生物化学检验常用技术(共66张PPT)

4、Lambert-Beer定律的偏离现象
单色光 均匀介质 吸收物质无相 互作用
5、空白溶液的选择
在分光光度法中，为消除显色剂及样品中各种共存有色物质产生的干扰、抵消比色皿和 试剂对入射光的影响而用来调节仪器百分透光率为100%的溶液。
不
蒸 馏 水
试
样
含 待
剂
品
测
元
不
显 色
素
1、溶剂空白：不加样品和任何试剂，用纯溶剂（如蒸馏水或其他有机溶剂）作参比溶液。 选择原则：当显色剂及其它试剂均无色，被测试样中又无其他有色离子时，选用溶剂参比。
常用的固定化技术有：吸附、试剂交联、共价键合、
包埋法(酶与载体聚丙酰胺混合后直接包在电极 敏感部分形成酶凝胶层)。
几种酶电极的品种与性能
测定物质
酶
检测物 测定范围(mol/L)
葡萄糖 葡萄糖氧化酶
尿素(脲)
脲酶
胆固醇 胆固醇氧化酶
L－谷氨酸 谷氨酸脱氢酶 L－赖氨酸 赖氨酸脱羧酶
O2 NH3 H2O2 NH4+ CO2
单色器
滤光片
棱镜
光栅
吸收池
检测器
玻璃比色皿
石英比色皿
显示器
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(一)、分光光度技术的基本原理
1、吸光度与透光度
当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部分光 被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透 光度，即：
入射光 I0
透射光 I
T = I/I0
10-4～2*10-2 10-5～10-2 10-5～10-2 10-4～10-1 10-4～10-1
离子选择性电极的分析方法
1、直接法： 样品不经稀释，直接由电极测量离子活度。
①标准曲线法
用测定离子的纯物质配制一系列已知活度或浓度的标准溶液，用离子计测定，绘制电极电位与 活度对数的关系曲线；然后在相同条件下测定样品，由标准曲线查得浓度。
离子选择性电极：电位法测定溶液中某种定离子活度的指示电极；能在多种离子存在的 混合液中，选择性地响应该特定离子，指示出这种离子活度变化情况，测定离子的活度 或浓度。
电位分析法的特点：
① 选择性好 在多数情况下，共存的离子干扰小，对组成复杂的试样往往不需要 分离处理就可直接测定。
② 灵敏度高 电位法的检出限为10-5～10-8 mol/L，适于微量组分的测定，电位滴
第三章
生物化学检验常用技术
基 因 扩 增 技 术
电 泳 分 析 技 术
干 化 学 分 析 技 术
电 化 学 分 析 技 术
光 谱 分 析 技
第一节 光谱分析技术
吸收光谱分析技术
发射光谱分析技术
散射光谱分析技术
一、吸收光谱分析法
光源
钨灯、卤钨灯 350～1000 氢灯、氘灯 180～360
0.575
脲酶催化分解尿素产生NH3、CO2，溶于水 可得到不同产物NH3、CO2、NH4+、HCO3-
等，可用相应的离子选择性电极来检测它们，间 接得到尿素的含量。
酶的催化反应专一强；酶电极有极高的选择性。作为一种生物传感器，酶电极特别适用于生物医学、生物化学等领域。
酶电极的制作过程
①选择适合的指示电极 ②制成具有催化活性的水不溶性酶膜 ③把酶膜固定在电极的表面(酶的固定化)
SO2 + H2O === HSO3- + H+
（Reporter，R）
(五) 等电聚焦电泳 (IEF)
●这里所说的电导是指电解质溶液中正、负离子在外电场作用下的迁移而产生的电流传导
电泳仪:可以实现电泳分离技术的仪器
使PCR反应中产生的荧光信号与PCR产物量成正比，
离子选择性电极的类型和品种很多，外形也差异很大；
度成正比关系。配制一系列浓度的标准品溶液（浓度应包含高、 中、低浓度范围），按标本处理方法作相同处理，在特定波长
下测定吸光度，以标准液浓度为横座标，以吸光度为纵座标， 将对应各点连成一条通过原点的直线，这条直线称为标准曲 线。待测溶液测定吸光度后，从标准曲线上可查出其相应的 浓度。
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5.标准溶液设置的浓度范围足够大。
散射光谱分析法
利用悬浮颗粒混浊液的散射光强度或对入射光减弱的原理进行定量分析的方法。
透射比浊与散射比浊是免疫比浊的常见的两种方法，其反应的原理一样，只是检测的光信号与仪器的检
测器有区别。
1、透射比浊操作简便，适用于普通的自动生化分析仪和普通的分光光度计，几乎所有的实 验室均能开展。不足的是灵敏度和精密度均不够理想，所需的抗血清量大，检测的周期较长。
