细胞培养实验步骤大全(精华版)
细胞培养的实验步骤
细胞培养的实验步骤细胞培养的实验步骤如下：1、细胞复苏：细胞培养条件2、复苏流程：（1）确认水浴锅的水清洁可用，方可提前打开37度预热。
（2）确认好复苏细胞的液氮罐中具体位置，并做好复苏登记。
（3）提前做好复苏准备，预热培养基。
（4）悬浮和贴壁细胞复苏参数：（5）将细胞快速放入37度水浴锅中迅速溶解，1.8ml时间大概1分30秒，1ml大概1min左右，需计时，其间不要老是拿起来观察，需要快速复溶，避免细胞受到损伤。
（6）贴壁细胞需离心，1000rpm，5min。
悬浮细胞直接加入预热的培养基中然后放入培养箱中（7）贴壁细胞离心后去除上清，用预热的培养基重悬细胞后加入T25方瓶，蕞后放入培养箱中培养。
（8）取小样计数观察，细胞活力在70%以上算正常。
低于70%活力可能细胞状态不太好，需要培养和恢复。
3、细胞传代培养1．悬浮细胞传代流程：（1）先将装有细胞的摇瓶从培养箱拿出，用酒精喷洒瓶身后将摇瓶拿进超净台。
（2）打开摇瓶瓶盖，用200ul移液器取100~200ul细胞放入1.5mlEP管中，瓶盖过火，拧紧，将培养瓶放回摇床。
（3）将200ul细胞混匀，取10ul细胞加入10ul台盼蓝，显微镜下计数。
根据细胞数决定下游实验。
（4）细胞需计数两次求平均值。
（5）悬浮细胞生长参数（6）根据不同细胞的生长曲线在合适的时间和密度给细胞接种传代。
以sf9细胞为例：细胞接种密度0.4x10^6个/ml,24h密度1x10^6个/ml,48h密度2.4x10^6个/ml,72h密度6x10^6个/ml，此时需要传代细胞。
要求留样100ml0.4x10^6个/ml具体操作如下：计算：需要母细胞体积=100*0.4/6=6.6ml需要培养基体积=100-6.6=93.4ml将上面体积的细胞和培养基加入摇瓶中，放回27度培养箱培养即可2.贴壁细胞传代流程：（1）显微镜下观察细胞状态和密度，80%汇合率以上需要传代。
（2）T25方瓶中加入0.5ml~1ml0.25%胰酶溶液（需37度预热），使瓶底细胞都浸入溶液中。
细胞培养的方法与步骤
细胞培养的方法与步骤1．开紫外灯前先擦超净台，台内紫外30分钟，室内紫外10分钟。
同时将放在4℃内的培养液提前放置到室温。
（可放在抽屉中，防止紫外照射）换液2．先将培养液打开（开一层烧一层），放置在酒精灯旁。
3．将细胞从培养箱中拿出，进超净台前先要喷酒精。
4．打开培养瓶，烧瓶口，而后弯脖朝后，倒液，注意瓶口不要残留液体，若有残液要用纱布擦净。
5．倒培养液（之前要烧瓶口），注意量（5ml）不要再瓶口有残留液体是烧瓶口，否则碳化的培养液会对细胞的生长有毒害作用。
6．倒一瓶封一瓶，迅速放平，培养瓶口拧紧后再松一下，放入培养箱中。
传代2．拿出细胞，开口，烧，倒液。
3．（5ml大枪加3ml）用PBS洗2~3遍（洗净血清，放置血清钝化胰酶）。
4．胰酶消化，37℃5分钟（时间可自控）。
消化程度是细胞不能滑落，要吹落。
500微升胰酶（4×，1%）+1.5mlPBS→工作浓度0.25%（此时要用大枪）。
5．（大枪）加入3mlDMEM完全培养液终止消化，用吸管缓慢吹打壁上的细胞（不要让吸管的嘴端接触到瓶壁）6．将混合物吸入离心管，加封口膜，离心500g 5分钟（此时洗去胰酶）在此期间PBS 洗培养瓶3遍，PBS一定要吸净，否则加入培养液后会产生沉淀（培养瓶要重复使用，至少100次）7．倒掉上清，此时动作要轻或用大枪吸，加入3mlDMEM完全培养液重悬细胞，用吸管吹掉（再洗，清除胰酶）。
8．离心完毕，加入3ml新鲜培养液，再次吹打（约50~100下，视细胞情况而定），防止起泡沫，至细胞单个，圆球状为宜。
9．在培养瓶中加入新鲜培养液4ml，将吹打起来的细胞分配至各培养瓶中（量依需要而定）。
80微升，100微升都可以。
冻存8．在冻存管中加入200微升冻存液，在离心管中加入1000微升冻存液，吹打（防止起泡），移入冻存管中，此段时间不宜过久（DMSO对细胞伤害很大）。
9．封口膜封紧冻存管，可多封几层，用胶布缠紧，只缠一层就行，然后写字。
细胞培养的操作步骤
细胞培养的操作步骤细胞培养是一种在体外培养和繁殖细胞的方法，广泛应用于医学、生物学和生物工程等领域。
下面是细胞培养的操作步骤，包括细胞的收获、传代和检测。
1.材料准备：- 细胞培养基：选择适合细胞类型和培养要求的培养基，常用的包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）和RPMI（Roswell Park Memorial Institute）等。
-细胞：选择合适的细胞系，如人类胚胎肺成纤维细胞（HELF）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）等。
-细胞培养器具：包括培养皿、细胞培养瓶、细胞离心管等。
2.细胞收获：-细胞培养器具消毒：用70%乙醇或其他消毒剂将培养器具进行消毒。
-细胞培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞培养皿涂覆：将培养皿或瓶子内壁涂覆一层细胞黏附物，如明胶或聚-卵氨酸等，以增加细胞附着。
3.细胞传代：-培养基预热：将所需的培养基预先加热至37摄氏度。
-细胞收获：将细胞培养瓶中的培养基倒掉，用生理盐水等缓冲液洗涤细胞。
- 细胞分离：使用胰酶（Trypsin）或胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）将细胞从细胞培养瓶上析离下来。
-细胞计数：使用显微镜和细胞计数板对细胞进行计数，以确定细胞的密度。
-细胞培养：将细胞培养在新的细胞培养瓶中，加入适量的预热培养基。
4.细胞检测：-细胞形态观察：使用倒置显微镜或显微摄像系统观察细胞的形态变化和增殖情况。
- 细胞活力检测：使用细胞活力检测试剂，如MTT（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）或CCK-8（Cell Counting Kit-8）等，评估细胞的存活率和代谢活力。
- 细胞凋亡检测：使用凋亡检测试剂盒，如Annexin V-FITC和PI （Propidium Iodide）等，评估细胞凋亡的程度。
细胞培养操作步骤
细胞培养操作步骤细胞培养是一项用于研究和生产生物技术产品的基础技术。
以下是细胞培养的一般操作步骤：1.实验室准备：-消毒：在开始实验之前，对实验室进行消毒处理，确保实验环境的无菌。
-工具准备：准备好所有需要的培养器具，如离心管、试管、培养皿、吸管等。
