热休克蛋白70大鼠脑弥漫性轴索损伤后神经元保护及修复作用研究

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热休克蛋白 ?% 大鼠脑弥漫性轴索损伤后神经元 保护及修复作用研究
李红旗， 章 翔， 费 舟， 吴景文， 贺晓生， 白红民 （ 解放军第四军医大学西京医院， 陕西 西安 ?!%%"$ @
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是低分子量 HGI. 家族、 中分子量 HGI. 家族、 HGI#% 家族、 HGIV% 家族、 在神经元兴奋性损伤中研究最多是 HGI#% 家 HGI!!% 家族。 族 @B A 。 提高细胞对应激原 HGI#% 的主要功能是维持细胞蛋白自稳， 的耐受性， 使细胞维持正常的生理功能。正常情况下 HGI#% 位于 细胞浆内， 当细胞受到热休克刺激时， 细胞核内 HGI#% 迅速增加； 细胞处于恢复阶段，细胞核内的 HGI#% 消失，细胞浆内仍有低水 平 HGI#% 表达。=3.. 等研究发现 HGI#% 阳性神经元均保持正常 的形态结构
" 注： &’ ) 组与对照组及各时间组比较， K e %= %! 讨论
等电点将 BCD 分成 N 大类 （ 或家族） ， 分别 BCD 依其分子量、
中国临床康复 $%%$ 年 & 月 第 ’ 卷 第 ( 期 )*+,-.- /012,34 05 )4+,+634 7-*38+4+939+0,: ;<2+4 $%%$: =04> ’: ?0> (
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学实验动物中心提供） ， 体重（ 随机分为正常对照组（ $N% O $%） P， !% 只） 和 L:M 损伤组（ ， 损伤组再分为损伤后 #、 N% 只） $& 、 &’、 ?$ ) 及 每一时限各 !% 只动物。 ? I 等 N 个观察时限， != $ 动物模型的制作 用 !Q 的戊巴比妥钠按 &% RP S AP 对大鼠 行腹腔注射麻醉， 然后固定于大鼠 L:M 装置上 E& G ， 待其苏醒时按动 使脑组织受到角加速度损伤， 装置， 使其头部在 "% R- 内旋转 T%U， 制成头颅侧向旋转脑损伤模型。损伤后严密观察，保持呼吸道通 畅， 于笼中喂养。 != " 免疫组织化学测定 理： 每组大鼠均用 !Q 戊巴比妥钠 &% RP S AP 腹腔注射麻醉后迅速 开胸暴露心脏， 剪破右心耳， 左心室切口置管至升主动脉， 生理盐 水 !%% R3 快速冲洗， 随后用 &Q 多聚甲醛溶液 （ 灌注 & V， ;B ?= &） 浸入 &Q 多聚甲醛溶液中 # )9 &%% R39 灌毕后立即断头剥离全脑， 然后自来水冲洗 & )9 标本常规脱水、 浸蜡， 石蜡切片 N !R9 捞片后 置于烤箱 N’ W #% V ， 切片脱蜡至水行免疫组织化学 "% R*+ 取出， 测定 （ 武汉博士德生物工程公司提供） ， 柠檬酸缓冲液中电炉加热 !%% V 持续 !% R*+，自然冷却，滴加小鼠成纤维细胞生长因子 H 7XYX @ 单克隆抗体 （ 博士德 !： !%%） & V 孵化 $& )9 滴加 !Z !%% 生 物素化山羊抗小鼠 MPY "? V "% R*+9 滴加 C:[( 复合物 "? V "% 玻片脱水、 透明、 中性树胶封片。正常对照组按照 R*+， L:[ 显色， 上述方法进行为正常脑组织标本制作， %= %! R/3 S \ D[C 代替一抗 作阴性对照正常脑组织为正常对照。以胞质中出现棕黄染色为阳 基金项目： 军队重点学科基金资助项目 H TT‘a‘!&# @ ； 国家自然科学基金 资助项目 H "TT?%$## @ 作者简介： 李红旗 （ ， 男， 河北廊坊人， 主治医师， 硕士， 研究方向 !T#& — ） 为颅脑损伤的神经元保护及修复作用研究。