2、试样的种类和组成
3、试液中共存离子对测定有影响 4、仪器的质量
（二）、荧光分光光度法
荧光的定义：
某些物质受紫外光或可见光照射激发 后能发射出比激发光波长较长的光。
荧光产生的原理：
化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学 能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态 时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发 光）。
电极电位测量
参比电极
而另一个电极，其电位不受 试液组成变化的影响，具有较 恒定的数值，只是作为测量电
位的标准，称为参比电极(参
考电极)。
指示电极Байду номын сангаас
在电位分析中，构成电池的两个 电极，其中一个，其电位值随待 测离子浓(活)度的变化而变化，能 指示待测离子的浓(活)度，称为 指示电极，或离子选择性电极。
HF + H2O === H3O+ + F-
凡是溶于水释放H+的反应，都可以用pH玻璃电极检出；而后 三种分别可以用S2-、CN-、F-等离子选择性电极来检测。
酶电极
将生物酶涂布在离子选择性电极或其它传感器的敏感膜上，通过酶催化作用，使待 测物质产生能在该电极上响应的离子或化合物，间接测定该物质。
定法适于常量分析。
③ 快速 仪器设备简单、操作方便、分析快速、测定范围宽、不破坏试液，易于实 现分析自动化。
④ 缺点 需要有专用的离子选择性电极。
常用的离子选择电极
根据国际纯粹及应用化学联合会(IUPAC)的建议，离子选择性电极一
般采用如下分类：
玻璃膜电极
气敏电极
气敏电极是一种气体传感器，测定溶液中的气体含量。
用pH玻璃电极间接测定CO2的含量
在气敏电极的中介溶液中放入玻璃 电极。测量时，控制试液的酸碱度， 使CO2通过气透膜扩散加入气敏电极； 引起中介溶液pH的改变。测定中介 溶液的pH值，即可计算出试液中CO2
的浓度。
气敏电极通过界面发生化学反应进行工
作的，离子电极用来指示中介液中某一离 子活度的变化。溶解在水溶液中的气体， 只要能生成可用离子选择性电极检出的离 子，均可用气敏电极测定。
选择原则：当显色剂和被测试样均有颜色时，可选用此法。
(二)、分光光度法在生化检验中的应用
灵敏度高、操作简便、应用广泛
1、对未知化合物进行定性分析
定性依据：
最大吸收波长λmax和摩尔吸光系数ε
2、对待测物质进行定量测定
标准曲线法和比较法
(1).标准曲线法
方法：
根据Lambert-Beer定律，液体的浓度在一定范围内与吸光
原理：利用待测气体对某一化学平衡的影响，使平衡中某特定离子的活度发生变
化，来测定试液中被测气体的分压(含量)。
如，二氧化碳气敏电极：微孔气体渗透膜憎水但能透气(由醋酸纤维、聚四氟乙烯、聚偏 氟乙烯等材料制成)。测定时，CO2气体通过微孔渗透膜与中介溶液接触(中介液是的NaHCO3)； 由于CO2与H2O结合生成碳酸，从而影响到碳酸氢钠的电离平衡。
测定该物质。
利用电解质溶液的电导值来确定物质含量的分析方法
用测定离子的纯物质配制一系列已知活度或浓度的标准溶液，用离子计测定，绘制电极电位与活度对数的关系曲线；
实现了PCR技术从定性到定量的飞跃。 钨灯、卤钨灯 350～1000
H2S + H2O === HS- + H3O+
CR=(AR ×Cs)/As
2、散射比浊的优点是灵敏度、精密度均较高，检测快速。其缺点是需特定的分析仪器，试剂价格高。
第二节 电化学分析技术
一、电位分析法― ISE
电位分析法 利用电极电位与浓度的关系测定物质含量的电化学分析方法。
离子选择电极 ISE
一类用特殊敏感膜制成，对溶液中某种特定离子有选择性响应的电化学传感器
电解质溶液中参与电化学反应的离子的有效浓度
C 为溶液浓度
L
Lambert-Beer定律适用于可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体
Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层 厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。
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3、Lambert-Beer定律的应用条件
Lambert-Beer定律适用于: 可见光、紫外光、红外光和均匀非散射的液体 以及分散均匀的固态或气态样品.