-培养基准备：根据实验需要，准备好适当的培养基，并对其进行消毒处理。
2.细胞准备：-细胞收获：收获细胞，并将其转移到一个装有细胞培养基的培养皿中。
-细胞计数：使用细胞计数器或显微镜对细胞进行计数和分析，以确定细胞的浓度和活性。
-细胞传代：如果需要，将细胞进行传代以维持其活性和数量。
3.培养条件：-培养温度：根据细胞的要求，将培养皿放置在适当的温度控制设备中，通常为37℃。
-CO2浓度：对于一些细胞（如哺乳动物细胞），需要提供适当的CO2浓度来维持其生长和代谢。
-培养液更换：根据具体要求，定期更换培养液，以保持细胞的健康生长。
4.细胞培养：-培养基添加：向培养皿中加入适当量的培养基，以提供细胞生长和繁殖所需的养分。
-培养皿处理：将培养皿放入恒温培养箱中，确保细胞在适宜的环境中生长。
-细胞观察：定期使用显微镜观察细胞的生长情况和形态变化，以评估细胞的健康状态。
-培养皿除菌：如果培养皿被发现有细菌或真菌污染，需要将其除菌，以保证细胞的无菌状态。
5.细胞传递：-细胞解离：当细胞达到所需密度或需要进行分离时，使用适当的酶或溶液将细胞从培养皿中解离。
-细胞收获：通过离心，将细胞收集到离心管中，并进行计数和分析。
-细胞传递：将细胞转移到新的培养皿中，重新开始培养过程。
细胞培养是一项复杂而精细的操作，需要高度的无菌技术和细心的操作。
在整个过程中，需要持续监测和调整培养条件，以确保细胞的健康生长和繁殖。
此外，注意遵循实验室的安全规范，保护自己和实验室的安全。
细胞培养的成功与否，将直接影响到后续实验的结果和应用。
细胞共培养实验的步骤及方法
细胞共培养实验的步骤及方法步骤一：准备培养器械和培养基1.1准备无菌仪器和试剂：包括培养皿、培养瓶、离心管、移液器等。
1.2准备无菌培养基：根据实验需要选择合适的培养基。
1.3准备细胞悬液：从培养的细胞系中收获细胞并制备成适宜浓度的细胞悬液。
步骤二：共培养细胞2.1接种细胞：在培养皿或培养瓶中，按照实验计划将两个或以上的细胞系接种在适宜的培养基中。
2.2控制细胞密度：根据细胞生长速度和实验需要，控制每个细胞系的初始细胞密度。
2.3培养条件控制：控制培养条件，如温度、湿度和CO2气体浓度等，满足细胞生长的要求。
步骤三：培养细胞3.1培养时间：根据具体实验设计，培养细胞一定时间，一般从几小时到几天不等。
3.2观察细胞生长：通过显微镜观察细胞增殖和形态学变化。
3.3细胞采集：在培养时间结束后，将细胞用合适的方法采集，如离心收集上清液等。
步骤四：实验分析4.1细胞计数：对采集到的细胞进行计数，得到不同时间点和不同培养条件下细胞的增殖情况。
4.2细胞形态观察：通过显微镜观察细胞在共培养过程中的形态学变化。
4.3细胞功能分析：通过细胞生物学实验方法，如细胞凋亡检测、增殖指标检测等，对细胞功能进行评估。
4.4统计分析：对实验结果进行统计分析，如平均值、方差等统计指标的计算和绘制图表等。
共培养实验的注意事项：1.细胞系的选择：选择适合共培养的细胞系，关注不同细胞系之间的相互作用。
2.培养基的选择：根据实验需要选择合适的培养基，如无血清培养基、特定培养基等。
3.控制细胞密度：合理控制细胞密度，避免过高或过低造成实验结果的偏差。
4.培养条件的控制：严格控制培养条件，如温度、湿度和CO2气体浓度等，保证实验的可重复性和结果的可比性。
5.细胞采集的处理：在采集细胞时注意操作的无菌性，避免细胞污染和误差的产生。
细胞培养的过程及注意事项
36细胞培养旳过程及注意事项细胞旳培养过程及注意事项；根据培养过程中与否需要分割培养物进行再培养而将细；一、原代培养；（一）过程；原代培养旳基本过程包括取材、培养材料旳制备、接种；1.组织块培养法；(1)基本操作过程；1）、用培养液湿润所取组织材料, 并用锋利旳眼科剪；2）、用湿润旳吸管吸取切碎旳组织块, 清清吹到培养；3）、将培养瓶翻转, 使瓶底朝上, 在种植了组织块一；4）、将种植了组织块细胞旳培养过程及注意事项根据培养过程中与否需要分割培养物进行再培养而将细胞培养分为原代培养和传代培养。
一、原代培养（一）过程原代培养旳基本过程包括取材、培养材料旳制备、接种及培养等环节。
原代培养旳措施诸多, 基本和最常用旳是组织块培养法和分离细胞法。
1.组织块培养法(1)基本操作过程1）、用培养液湿润所取组织材料, 并用锋利旳眼科剪将附在其上旳脂肪和结缔组织清除洁净。
再用平衡液（PBS）或Hanks液漂洗；用锋利旳眼科弯剪将组织块剪成小块；再用PBS或Hanks液漂洗多次, 直至液体不浑浊、无油滴、清亮为止。
2）、用湿润旳吸管吸取切碎旳组织块, 清清吹到培养瓶皿中, 并将其按一定间距均匀放在培养瓶底壁上, 量不要过多, 要将组织块切面贴在培养瓶底壁上；3）、将培养瓶翻转, 使瓶底朝上, 在种植了组织块一侧旳对侧面加足培养液, 勿使组织块与培养液接触, 塞紧瓶塞；4）、将种植了组织块旳一侧朝上, 静置于37℃培养箱中；待组织块贴壁1 h到3h后翻瓶, 使贴壁旳组织块浸没与培养液中, 静置；5）、每隔2到3天更换一次培养液, 或者根据培养瓶种颜色旳变化确定换液时间。
2.注意事项1）、组织块接种后旳前3天, 从组织块向外迁徙旳细胞数很少, 组织块旳黏附不牢固, 在观测和移动旳过程中, 注意不要引起液体旳振荡。
要防止常常翻动和振动, 否则组织块不易附着于瓶壁上或附着后也会脱落飘起。
2）、加入旳培养液不适宜过多, 防止浸泡旳组织块受轻微旳波动而脱落下来。
细胞培养流程及注意事项
细胞培养流程及注意事项一、材料准备：1. 设备：细胞培养箱、培养瓶、冰箱、高压灭菌炉、恒温箱、离心机、倒置显微镜、液氮罐、冻存管、离心管、吸管等2、试剂：0.25％胰酶、培养基（DMEM）、胎牛血清（CBS）、二甲基亚砜（DMSO）、双抗(青霉素及链霉素溶液)、PBS缓冲液等3、操作台：放入酒精灯、试管架、镊子、废液缸、离心管、吸管等，并按需要放入培养基、胰酶等试剂，紫外照射30min以上。
（条件允许时实验室紫外照射30min以上）二、复苏细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。
1、准备一个茶缸或水浴盘，内盛37℃的温水。
2、从液氮中取出冻存管，迅速置于温水中并不断搅动。
尽量使其在1--2分钟之内融化。
3、打开冻存管，将细胞悬液吸到离心管中。
（必要时可加入少许培养液）4、1000rpm离心3--5分钟，弃去上清液。
5、加适当培养基后将细胞转移至培养瓶中，37℃培养。
6、记录复苏日期，第二天观察生长情况。
三、观察和换液1、在倒置显微镜下观察细胞生长情况（培养液颜色变化、细胞是否贴壁、密集度如何等）。
