因治疗寻找新的靶点。
1 材料与方法1.1 设备材料和试剂(1)Thermo Forma培养箱(美国，Thermo Electron 公司)；Cytoprep-1离心机(长沙英泰仪器有限公司)。
(2)慢病毒包装293T 细胞和人乳腺癌M D A -MB-231细胞株均购自上海市中科院细胞库；L-15培养基和胰酶购自美国Gibco公司；胎牛血清购自杭州四季青公司；Mouse monoclonal to Heparanase 1抗体购自英国abcam公司；慢病毒系统由上海吉玛制药技术有限公司合成；健康BALB/C雌性裸鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。
(3)细胞可溶性蛋白制备试剂购自上海GenMed Scientifics公司；Trizol试剂盒购自美国Invitrogen公司；SYBR Premix Ex Taq荧光实时定量PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司；1.2 体外实验方法(1)乳腺癌MDA-MB-231细胞培养。
乳腺癌MDA-MB-231细胞株接种于含10%胎牛血清L-15培养基中，放置于37℃、5%CO2培养箱内培养。
(2)靶向HPA shRNA序列设计。
以HPA为靶点，根据shRNA序列设计原则，设计出的shRNA序列见表1。
(3)HPA shRNA慢病毒表达载体的构建和重组慢病毒的包装。
将合成寡核苷酸片段退火形成双表1 HPA 特异性干扰序列序列号干扰序列HPA-shRNA15’GCAAGCCTCCAAGGTAGTAAG3’HPA-shRNA25’GCTTGCGTCCTTTCTGAAATA3’HPA-shRNA35’GGAGAATGTAGCTCTCGTTAT3’HPA-阴性对照5’GTTCTCGCTACGTGTGAGCGT3’链DNA，PCR扩增、回收、纯化。
双链DNA经T4 DNAligase与线性化质粒连接，转化DH5α大肠杆菌，挑取重组阳性克隆进行测序鉴定。
将293T细胞进行培养，当密度达到70%～90%开始转染，用HPA-RNA干扰(RNA interfering，RNAi)序列重组质粒和病毒包装3个质粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)，共转染细胞293T，72 h后收集上清液，离心(10000 r/min，3 min)，过滤浓缩获得慢病毒浓缩液，并测定慢病毒原液的滴度，分装后在-80 ℃保存。
(4)HPA shRNA重组慢病毒转染乳腺癌MDA-MB-231细胞效果检测。
实验中将细胞分为5组：①HPA-shRNA-1组；②HPA-shRNA-2组；③HPA-shRNA-3组；④HPA-阴性对照组；⑤空细胞组。
其中，除空细胞组外的1～4组MDA-MB-231细胞分别感染HPA shRNA-1、HPA shRNA-2、HPA shRNA-3和HPA shRNA-阴性对照慢病毒，空细胞组未做任何处理。
将感染后的细胞培养72 h后在荧光显微镜下观察转染效率。
(5)采用蛋白质印迹(western blot)法检测HPA 的表达。
转染72 h后去除各组细胞培养液，用PBS 洗涤细胞，通过RIPA裂解液裂解细胞，提取细胞总蛋白，采用考马斯亮蓝法蛋白定量，10% SDS-PAGE电泳分离后转移到PVDF膜，封闭转印膜2 h，然后加入稀释HPA单克隆抗体，于冰箱内4 ℃温育12 h，洗涤，加入稀释二抗，在室温温育2 h后显色，通过凝胶成像系统分析，采用3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)为内参照。