荧光分光光度法
利用物质吸收较短波长的光能后发射较长波 长特征光谱的性质，对物质定性或定量分析 的方法。
分析测定蛋白质、核酸、维生素等; 对某些激素及其代谢产物的测定;
当化合物含量太少,一般分析方法灵敏度不够时,使用荧光分析技术就能解决测定问题。
三、散射光谱分析法
光的散射
用单色光照射透明溶液时，大部分按原来方向透射， 而一小部分则按不同的角度散射开来。
ISE基本结构
离子选择性电极的类型和品种很多，外形也 差异很大；但基本结构都包括：对特定离子有 选择性响应的薄膜(敏感膜或传感膜)、内参比溶 液与内参比电极。
敏感膜将内侧参比溶液与外侧的待测离子 溶液分开，是电极的关键部位。
内参比电极 电极壳体 内参比溶液 敏感膜
离子选择性电极 结构示意图
电极电位
以消除操作过程中引入干扰杂质所带来的误差。
选择原则：当操作过程中由于试剂、器皿、水和气等因素引入了一定量的被测试样组分的干扰离子
5、不显色空白：可将一份试样加入适当的掩蔽剂，将被测组分掩蔽起来，使之不再与显色剂作用，而显色剂 和其它试剂均按照操作手续加入，以此作为参比溶液，这样可以消除显色剂和一些共存组分的干扰。
火焰光度法
荧光光度法
（一）、火焰光度法
火焰光度法是以火焰为激发光源，用光电检测系统测量被测元素所 发射的辐射强度来进行定量分析的方法。
它是一种简化的发射光谱分析法
FP640火焰光度计
火焰光度法分析示意图
火焰光度法的特点
①快速
试样溶液于数分钟内可完成测定
②准确
火焰光源稳定性高，干扰少，误差为2％~5％， 可用于微量分析和常量分析
③灵敏
分析碱金属与碱土金属，绝对灵敏度可达0．1～
10×10－6 g
④设备简单
被测试样易被火焰激发，产生的谱线较简单，且均在可 见光区，故使谱线分离和测量的设备简单
⑤应用范围窄
主要用于碱金属和部分碱土金属的测定
影响火焰光度分析的因素
1、激发条件
火焰温度要适当，温度过低灵敏度下降，温度太高则 碱金属电离严重，影响测量的线性关系。
2、试剂空白：用不加样品，而显色剂和其他试剂都相同的溶液作参比溶液。 选择原则：当显色剂本身有颜色或其它试剂有颜色，被测试样中又无其他有色离子时，选用试剂参比。
3、样品空白：用不加显色剂的样品溶液作参比溶液。 选择原则：当试样溶液有颜色，而试剂、显色剂均无颜色时，选用样品空白。
4、平行操作空白：按样品分析完全相同的操作步骤，用不含待测元素的样品进行平行操作，
T×100%为T%称为百分透光度。透光度的负对数称为吸光度即：
A = -lgT = -lgI/I0 = lgI0/I
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2、Lambert-Beer定律
当一束平行单色光通过均匀的非散射样品时，吸光度与溶液层厚度和溶液浓度成 正比。
A = KLC
A 为吸光度；
K 为比例常数，称为吸光系数；
L 为溶液层厚度，称为光径；
可用电极测定的气体
CO2 + H2O === HCO3- + H+
NH3 + H2O === NH4+ + OH-
SO2 + H2O === HSO3- + H+ 2NO2 + H2O === NO3- + NO2- + H+ H2S + H2O === HS- + H3O+
HCN + H2O === H3O+ + CN-
2．比较法
己知浓度的标准品和标本作同样处理，使用相同的空白，同时测定标准
管和标本的吸光度，根据测定的吸光度及标准品浓度，可直接计算出标本的浓
没有扩增反应度时探，针计保算持完公整式， 为：
将生物酶涂布在离子选择性电极或其它传感器的敏感膜上，通过酶催化作用，使待测物质产生能在该电极上响应的离子或化合物，间接
分子颗粒的电泳迁移在一定时间后达到稳态
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二、发射光谱分析法
处于激发态的待测元素，原子回到基态时以辐射的形
式释放出能量，由此而产生的光谱称为发射光谱，对元 素进行定性与定量分析的方法。
发射光谱是指样品本身产生的光谱被检测器接收；吸 收光谱是光源发射的光谱被样品吸收了一部分，剩下
的那部分光谱被检测器接收。