2、换液：依据细胞生长快慢，培养液消耗情况（由红到黄），1—3天一换。
操作较简单四、传代（分装）1、取出细胞在倒置显微镜下观察，当细胞长到很密集时需要分装培养（即传代），或只需维持培养时要稀释。
2、将培养液吸出，加入2--3ml胰酶，放入培养箱3-5分钟取出观察确认细胞被完全消化后，加入2-3ml培养液冲洗底壁。
3、将细胞悬液移至离心管，1000rpm离心3--5分钟，弃去上清液。
4、加适当培养液后冲匀细胞，分装到2—3个培养瓶中，每个只需1--2滴细胞悬液即可。
5、培养瓶中加入适当培养基后，做好标记放入培养箱。
五、冻存原理：在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。
细胞培养相关实验步骤
细胞培养相关实验1、复苏细胞步骤：从-80℃冰箱或者-196℃液氮罐中取出细胞（握手心），快速放在37℃水浴箱（提前预热至37℃）轻轻摇晃至变成溶液。
吸取细胞溶液至培养瓶，加入4ml 含10%胎牛血清（FBS）的培养液（DMEM/1640），放37℃、5%CO2敷箱中孵育。
快溶的理由：复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
复苏时动作要快，尽快洗掉二甲基亚砜，否则会造成对细胞严重的毒性。
一般细胞复苏第二天给细胞换液。
2、细胞换液的步骤：准备：75%酒精擦台2遍，紫外线消毒30分钟，复温细胞培养液，显微镜下看细胞生长状态，有无污染。
1）从孵育箱取出培养瓶，直接倒去细胞培养液；2）用枪从离心管中吸取4ml 含10%FBS的DMEM/RPMI 1640，加入培养瓶中；3）酒精喷洒消毒后放入37℃敷箱孵育。
一般2天左右更换细胞培养液，刚复苏的细胞第二天更换培养液。
3、细胞传代的步骤：准备：75%酒精擦台2遍，紫外线消毒30分钟，复温细胞培养液、磷酸缓冲盐溶液（PBS）、胰酶（0.25% Trypsin-EDTA）、FBS，显微镜下看细胞生长状态，有无污染。
1）直接倒去培养瓶内的培养液；2）加入PBS 2ml清洗培养瓶内细胞2次；3）加入胰酶500ul/0.5ml 2～10min（具体时间因细胞而异，可在显微镜下看是否贴壁，必要时轻拍培养瓶促使细胞脱落）；4）加入含10%FBS的培养液1～1.5ml[培养液：胰酶=（2～3）:1]中和胰酶；5）轻轻吹打成单细胞悬液，吹打力度以不起气泡为宜；6）将单细胞悬液吸入10～15ml离心管中，低速离心800rpm 3分钟，后倒去上清液；7）加入含10%FBS细胞培养液1～2ml吹打悬浮细胞；8）细胞分装传代100～500ul/瓶培养，可按1:（2～4）传代，后加入4～5ml含10%FBS培养液，放入37℃5%CO2敷箱中孵育。
4、细胞冻存的步骤：1）离心后的细胞加入冻存液（DMSO：FBS：DMEM=1:3:6）吹打成单细胞悬液，加入冻存管1ml/管，A、放4℃30分钟，-20℃30分钟，-80℃过夜或者-196℃液氮罐永久保存；或者B、放装有异丙醇的冻存盒直接放-80℃冰箱冻存。
细胞培养流程
细胞培养流程细胞培养是生物学实验中常用的一种技术手段，通过细胞培养可以使细胞在体外环境中持续生长和繁殖。
细胞培养流程包括细胞的分离、传代、培养和检测等步骤，下面将详细介绍细胞培养的流程及注意事项。
1. 细胞分离。
细胞培养的第一步是从组织或细胞悬液中分离出需要的细胞种群。
常用的方法包括机械分离、酶消化和细胞筛选等。
在进行细胞分离时，需要注意避免对细胞造成损伤，保证细胞的完整性和活力。
2. 细胞传代。
细胞传代是指将细胞从一个培养皿中移植到另一个培养皿中，以维持细胞的生长和增殖。
在进行细胞传代时，需要注意细胞的密度和培养基的配比，以确保细胞的正常生长和分裂。
3. 细胞培养。
细胞培养是指将分离和传代后的细胞放置在含有营养物质和生长因子的培养基中进行培养。
培养基的选择和配制对细胞的生长和表型具有重要影响，需要根据不同类型的细胞进行合理选择。
4. 细胞检测。
在细胞培养过程中，需要对细胞进行定期的检测，包括形态学观察、生长曲线分析、细胞纯度检测等。
通过对细胞的检测，可以及时发现细胞的异常情况，并采取相应的措施进行处理。
细胞培养过程中需要注意的事项：保持无菌操作，细胞培养过程需要在无菌条件下进行，避免细胞受到外界污染。
控制培养条件，包括温度、湿度、CO2浓度等，确保细胞在适宜的环境中生长。
定期更换培养基，培养基中的营养物质和生长因子会随着时间逐渐耗尽，需要定期更换新的培养基。
避免细胞过度传代，过度传代会导致细胞老化和突变，影响细胞的生长和功能。
总之，细胞培养是一项复杂而又重要的实验技术，正确的细胞培养流程和操作规范对于细胞生物学研究具有至关重要的意义。
希望本文介绍的细胞培养流程及注意事项能够对您有所帮助，祝您的细胞培养工作顺利进行！。
医学实验中细胞培养的基本操作教程
医学实验中细胞培养的基本操作教程细胞培养是医学实验中常用的技术手段，可以通过培养细胞体外研究细胞结构、功能、代谢以及疾病的发病机制。
本文将介绍医学实验中细胞培养的基本操作教程，包括无菌操作、细胞传代和细胞培养基的制备。
一、无菌操作1. 器具准备：将工作区域和培养器具用70%乙醇喷雾消毒，将所需器具放入无菌工作台，待干燥后再进行后续操作。
2. 细胞培养基准备：将所需的细胞培养基放入无菌环境中，根据实验需求添加适量的血清、抗生素等。
3. 细胞取样：取出培养物中所需的细胞，使用吸管或移液器将细胞转移到无菌的培养基中。
4. 细胞传播：将细胞和培养基混合均匀后，转移到培养皿或培养瓶中，注意避免皿壁的污染。
5. 无菌操作结束：将使用过的培养器具进行无菌处理，清理工作区域并进行必要的消毒。
二、细胞传代1. 始代细胞收获：当细胞在培养器中达到一定密度后，使用细胞解离液将细胞从底物上解离下来。
2. 离心：将解离的细胞转移到离心管中，以适当的转速离心沉淀细胞。
3. 上清液去除：倒掉离心管中上清液，注意尽量不要干扰到细胞沉淀。
4. 细胞悬浮液制备：使用无菌PBS洗涤离心沉淀的细胞，再添加适量的细胞培养基将其悬浮均匀。
5. 细胞传代操作：将悬浮细胞转移到新的培养器具中，注意避免气泡的产生，并将培养基置于CO2孵化箱中培养。
三、细胞培养基的制备1. 培养基组成：根据实验需求，制备含有特定成分的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。
2. 液体消毒：将容器进行高温高压灭菌，确保培养基的无菌。
3. 配方调整：按照实验需求向培养基中添加适量的血清、抗生素、谷氨酸等。
4. 混合均匀：使用无菌器具将添加好成分的培养基搅拌均匀，确保各成分充分溶解。