热休克蛋白 ?%（ 在局部脑缺血 ),28 -)/5A ;1/8,*+-?%， BCD?%） 和全脑缺血性脑损害中研究较多， 认为 BCD?% 是应激状态下维持 细胞稳定的保护性蛋白 E! F " G 。机械性脑损害时 BCD?% 表达特点报 道很少， 为研究脑弥漫性轴索损伤 H I*440-, 2J/+23 *+K01*,- L:M @ 后 神经元保护及损伤修复过程，由于以前无理想的大鼠 L:M 模型， 因而相关报道很少。 现探讨大鼠 L:M 后 BCD?% 表达的发生发展规 律， 为临床防治神经元损伤后的修复提供新的思路和理论基础。 ! 材料与方法 实验动物分组 （ 选择健康雄性 CL 大鼠 #% 只， 第四军医大 性。7XYX 阳性结果判断： 无阳性细胞记为 （ ， 有阳性细胞记为 F） （ 。 各个时间段中阳性染色的百分数为阳性率。 ]） 7XYX 结果判断Z ， 以显微计数尺室上区大脑皮质， 计算 ! RR 长 在光镜下 （ ^ &%%） 内阳性细胞数。 != & B_ 染色 选取额顶部脑组织石蜡切开， 经二甲苯及 !%%Q 、 以蒸馏水冲去残存酒精成分， TNQ 、 ’%Q 、 ?%Q 酒精梯度脱蜡至水， 明矾苏木精染色 ’ R*+， 自来水冲洗浮色 !% -， 以 $Q 盐酸酒精分色 数秒， 自来水冲洗 %= N )， 经 !Q 氨水溶液数秒后自来水冲洗 ! 次， 使胞浆核仁染成红色， 经 %= NQ W !Q 伊红水溶液进行复染 " R*+， 水冲洗祛除伊红浮色。 ?%Q 、 ’%Q 、 TNQ 酒精脱水并分化伊红颜色， 二甲苯透明 N R*+， 中性树胶封片。光 后转入无水酒精脱水 # R*+， 计算 %= ! RR$ 存活神经元数。 镜 &%% 倍下， != N 结果判断及统计学处理 H ! @ BCD 阳性结果判断： 以胞浆中 出现棕黄染色为阳性，无阳性细胞记为阴性，有阳性细胞记为阳 性。 各个时间段中阳性染色的百分数为阳性率。 以光学显微镜（ ^ 计数大脑皮层额顶区 ! RR 区域内的阳性细胞数。H $ @ 统计学 &%%） 分析方法： 数据以均数 O 标准差 H ! 利用 CDCC 软件进行 % O " @ 表示， L:M 损伤组在各个时间点进行如下处 分析， 对照组与 L:M 组之间比较采用 # 检验9 L:M 组内各观察时限 均数的多重比较行方差分析。 $ 结果 对照组大鼠大脑皮层 BCD 只有弱表达。 L:M 损伤组伤后 $& ) 大脑皮层 BCD 表达增加， 伤后 &’ ) 达峰值， ? I 仍维持较高水平。 额顶区大脑皮层损伤的神经元呈阳性表达，整个细胞呈棕黄色。 B_ 染色结果显示损伤后 $& ) 大鼠额顶区皮层神经元均可见到胞 浆粉红、 核浓染， 胞体皱缩、 神经元细胞突起成屈曲螺旋状变形， 变 形神经元主要分布于大脑皮层、 胼胝体、 脑干。 伤后 $&、 额 &’ )， ? I、 顶区皮层神经元数量较对照组明显减少。 BCD 在正常对照组及 L:M 组多时限的表达见表 !。 表! 分组 正常对照组 L:M 组 " BCD 在正常对照组及 L:M 组各时限的表达 H ! % O "9 ( h !% @ 观察时限 #) $& ) &= # O != # N= ? O != N !#= & O $= $ ##= $ O N= ! &’ ) ?= N O != & !N’= ? O !%= ! " ?I ’= N O $= $ T$= ! O !!= $