5. 培养基保存：将制备好的培养基用无菌器具装入培养瓶中，标明日期和成分，存放于4℃的冰箱中，避免阳光直射。
以上就是医学实验中细胞培养的基本操作教程，从无菌操作、细胞传代到培养基的制备，这些基本技术对于医学实验中的细胞研究至关重要。
细胞培养实验步骤
细胞培养实验步骤细胞培养是一种常用的实验技术，用于研究和培养人类及动物细胞以及微生物细胞，以便进行细胞生物学、免疫学、生物药剂学等领域的研究。
下面是细胞培养的一般步骤，供参考：1.预备培养物品：包括培养基、生长因子、惰性气体（例如二氧化碳、乙烷等）等。
2.消毒操作：将培养器皿、培养板、培养液等较小的物品放入70%乙醇中浸泡，或用高温高压灭菌。
3.培养基配制：根据需要的培养细胞类型选择相应的基础培养基（例如DMEM、RPMI-1640等），根据实验要求添加适当的补充物质（如胎牛血清、抗生素等），调节pH值。
4.细胞分离和传代：a）将需要培养的细胞从体内或体外取出；b）用消化酶（如胰蛋白酶）或化学脱附剂（如牛血清白蛋白）处理细胞；c）通过离心等操作，去除胶原颗粒、纤维素等杂质；d）将细胞悬浮于培养基中，数量适量；e）将细胞装入培养皿中，加入适量的培养基。
5.细胞观察：使用显微镜观察细胞的生长状态、数量、形态特征等。
6.细胞培养环境控制：a）保持恒定的温度：多数细胞培养在37℃下进行；b）提供合适的湿度：使用培养器内的水槽或加入水来增加湿度；c）提供适度的无菌环境：在洁净工作台或无菌箱内进行，注意操作无菌技术，避免细菌等污染细胞。
7.细胞培养的传代：细胞的生长速度快，细胞排列紧密，细胞密度太高会使细胞分泌代谢产物过多，阻碍细胞增殖，因此需要定期传代。
传代前要先将细胞分散（用胰蛋白酶或牛胰酶等处理），将培养皿中的细胞悬液分装到新的培养皿内。
8.细胞培养的净化：细胞培养过程中，细胞环境容易被菌落污染，因此需要进行细胞净化。
方法有：检测培养液的菌落数目，观察培养皿内是否有细菌、真菌等的生长，如发现污染现象，立即停止使用被污染的培养皿和培养液。
9.细胞培养的冻存：细胞培养过程中，保留一部分细胞进行冻存，以备后续的实验使用。
常用方法是将细胞悬液和DMSO混合后，存放在液氮中保存。
以上是细胞培养的一般步骤。
但不同类型的细胞具有不同的培养要求，实验者还需根据实际情况进行具体调整和处理。
细胞培养的步骤
细胞培养的步骤
1.提取细胞：从组织样本中提取细胞是第一步。
这通常涉及对组织样
本进行机械和/或化学消化，以分离细胞并减少细胞团块。
2.细胞计数：对提取的细胞进行计数。
这可以通过使用像细胞计数器
这样的工具，或通过使用显微镜和涂片来实现。
3.培养基的准备：准备和调配培养基，以支持细胞的生长和增殖。
培
养基通常包含氨基酸、糖类、盐类、维生素和其他必要的营养物质。
4.培养皿的准备：选择正确的培养皿，如培养瓶、板、碟等。
这些容
器必须经过灭菌，以确保细胞在无菌条件下生长。
5.细胞接种：将已计数的细胞放入已准备好的培养皿中。
细胞的密度
和细胞数量应根据您的实验需求而定，以确保细胞在培养基中生长和繁殖。
6.细胞培养条件：定期观察细胞的生长情况，包括其形态、数量和细
胞状态。
确保充足的培养基，在恰当的温度和湿度下培养好细胞。
7.细胞传代：细胞被传代时，将细胞从一个细胞培养皿中转移到另一
个细胞培养皿中。
传代可以用于扩大细胞数量或在不同实验中使用同一批
细胞。
8.细胞收获和分离：利用细胞收获试剂将细胞释放到培养基中。
成功
收获后，对细胞进行血清处理或其他方法进行分离和纯化。
细胞培养方法
细胞一细胞培养（一）原代培养○1胰蛋白酶消化法1.将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）2.吸去PBS液，将组织块移入15ml离心管中，加入组织块两倍体积预热至37℃的0.25%含EDTA的胰蛋白酶，在37℃水浴中作用20分钟，每隔五分钟摇晃一下3.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，将消化后的组织块用细胞筛过滤，取过滤液于离心管中，1000r/min离心5分钟4.离心后吸去上清液，加入5ml含10%胎牛血清和1%双抗的培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至约5×105个/ml，每个培养皿（6㎝培养皿）加入5ml含细胞的培养基，上下左右移动混匀5.放入37℃，5%CO2的培养箱中培养6.24h后，观察细胞贴壁情况，更换培养基，继续培养，2-3天更换一次培养基7.代细胞融合率达80%-90%时进行传代培养○2组织块法1. 将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）2.将组织块转移至培养皿中，每个组织块保持一定间距3.向培养皿中缓慢加入培养基至刚好没过组织块，小心放入37℃，5%CO2的培养箱中培养4.24h后，观察贴壁情况，并补加新培养基仪器：6㎝培养皿、弯头剪、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）（二）传代培养○1贴壁细胞1.先将含10%血清和1%双抗的培养基、0.25%EDTA-胰蛋白酶在37℃水浴锅中预热20min2.观察细胞融合率是否达到80%-90%3.将所需用品放入紫外照射30min的超净工作台中，物品放入前需用75%酒精擦拭或放入后立即用酒精擦拭4.吸去培养基，加入PBS冲洗两遍，洗去残留培养基，加入胰蛋白酶至刚好覆盖培养皿底 （6㎝培养皿约1ml），放入培养箱中消化0.5-2分钟5.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，轻轻吹打混匀，吸入离心管中，1000r/min离心5min6.离心后，小心吸去上清夜，加入5ml培养基轻轻吹打混匀，血细胞计数，调至5×105个/ml7.每个6㎝培养皿加入5ml含细胞的培养基，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养○2悬浮细胞1.将培养皿中的培养基吸至离心管中，1000r/min离心5分钟2.离心后吸去上清液，加入5ml培养基，轻轻吹打混匀，血细胞计数，调至5×105个/ml3.每个6㎝培养皿加入5ml含细胞的培养基，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养仪器：6㎝培养皿、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）（三）细胞冻存○1贴壁细胞冻存1.配置细胞冻存液2.吸去培养基，加入0.25%EDTA-胰蛋白酶刚好覆盖培养皿底，放入培养箱中消化0.5-2min3.消化后的细胞，转移至离心管中，1000r/min离心5min4．离心后，加入细胞冻存液与细胞混匀，细胞计数，调至5×106个/ml5.每个冻存管加入1.5ml，将冻存管放入程序性降温盒，-80℃过夜，转移至液氮中；若无程序性降温盒，则将冻存细胞依次放置4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，再转移至液氮中○2悬浮细胞冻存1.配置细胞冻存液2.将细胞转移至离心管中，1000r/min离心5min3．离心后，加入细胞冻存液与细胞混匀，细胞计数，调至5×106个/ml4.每个冻存管加入1.5ml，将冻存管放入程序性降温盒，-80℃过夜，转移至液氮中；若无程序性降温盒，则将冻存细胞依次放置4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，再转移至液氮中仪器：15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、倒置显微镜、程序性降温盒、液氮罐试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM（高糖）培养基、胎牛血清、二甲基亚砜（四）细胞复苏1.将冻存的细胞从液氮中小心取出，快速在37℃水浴锅中摇晃解冻，一般在1min内完成，若离水浴锅较远可将细胞放置在干冰上2.将冻存管内液体转移至离心管中，1000r/min离心5min3.去除上清液，加入培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至5×105个/ml4.每个6㎝培养皿加入5ml复苏后的细胞，放入37℃，5%CO2培养箱中培养仪器：6㎝培养皿、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）。
细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项
细胞培养的具体步骤和要求以及注意事项细胞培养是杂交瘤制备单克隆抗体过程中必不可少的实验操作，细胞培养是一个困难重重的事情，多少英雄都在细胞培养上自挂东南枝，本文就细胞培养的步骤及注意事项做一描述。
步骤一、复苏1. 把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。
液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。
2. 把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。
3. 把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。
吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。
4. 标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。
5. 3天换一次培养基。
二、传代1. 培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。
2. 把原有培养基吸掉。
3. 加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟。
4. 细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。
5. 用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。
6. 把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。
7. 倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。
8. 根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。
一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。
继续培养。
三、冻存把细胞消化下来并离心（同上）。
用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。
4℃ 30min，-20℃ 30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。
冻存液的配制： 70%的完全培养基+20�S+10%DMSO. DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。
注意事项严格无菌操作，多喷喷酒精，要是对灭菌的东西不放心，自己包自己送自己烘干。
不要和别人共用试剂耗材，自己准备一套。
有可能的话在拿到新细胞的时候做好支原体衣原体检测。
完整版细胞培养工作流程
细胞培养工作流程一、Vero细胞复苏流程1、准备1.1工作地点检查：检查台面、地面是否洁净,确认无不相关物品.1.2设施检查：确认空调、传递窗工作状态完好.1.3层流罩准备：开启层流罩,观察其运行是否正常,用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒.并运行30分钟后开始生产操作.1.4操作工具和试剂检查：检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密,是否在效期内.检查本次操作所用溶液/试剂瓶内是否有异物,瓶外表是否有裂纹,瓶塞是否松动,溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求.合格后用消毒剂擦拭外外表后拿入层流罩.复苏、换液用液体：MEM液、新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCC3溶液.1.5复苏用水准备：(1)融化种子用溶液：按1L/1支种子准备39±1C含0.1%新洁尔灭溶液.(2)百级内消毒种子用水：1L/1支种子准备36.5 ±C含0.1%新洁尔灭溶液.1.6操作人员进入层流罩：穿一层无菌连体服并戴无菌手套,静止5分钟前方可操作.1.7溶液使用前处理：辅助人员用止血钳夹酒精棉球点燃后消毒瓶塞外外表,旋转1周,操作人员将翻塞翻开,再用点燃的酒精棉球消毒瓶口及瓶塞.2、配液辅助人员将配制所需的液体按顺序翻开后放至盐水瓶架上,操作人员按配方加量用吸管依次吸取新生牛血清等溶液至MEM液中,每吸完一种液后辅助人员应立即用无菌翻塞将其盖紧,在其瓶身用记号笔注明用量、日期等.复苏液及生长液配完后辅助人员立即用无菌翻塞将其盖紧,充分混匀待用.辅助人员翻开混匀后的复苏液,放置盐水瓶架上.操作人员将培养瓶〔T175〕盖翻开,倾斜或直立放置酒精灯附近, 将复苏液用吸管吸取或直接倒入其中〔加量：0.3〜0.4 ml/cm2〕, 拧紧瓶盖并放在恒温室待用.3、种子支领依据种子库治理规定进行支领,依据生产指令按数量支领.本操作规格按复苏1支细胞种子到1个T75 cm2瓶规定各项操作.假设支领数量变化培养瓶面积按比例调整,后续操作各项用量按比例调整. 4、种子速溶种子库治理员从细胞库刚取出细胞种子时,在液氮罐颈部停留几秒,核对所支领的种子标签内容与细胞种子申领单上的内容是否一致.核对无误后,迅速全部浸入39±1C含0.1%新洁尔灭溶液〔1000ml /支种子〕,顺时针不停摇动直至融化,将每次的速融时间限制在1分钟内.然后用75%的酒精消毒容器外外表, 放置在传递窗内风淋2分钟.同时马上通知细胞区人员将种子从传递窗取走.迅速传递并浸入百级内36.5 ±.含0.1%新洁尔灭溶液中,百级内操作人员取出擦干.5、移种操作人员左手拿冻存管,右手翻开,用1ml的吸管将融化后细胞种子吸出,缓慢滴加到1个T75 cm2培养瓶中,拧紧瓶盖.6、培养辅助人员在培养瓶上注明细胞名称、批号、代次、复苏日期、瓶编号等信息后及时放置恒温室静置培养.24小时内〔细胞贴壁80%〕进行换液.7、清场将废液倒入下水道,废物、待清洗物品由传递窗传到粗洗间,层流罩内用75%酒精消毒,再用纯水清洁整个房间.8、复苏后观察第二天观察培养液颜色〔PH〕是否正常,在显微镜下观察细胞形态数量.9、换液换液前准备与复苏前相同. 观察培养液颜色是否正常, 有无漏液,看细胞是否生长良好. 用消毒剂擦拭外表后放入层流罩,操作人员进入层流罩换好无菌连体服后静止5分钟方可操作.辅助人员用酒精棉球外焰消毒瓶塞外外表,操作人员将翻塞翻开, 再用火焰消毒瓶口及瓶塞.操作人员右手拿住培养瓶底部,左手拧开瓶盖,轻轻翻转培养瓶使上清液沿其顶面流至废液缸.辅助人员翻开装生长液的瓶口,并将其在火焰外焰旋转1圈后,放置盐水瓶架上待用.操作人员将培养瓶盖拧松放置酒精灯附近,将生长液用吸管吸取或直接倒入其中〔加量：0.3〜0.4 ml/cm2〕.拧紧瓶口,平放到恒温室培养.最后按规定清场二、细胞传代流程1、准备1.1工作地点检查：检查台面、地面是否洁净,确认无不相关物品.1.2设施检查：确认空调、蠕动泵工作状态完好.1.3层流罩准备：开启层流罩,观察其运行是否正常,用消毒剂将台面、墙面、地面、保护帘及层流罩内设备进行清洁消毒.并运行30分钟后开始生产操作.1.4操作工具和试剂检查：检查本次操作所用灭菌物品外包装是否严密,是否在效期内.检查本次操作所用溶液/试剂瓶内是否有异物,瓶外表是否有裂纹,瓶塞是否松动,溶液名称、批号、数量、有效期是否符合要求.合格后用消毒剂擦拭外外表后拿入层流罩.细胞传代用液体：MEM液,新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCQ溶液、0.01MPBS溶液、细胞消化液〔含0.25%的胰蛋白酶溶液〕.2、传代1操作2.1配液向MEM中依次参加新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCQ.辅助人员盖紧瓶口,在瓶身用记号笔注明用量、日期等,混匀待用.本卷须知：无菌吸管不得碰触除尾部以外的任何地方,否那么弃用.2.2洗涤辅助人员将PBS翻开,用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用.操作人员将培养瓶翻开,将上清液沿培养瓶上外表倒至废液桶.然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶,倒入量：30ml/ T75 cm2瓶.〔加量：0.2〜0.4 ml/cm 2〕盖上盖子,PBS交由辅助人员盖紧塞子,标记用量、日期.操作人员将培养瓶前后左右晃动一次后倒掉PBS本卷须知：倒废液时注意不能污染瓶口.辅助人员将消化液瓶口翻开,将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用.同时将培养瓶盖子翻开交由操作人员.操作人员用吸管吸3ml细胞消化液到培养瓶底,(消化液加量：0.02~0.04 ml /cm2)盖好瓶盖.辅助人员将消化液盖好,标记用量、日期.操作人员翻转培养瓶,使细胞消化液铺满整个细胞面,静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶,使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中,盖紧瓶盖置36.5 土0.5恒温或室温继续作用5〜10分钟.本卷须知：细胞培养瓶开盖后最好要45.倾斜,操作完成后马上盖好盖子.室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液,预防细胞脱落.2.4悬液制备辅助人员将生长液翻开,用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用.操作人员将消化好的培养瓶翻开,用吸管吸10ml至T75 cm2瓶中,用吸管冲洗下细胞,吹打分散,制成均匀的细胞悬液.本卷须知：分散细胞要充分,肉眼观察细胞无团块方可.2.5分种操作人员将细胞悬液平均分种至2个T175 cm2培养瓶中,,加生长液至75ml.2.6培养辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在2个T175 cm2细胞培养瓶上,将接种细胞的培养瓶放置恒温室静置培养.2.7清场按规定清场2.8观察每天观察细胞生长状态3、传代2操作3.1配液向MEM中依次参加新生牛血清、3%谷氨酰胺溶液、庆大霉素、7.5%NaHCQ.辅助人员盖紧瓶口,在瓶身用记号笔注明用量、日期等,混匀待用.本卷须知：无菌吸管不得碰触除尾部以外的任何地方,否那么弃用.辅助人员将PBS翻开,用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用.操作人员将培养瓶翻开,将上清液沿培养瓶上外表倒至废液桶.然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶,倒入量：60ml/ T175 cm 2瓶.〔加量:0.2〜0.4 ml/cm 2〕盖上盖子,PBS交由辅助人员盖紧塞子,标记用量、日期.操作人员将培养瓶前后左右晃动一次后倒掉PBS本卷须知：倒废液时注意不能污染瓶口.3.3消化辅助人员将消化液瓶口翻开,将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用.同时将培养瓶盖子翻开交由操作人员.操作人员用吸管吸7ml细胞消化液到培养瓶底,〔消化液加量：0.02~0.04 ml /cm2〕盖好瓶盖.辅助人员将消化液盖好,标记用量、日期.操作人员翻转培养瓶,使细胞消化液铺满整个细胞面,静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶,使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中,盖紧瓶盖置36.5 土0.5恒温或室温继续作用5〜10分钟.本卷须知：细胞培养瓶开盖后最好要45.倾斜,操作完成后马上盖好盖子.室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液,预防细胞脱落.3.4悬液制备辅助人员将生长液翻开,用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用.操作人员将消化好的培养瓶打开,将生长液直接倒入至T175 cm2瓶中,每瓶倒入量：75ml,用吸管冲洗下细胞,吹打分散, 制成均匀的细胞悬液.本卷须知：分散细胞要充分,肉眼观察细胞无团块方可.3.5分种操作人员将细胞悬液平均分种至8个T175 cm2培养瓶中,加生长液至75ml.3.6培养辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在细胞培养瓶上,将接种细胞的培养瓶放置恒温室静置培养.3.7清场按规定清场3.8观察每天观察细胞生长状态4、传代3操作4.1配液辅助人员先用酒精棉球外焰消毒MEM桶口,拧松桶盖,操作人员解开线绳将外包装纸向外翻至露出传液瓶塞顶部位置右手拿住链接空气过滤器及出液口管道,左手将包装袋松动,一次性取出管道并放入MEM桶中,辅助人员需要将点燃的酒精棉球一直放在桶口附近创造无菌环境.辅助人员将所需溶液依次翻开,操作人员用配液直管将溶液吸入MEM桶内,加完后混匀待用.然后拔掉直管,将带细胞工厂接头的不锈钢管道与之相连,待用.本卷须知：无菌吸管使用过程中禁止接触其他部位〔除吸管后端的任何位置〕,如不慎碰到应立即废弃.安装管道过程中,如管道不慎碰到其他部位应立即废弃.4.2洗涤辅助人员将PBS翻开,用酒精灯将瓶口消毒后放到盐水瓶架上待用.操作人员将培养瓶翻开,将上清液沿培养瓶上外表倒至废液桶.然后在酒精灯旁将PBS倒入培养瓶,倒入量：60ml/ T175 cm 2瓶.〔加量:0.2〜0.4 ml/cm 2〕盖上盖子,PBS交由辅助人员盖紧塞子,标记用量、日期.操作人员将培养瓶前后左右晃动一次后倒掉PBS本卷须知：倒废液时注意不能污染瓶口.4.3消化辅助人员将消化液瓶口翻开,将瓶口用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用.同时将培养瓶盖子翻开交由操作人员.操作人员用吸管吸7ml细胞消化液到培养瓶底,〔消化液加量：0.02~0.04 ml /cm2〕盖好瓶盖.辅助人员将消化液盖好,标记用量、日期.操作人员翻转培养瓶,使细胞消化液铺满整个细胞面,静置待细胞间质疏松后翻转培养瓶,使消化液盐沿培养瓶上面倒入废液缸中,盖紧瓶盖置36.5 土0.5恒温或室温继续作用5〜10分钟.本卷须知：细胞培养瓶开盖后最好要45.倾斜,操作完成后马上盖好盖子.室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液,预防细胞脱落.4.4悬液制备辅助人员将生长液翻开,用火焰消毒后放到盐水瓶架上待用.操作人员将消化好的培养瓶打开,将生长液直接倒入至T175 cm2瓶中,每瓶倒入量：75ml,用吸管冲洗下细胞,吹打分散, 制成均匀的细胞悬液.然后将8个培养瓶的细胞合并到1个T175 cm2瓶中.用传液管道吸入MEM中,混匀待用.本卷须知：分散细胞要充分,肉眼观察细胞无团块方可.4.5分种辅助人员将10层细胞工厂盖子翻开,操作人员将连接管道出液口处的细胞工厂转接头无菌取出后与细胞工厂左端口对接,并将细胞工厂横放在操作台上,同时将细胞工厂右端的盖拧松.辅助人员真空泵打气端与管道空气滤器相连,开启真空泵将生长液打入细胞工厂内.结束后,操作人员用止血钳将管道夹紧后将细胞工厂右端的盖拧紧,平衡后把细胞工厂向上直立,再取下左端的连接细胞工厂管道的转接头交辅助人员,用盖子盖紧右侧的细胞工厂接口,将细胞工厂放平.然后将管道内残夜打入准备好的T25 cm2培养瓶中作对照.本卷须知：注意打气过程中管道不要崩开.4.6培养辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在细胞工厂上,放置到恒温室静置培养.4.7清场4.8观察5、传代4操作5.1配液辅助人员先用酒精棉球外焰消毒MEM桶口,拧松桶盖,操作人员解开线绳将外包装纸向外翻至露出传液瓶塞顶部位置右手拿住链接空气过滤器及出液口管道,左手将包装袋松动,一次性取出管道并放入MEM桶中,辅助人员需要将点燃的酒精棉球一直放在桶口附近创造无菌环境.辅助人员将所需溶液依次翻开,操作人员用配液直管将溶液吸入MEM桶内,加完后混匀待用.然后拔掉直管,将带细胞工厂接头的不锈钢管道与之相连,待用.本卷须知：操作人员取管道时连接MEM液桶内管道不能碰到包装纸外部,将管道放入MEM液桶内时,伸入桶内管道不能碰到MEM液桶外部,否那么此管道停止使用.5.2洗涤辅助人员将PBS翻开,用火焰消毒瓶口,放到盐水瓶架上待用. 操作人员将细胞工厂内上清倒入废液桶,然后将细胞工厂平放在桌面上,倒入PB§参加量：1L/CF10(0.2〜0.4ml/cm 2),盖上盖子,平衡PBS液后放平,前后左右摇晃几次,倒掉.本卷须知：千万不能污染细胞工厂瓶口5.3消化辅助人员翻开消化液瓶口,用火焰消毒后放在盐水瓶架上待用.操作人员将细胞工厂平放在桌面上,倒入消化液,参加量：200ml/CF10(0.02~0.04 ml/cm 2).平衡后放平,摇晃细胞工厂,使消化液铺满整个细胞面,带细胞间质疏松后倒掉,盖好盖子放到恒温室5-10分钟.本卷须知：室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液,预防细胞脱落.5.4悬液制备当细胞开始脱落时,将细胞工厂竖立在台面上,把连接生长液桶的细胞工厂接头与细胞工厂相连,拧松右侧盖子,放到细胞工厂,开启真空泵,打入1L生长液停止.盖好盖子,辅助人员双手握住细胞工厂,上下小幅度快速震荡,使细胞充分分散.然后连接生长液,将细胞悬液打入生长液桶内,混匀待用.本卷须知：摇细胞工厂时要快速有力度,使细胞充分分散.5.5分种将细胞悬液分4份均匀打入4个10层细胞工厂,并将残液打入培养瓶中作对照.5.6培养辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在细胞工厂上,放置到恒温室静置培养.5.7清场5.8观察6、传代5操作6.1配液辅助人员先用酒精棉球外焰消毒MEM桶口,拧松桶盖,操作人员解开线绳将外包装纸向外翻至露出传液瓶塞顶部位置右手拿住链接空气过滤器及出液口管道,左手将包装袋松动,一次性取出管道并放入MEM桶中,辅助人员需要将点燃的酒精棉球一直放在桶口附近创造无菌环境.PBS 消化液管道均按此方法安装.辅助人员将所需溶液依次翻开,操作人员用配液直管将溶液吸入MEM桶内,加完后混匀待用.然后拔掉直管,将带细胞工厂接头的不锈钢管道与之相连,待用.本卷须知：操作人员取管道时连接桶内管道不能碰到包装纸外部,将管道放入桶内时, 伸入桶内管道不能碰到桶外部,否那么此管道停止使用.6.2洗涤辅助人员将细胞工厂上清倒入废液桶,交由操作人员与PBS管道相连,用真空泵打入1L PBS溶液,盖好盖子,摇晃几次后倒掉.本卷须知：千万不能污染细胞工厂瓶口6.3消化辅助人员翻开消化液瓶口,用火焰消毒后放在盐水瓶架上待用.操作人员将细胞工厂平放在桌面上,倒入消化液,参加量：200ml/CF10(0.02~0.04 ml/cm 2).平衡后放平,摇晃细胞工厂,使消化液铺满整个细胞面,带细胞间质疏松后倒掉,盖好盖子放到恒温室5-10分钟.本卷须知：室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉消化液,预防细胞脱落.6.4悬液制备当细胞开始脱落时,将细胞工厂竖立在台面上,把连接生长液桶的细胞工厂接头与细胞工厂相连,拧松右侧盖子,放到细胞工厂,开启真空泵,打入1L生长液停止.盖好盖子,辅助人员双手握住细胞工厂,上下小幅度快速震荡,使细胞充分分散.然后连接生长液,将细胞悬液打入生长液桶内,混匀待用.本卷须知：摇细胞工厂时要快速有力度,使细胞充分分散.5.5分种将细胞悬液打入4个10层细胞工厂和3个40层细胞工厂,并将残液打入培养瓶中作对照.5.6培养辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在细胞工厂上,放置到恒温室静置培养.5.7清场5.8观察7、传代6操作7.1配液辅助人员先用酒精棉球外焰消毒MEM桶口,拧松桶盖,操作人员解开线绳将外包装纸向外翻至露出传液瓶塞顶部位置右手拿住链接空气过滤器及出液口管道,左手将包装袋松动,一次性取出管道并放入MEM桶中,辅助人员需要将点燃的酒精棉球一直放在桶口附近创造无菌环境.PBS 消化液管道均按此方法安装.辅助人员将所需溶液依次翻开,操作人员用配液直管将溶液吸入MEM桶内,加完后混匀待用.然后拔掉直管,将带细胞工厂接头的不锈钢管道与之相连,待用.本卷须知：操作人员取管道时连接桶内管道不能碰到包装纸外部,将管道放入桶内时, 伸入桶内管道不能碰到桶外部,否那么此管道停止使用.6.2洗涤辅助人员将细胞工厂上清倒入废液桶,交由操作人员与PBS管道相连,用真空泵打入4L PBS溶液,盖好盖子,摇晃几次后倒掉.本卷须知：千万不能污染细胞工厂瓶口6.3消化将细胞工厂与消化液管道相连,打入消化液,平衡后放平,摇晃细胞工厂,使消化液铺满整个细胞面,带细胞间质疏松后倒掉,盖好盖子放到恒温室5-10分钟.本卷须知：室温消化细胞时肉眼观察细胞面呈针眼状时应倒掉细胞消化液,预防细胞脱落.6.4悬液制备当细胞开始脱落时,将细胞工厂竖立在台面上, 把连接生长液桶的细胞工厂接头与细胞工厂相连,拧松右侧盖子,放到细胞工厂,开启真空泵,40层细胞工厂打入4L生长液停止. 盖好盖子,辅助人员先摇晃几次,将细胞冲洗下来.然后将悬液集中到顶部,双手握住细胞工厂快速摇晃,放倒后再来一次,使细胞充分分散.然后连接生长液,将细胞悬液打入生长液桶内,混匀待用.本卷须知：摇细胞工厂时要快速有力度,使细胞充分分散.5.5分种将细胞悬液打入4个10层细胞工厂和11个40层细胞工厂,并将残液打入培养瓶中作对照.5.6培养辅助人员将细胞的批号、代次、传代比例、瓶编号、日期标记在细胞工厂上,放置到恒温室静置培养.5.7清场5.8观察。
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细胞培养实验步骤大全(精华版)
细胞培养是生物学研究中常用的技术，在许多实验室中都扮演
着重要角色。
下面是细胞培养的一般步骤，供参考。
材料准备
1. 细胞培养基：根据实验需求选择适当的培养基，如DMEM、RPMI 1640等。
2. 细胞培养器具：培养皿、离心管、移液器等。
3. 细胞培养室：确保环境清洁、无菌。
细胞准备
1. 细胞来源：选择要培养的细胞系或原代细胞。
2. 细胞传代：如果使用的是细胞系，根据需要进行传代，确保
细胞状态良好。
细胞培养
1. 细胞计数：使用显微镜和细胞计数仪等工具，准确计算细胞
数目。
2. 细胞接种：按照实验要求，在含有培养基的培养皿中接种适
量的细胞。
根据细胞类型的不同，可能需要预先涂覆培养皿。
3. 细胞培养条件：根据细胞类型的要求，提供适宜的培养条件，如温度、湿度和CO2浓度等。
4. 培养培养：定期更换培养基，保持细胞处于良好的生长状态。
5. 细胞观察：使用显微镜观察细胞形态和生长情况，检测是否
存在异常。
细胞处理
1. 细胞传代：根据细胞数量和状态，决定是否进行细胞传代。
传代可以延续细胞的寿命和维持细胞应答。
2. 细胞刺激：根据实验设计，给予细胞适当的刺激，如添加药物、因子或介质等。
3. 细胞采集：当需要获取细胞样本时，使用细胞剥离剂或胰蛋
白酶等方法将细胞从培养皿中采集。
4. 细胞冻存：如果需要长期保存细胞，可以使用液氮冷冻保存
的方法。
先加入冻存液，然后将细胞在适当条件下冷冻保存。
以上是细胞培养的一般步骤，根据具体实验和细胞类型，步骤可能会有所调整和细化。
在进行细胞培养实验时，请始终注意无菌操作和合理使用实验工具，以确保实验结果的准确性和可靠性。